(一)技术领域

本发明涉及一株可防治植物病原真菌和杀螨的新菌株——链霉菌 S1-5(Streptomyces sp.S1-5)及其在抗植物病原真菌和杀螨中的应用，以及 用链霉菌S1-5制得的可用于抗植物病原真菌和杀螨的乳剂。

(二)背景技术

生物农药以其低毒、无残留、无污染、原料易得等特性被人们公认为 是21世纪的绿色农药、理想农药。开发新型生物农药无疑是一种兼具社 会效益和经济效益的超前行为。螨类和植物病原真菌是造成蔬菜、茶叶、 果树和棉花等多种经济作物的主要危害，据统计，全国仅螨害需防治面积 不少于亿亩，常年造成产量损失12％～20％，严重时达25％以上。植物病 原真菌的危害造成的损失更是难以估量。传统的生物农药，不管是苏云金 芽孢杆菌杀虫剂还是其它微生物源杀虫剂都有一个共同的弊端，那就是杀 虫谱窄，持效期短、药效慢。阿维菌素对螨类活性高，但对很多鳞翅目害 虫毒力不够理想。多氧霉素和尼可霉素是一类能抗真菌的嘧啶核苷肽类 抗生素，现在两者都主要用作抗植物病原真菌的农用抗生素，但多氧霉素 渗透进入真菌胞内的能力较差，活性较差不理想，随着这些药物的长期使 用，又出现真菌对该类药物的耐药性。因此，开发安全高效的新型抗真菌 杀螨虫生物农药十分迫切。

迄今尚没有链霉菌(Streptomyces sp.)能同时具备防治植物病原真菌和 杀螨虫双重效果的报道。

(三)发明内容

本发明目的是为了提供一株可防治植物病原真菌和杀螨的新菌株 ——链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)，及其在抗植物病原真菌和杀螨中 的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)，保藏于中国典型培养物保藏中 心，保藏日期2007年5月24日，保藏编号CCTCC No：M207073。

本发明菌株的获得：从全国各地风景名胜区，如安徽黄山、江西庐山 和广西桂林、海南三亚采集土壤样品55份，通过样品初筛，复筛，获得 具有抗植物病原真菌和杀螨能力的纯培养物。对该纯培养物进行了形态和 生理生化鉴定，将其鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，命名为链霉菌S1-5 (Streptomyces sp.S1-5)。

菌株的鉴定：

1)菌株的培养特征：孢子丝直或柔曲，无螺旋。孢子表面光滑。蔗 糖查氏琼脂上菌落圆形，气丝绒状，波曲形，丛生，孢子丝分节，浅黄色 至绿灰色。在葡萄糖天门冬素琼脂上菌落灰白色，圆形，有同心环，孢子 丝杂乱，丛生，近松螺旋型，从上方观察为逆时针左旋，孢子呈球形或卵 形，大小不均，孢子表面光滑。在高氏一号琼脂上菌落圆形，有同心环状， 表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈放射状扩散，粉状，略呈浅黄色或浅 灰色，孢子丝近松螺旋型或波曲，丛生，从上方看为逆时针左旋。在燕麦 片培养基菌落圆形，有同心圆状，凹凸不平，灰白色，呈同心圆状，上生 黑色圆珠状物。在克氏一号琼脂上菌落灰色或灰白色，圆形，上生小黑点， 有同心圆，孢子丝近松螺旋型或波曲，丛生。菌株显微特征(15×100) 和JEOL-1230电镜照片见图1。

2)菌株的生理生化特性：产浅黄色可溶性色素。菌株能使液化明胶， 红褐色素，水解淀粉，胨化牛乳，产生H2S，产生黑色素，在纤维素上能 够生长。对棉子糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、纤维二糖、L-鼠李糖、 麦芽糖、甘露糖、D-果糖、肌醇、甘露醇等12种糖醇均有不同程度的利 用能力。结果表明，菌株S1-5的生理特征与放线菌(Actinomycete)中的链 霉菌属(Streptomyces)极为相似。

3)菌株的确定：依据菌体形态，S1-5菌株的基丝无隔，不断裂，孢 子丝呈链状直丝，确定S1-5属于链霉菌属。S1-5按培养性状鉴定种的标 准，培养菌落圆形，有同心环状，表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈放 射状扩散，粉状；气生菌丝多单叉分枝，孢子丝波曲形或近松螺旋型；明 胶液化，石蕊牛乳先胨化后凝固；淀粉水解能力较强，纤维素上生长，产 生硫化氢，有黑色素产生。依此查阅文献初步确定S1-5属于链霉菌 (Streptomyces sp.)。

