技术领域
[0001] 本
发明涉及一种二硝基甲苯磺酸钠降解菌及其筛选方法与应用，属于
微生物技术领域。
背景技术
[0002] TNT生产过程中所产生的
废水为深红色、不透明，
色度和COD值高，被称为“红水”。红水的主要有机成分为2,4-二硝基-3-磺酸钠和2,4-二硝基-5-磺酸钠，它们的
水溶性远好于TNT，性质稳定，具有潜在的致癌致畸
风险，直接排放会对
土壤、水源产生极大的危害。虽然目前国家对火炸药生产企业的污染
整治政策日趋严格，但早期遗留的尤其是红水造成的
土壤污染问题仍有待解决。目前针对红水的处理可分为物理法、化学法、生物法三种，其中物理法包括浓缩主要有浓缩
蒸发法、
吸附法、减压蒸馏法、絮凝沉淀法等；化学法主要包括浓缩焚烧法、湿式
氧化法、
超临界水氧化法、光催化氧化法、臭氧氧化法、电化学法等。但以上方法大多都存在效率低、成本高、受到设备和运行规模限制、或产生二次污染物等问题，尤其对大面积被红水污染的土壤尚未有有效的修复方法。
[0003] 用
微生物处理TNT红水污染物是一种成本低、安全性好、可同时除去多种污染成分的方法。已经实现的如利用兼性厌气处理池、氧化塘、固定化微
生物膜反应器等来处理TNT废水效果良好，且投资少、操作简单、易于管理，但也存在效率低、处理周期长的问题。已被报道的能有效降解TNT或TNT废水污染物的微生物有白腐
真菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、伯克霍尔德氏菌、噬氢菌、微小杆菌、固氮螺菌、根瘤菌、
铁还原菌、无色杆菌、分枝杆菌、鞘
氨醇杆菌、假单胞菌、芽孢杆菌等。但是目前已报道的应用于TNT红水治理研究的微生物能降解的底物绝大多数是TNT本身和TNT脱去一个硝基生成的二硝基甲苯，尚未有专
门以二硝基甲苯磺酸钠为底物进行的筛选和相应抗性微生物对二硝基甲苯磺酸钠的降解效率实验。
发明内容
[0004] 为解决红水不合理排放造成的大面积土壤污染问题，本发明提供了一种新的微生物种质资源，获得了一种能够有效降解TNT红水中的主要污染物-二硝基甲苯磺酸钠的微生物。
[0005] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0006] 本发明公开了一种TNT次级污染物二硝基甲苯磺酸钠的降解菌，二硝基甲苯磺酸钠降解菌，经鉴定为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)，2018年7月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.16147。
[0007] 所述二硝基甲苯磺酸钠降解菌能以二硝基甲苯磺酸钠为唯一氮源生长。
[0008] 上述二硝基甲苯磺酸钠降解菌的筛选方法如下：
[0009] 1)将被TNT红水污染的土壤在无机盐培养基中，30℃下摇床培养36-48h，获得培养物；
[0010] 2)将培养物按比例转移到含有底物的无机盐培养基中，30℃摇床培养12-24h，获得悬浊液；
[0011] 3)将悬浊液按比例转移到含有底物、
葡萄糖以及
氯化铵的无机盐培养基中，30℃摇床培养7d；
[0012] 4)然后按步骤3)所述的培养条件进行继代培养，逐渐提高无机盐培养基
中底物的初始浓度，取每个继代周期的培养液分别按梯度稀释后涂布于含有相应底物浓度的LB或无机盐固体培养基中，30℃培养获得二硝基甲苯磺酸钠降解菌；步骤2)-4)中所述底物为被TNT红水污染的土壤的水相浸提物。
[0013] 进一步地限定，步骤1)所述的无机盐培养基成分为：Na2HPO4·12H2O 3.8g/L、KH2PO41g/L、NaCl 1g/L、MgSO4 0.2g/L，其余为水，所述各成分浓度为终浓度。
[0014] 进一步地限定，步骤1)将被TNT红水污染的土壤按照1:10的
质量/体积比加入到无机盐培养基中。
[0015] 进一步地限定，步骤2)所述培养物按照1:1的体积比加入到含有1/10体积浓度LB培养基，20mg/L底物的无机盐培养基中。
[0016] 进一步地限定，步骤3)所述悬浊液按照1:9的体积比加入到含有50mg/L底物、20g/L葡萄糖和200mg/L NH4Cl的无机盐培养基中。
[0017] 进一步地限定，步骤4)所述30℃培养获得二硝基甲苯磺酸钠降解菌后，挑取各培养周期获得的菌落，于含有相应底物浓度的LB平板或无机盐平板上进行划线培养至菌落形态单一，获得二硝基甲苯磺酸钠降解菌。
[0018] 更进一步地限定，步骤4)所述每个继代培养周期中无机盐培养基中的底物浓度依次：100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L，即在第一次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为100mg/L，第二次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为200mg/L，第三次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为300mg/L，第四次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为500mg/L。上述在无机盐培养基中添加的底物浓度均为初始浓度。
[0019] 本发明所述菌株的形态学及生理生化学特征如下：
[0020] 该降解菌在不含底物的LB平板或含有二硝基甲苯磺酸钠的无机盐平板上菌落呈圆形，乳白至淡黄色，扁平，表面光滑湿润。革兰氏
染色：阴性；镜检形态：细长杆状、无鞭毛、无芽孢；需氧方式：好氧；营养方式：化能异养。
[0021] 本发明所述的降解菌可用于降解二硝基甲苯磺酸钠。
[0022] 有益效果
[0023] 二硝基甲苯磺酸钠是比TNT本身更稳定更难降解的红水污染物，本发明提供的二硝基甲苯磺酸钠降解菌，能够有效降解TNT红水中的主要污染物-二硝基甲苯磺酸钠，能以二硝基甲苯磺酸钠为唯一氮源生长，OD600≈0.25的菌悬液能使初始浓度为40mg/L的二硝基甲苯磺酸钠在3天后的降解除去率为8.5％，本发明为治理被TNT红水污染的土壤提供了一种新的微生物种质资源。
附图说明
[0024] 图1为二硝基甲苯磺酸钠降解菌的镜检形态照片。
[0025] 图2为二硝基甲苯磺酸钠降解菌在以二硝基甲苯磺酸钠为唯一氮源的无机盐平板上生长，左图为JM109(DE3)，右图为本发明筛选获得的二硝基甲苯磺酸钠降解菌。
[0026] 图3为二硝基甲苯磺酸钠降解菌对二硝基甲苯磺酸钠的降解率实验结果，横坐标为不同质量浓度的氯化铵含量，纵坐标为二硝基甲苯磺酸钠峰面积，对照为不加菌的处理。
具体实施方式
[0027] 下面通过具体
实施例对本发明做进一步详述，本发明旨在从被TNT红水污染的土壤中筛选出能够有效降解二硝基甲苯磺酸钠的细菌菌种。
[0028] 本发明中用于制作二硝基甲苯磺酸钠标准曲线的标准品购自SYNCHEM，用于筛选和降解实验的底物均为污染土壤的水相浸提物，其中二硝基甲苯磺酸盐钠的浓度根据标准曲线进行标定。其它
试剂均为市售分析纯生化试剂，所使用的仪器主要是超净
工作台、恒温摇床和恒温
培养箱，所述摇床培养的转速为200r/min。
[0029] LB培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，
酵母粉5g/L，121℃灭菌20min。
[0030] 无机盐培养基：Na2HPO4·12H2O 3.8g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 1g/L，121℃灭菌20min，加入过滤除菌的MgSO4母液至MgSO4终浓度为0.2g/L。固体无机盐培养基另加入20g/L琼脂。
[0031] 实施例1.二硝基甲苯磺酸钠降解菌的筛选。
[0032] 筛选方法：
[0033] 1)在甘肃军工厂附近采集被TNT红水污染的土壤，在含有1/10体积浓度LB培养基的50mL无机盐培养基中加入5g土壤样品，30℃摇床培养48h，获得培养物；
[0034] 2)转移25mL上述培养物到新的含有1/10体积浓度LB培养基和10μL底物(终浓度为20mg/L)的25mL无机盐培养基中，30℃摇床培养24h，获得悬浊液；
[0035] 3)取步骤3)中5mL悬浊液加入到45mL底物浓度为50mg/L、含有20g/L葡萄糖和200mg/L NH4Cl的无机盐培养基中，30℃摇床培养7d。
[0036] 4)以7d为一个周期进行继代培养，底物浓度逐渐提高：100mg/L，200mg/L，300mg/L，500mg/L，即在第一次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为100mg/L，第二次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为200mg/L，第三次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为300mg/L，第四次继代培养中，无机盐培养基中的底物浓度为500mg/L，上述在无机盐培养基中添加的底物浓度均为初始浓度。取每个周期的培养液梯度稀释后涂布相应底物浓度的LB平板或无机盐平板，30℃培养至有菌落长出。挑取不同形态的菌落在含有相应底物浓度的LB平板或无机盐平板上划线纯化，直至得到形态单一的单菌落，获得二硝基甲苯磺酸钠降解菌，该二硝基甲苯磺酸钠降解菌的镜检形态如附图1所示，为细长杆状、无鞭毛、无芽孢。
[0037] 所述底物为被TNT红水污染的土壤的水相浸提物，通过如下方法获得：取250g被TNT红水污染的土壤加入500mL水超声提取30min，过滤，收集滤液重复过滤1次，合并滤液，55℃减压浓缩至100mL，加入500mL
乙醇混匀析出杂质，过滤，将滤液减压浓缩至干，即得到粗提物。用纯水溶解后，利用HPLC和标准品做标准曲线标定其中二硝基甲苯磺酸钠的浓度。
[0038] 二硝基甲苯磺酸钠降解菌经鉴定为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)，2018年7月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.16147。
[0039] 二硝基甲苯磺酸钠降解菌的16S rRNA鉴定。
[0040] 16S rRNA序列的扩增采用正向引物为27F：5’-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3’，反向引物为1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACT T-3’。直接以单菌落或由单菌落培养的菌液为模板，PCR体系为：菌液模板0.5μL，Kodaq 2×PCR MasterMix 15μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，补加无菌水至30μL；PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃30s，54℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃5min，12℃保温。取5μL PCR产物跑琼脂糖凝胶
电泳，确认有
1500bp左右的条带后，将PCR产物送测序(由擎科生物技术有限公司青岛分公司完成)。将测序结果(如SEQ ID No.1所示)在GenBank中进行Blast同源比对分析，发现该降解菌16S rRNA基因序列与变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)(Accession NO.MF144432.1)
16S rRNA的基因序列同源性最高，为99％。结合形态、生理生化指标和16S rRNA基因序列分析，初步鉴定该二硝基甲苯磺酸钠降解菌为变栖克雷伯氏菌。
[0041] 所述二硝基甲苯磺酸钠降解菌，2018年7月24日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏号为：CGMCC NO.16147。
[0042] 实施例2.二硝基甲苯磺酸钠降解菌对二硝基甲苯磺酸钠的利用。
[0043] 将纯化后的单菌落挑到5mL LB培养基中，30℃摇床培养过夜。取
种子液在底物浓度为500mg/L的无机盐固体培养基平板上划线，30℃培养箱培养至有菌落长出(约3-4天)，以大肠杆菌JM109(DE3)作为对照。如附图2所示，该变栖克雷伯氏菌能在以二硝基甲苯磺酸钠为唯一氮源的无机盐固体培养基平板上生长，而对照组JM109(DE3)则几乎无法生长。
[0044] 实施例3.二硝基甲苯磺酸钠降解菌对二硝基甲苯磺酸钠的降解效率实验。
[0045] 由于额外氮源在微生物对芳香族硝基化合物的降解过程中具有促进作用，因此在降解率实验中我们添加了不同浓度的NH4Cl作为额外氮源。挑取单菌落到50mL葡萄糖浓度为20g/L、底物浓度为20mg/L的无机盐培养基中，30℃摇床培养约12h。离心10000rpm 10min，用无机盐培养基洗涤菌沉淀两次，用少量无机盐培养基重悬后测OD600值，由OD600值计算得到转接量，分别转接至5mL NH4Cl浓度为0.5％、1％、2％的含有1g/L葡萄糖和40mg/L底物的无机盐培养基中，使初始OD600值为0.25，30℃摇床培养72h取样。
[0046] 用HPLC测定二硝基甲苯磺酸钠浓度。色谱柱为Welch Ultimate LP-C18(II)(4.6×250mm)，流动相条件为：溶液A为乙腈，溶液B为0.68g/L KH2PO4水溶液，A和B初始浓度分别为15％和85％，在20min内逐渐变化为30％和70％，保持5min，然后在1min内逐渐变化为15％和85％，保持9min。流速为1mL/min。
[0047] 如附图3所示，与不添加任何降解菌的对照组相比，本发明所述的降解菌能够有效降解二硝基甲苯磺酸钠，更明显的是，在加入本发明所述的二硝基甲苯磺酸钠降解菌仅72h后，含有2％NH4Cl的无机盐培养基中的二硝基甲苯磺酸钠降解率达到8.5％。
[0048] 综上所述，本发明筛选获得的二硝基甲苯磺酸钠降解菌能够用于降解二硝基甲苯磺酸钠，为通过
生物修复解决TNT红水不合理排放造成的土壤污染问题提供了一种新的微生物资源，具有良好的应用前景。