链霉菌S1-5可用于防治植物病原真菌和/或螨类害虫引起的作物病害 中。所述植物病原真菌为下列之一：①蕃茄叶霉病菌(褐枝孢菌Fulria fulva)、②烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、③烟草赤星病菌(长柄 格孢菌Alternaria alternata)、④水稻纹枯病菌(立枯丝核菌Rhizotonia solani)。螨类害虫以棉花、果树红蜘蛛为代表。

具体的，所述的应用为：将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，以发酵 培养获得的发酵液或发酵液离心后的上清液稀释后作为药液，喷洒于作物 植株上。发酵液离心后得到的滤饼，可用蒸馏水水洗后离心，得到的滤饼 加无水乙醇，浸泡后离心，取上清液稀释后也可作为药液喷洒于作物植株 上。

或者，所述的应用为：将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，发酵培养， 发酵液离心后取上清液，用乙酸乙酯萃取，下层液体经柱层析分离得分离 液，分离液经浓缩、纯化，得到生物活性物质结晶可按常规方法配制成水 剂或乳剂，用于作物病害的防治。

所述生物活性物质结晶的有效质量浓度为2-3％(指水剂或乳剂母液 中的浓度，实际使用时可根据需要稀释1000～5000倍)。

所述发酵培养基可为本领域中常见适用于链霉菌的培养基，本发明中 按如下组成配制：1％黄豆饼粉浸液20g，葡萄糖20g，碳酸钙2.0g，氯 化钠2.5g，蒸馏水1000mL。

链霉菌S1-5还可应用与杀灭鳞翅目害虫。

本发明还涉及一种用所述的链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)制备 的乳剂，所述乳剂由如下方法制备得到：将链霉菌S1-5接种至发酵培养 基，发酵培养，发酵液离心后取上清液，用乙酸乙酯萃取，下层液体经柱 层析分离得分离液，分离液经浓缩、纯化，得到生物活性物质结晶，再按 生物活性物质结晶、水、二甲苯、洗衣粉质量之比为0.1∶2∶2∶0.03进 行配制，得到所述的乳剂。

所述发酵培养基按如下组成配制：1％黄豆饼粉浸液20g，葡萄糖20 g，碳酸钙2.0g，氯化钠2.5g，蒸馏水1000mL。

本发明乃从自然界筛选得到一株链霉菌(Streptomyces sp.)，其产生的 一种新型广谱抗真菌和杀虫成分，试验证明它不仅对多种危害农作物的刺 吸式口器螨虫及其虫卵具有极高的杀灭活性，还对很多鳞翅目害虫毒力很 高(阿维菌素对很多鳞翅目害虫毒力不够理想)，而且对植物病原真菌也 有很好的防治效果。因此其优势体现在：①抗菌杀虫双重效果。传统生物 农药要使用2次，利用本发明制得农药使用1次即可达到杀真菌和杀螨虫 的效果，大大降低农业成本，减轻农民负担。②药效快。持效期长达30 天，同时也具备对人畜安全、不杀伤天敌和有益昆虫、对防治对象不易产 生抗药性、不污染环境、可被土壤微生物迅速降解又不影响土壤肥力和微 生物区系，无生物富集，对生态十分安全等优点，是一种关键酶抑制剂类 农药，与其他抗虫药物无交叉耐药性。

(四)附图说明

图1为菌株显微特征(15×100)(A)和JEOL-1230电镜照片(B)；

图2为长柄格孢菌抑菌圈；

图3为立枯丝核菌抑菌圈；

图4为浓缩后得到的结晶HPLC色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：发酵液的获得

(1)斜面培养：采用PDA培养基，斜面涂布链霉菌S1-5菌种，30℃ 下培养2～3天，获得斜面菌种；

(2)种子培养：斜面菌种接种至高氏1号培养基，30℃下培养2～3天， 获得链霉菌S1-5菌落；

(3)发酵培养：原始发酵培养基配制：1％黄豆饼粉浸液20mL、葡萄 糖20g、蛋白胨3.0g、碳酸钙2.0g、氯化钠2.5g、蒸馏水1000ml。从高 氏1号培养基培养的链霉菌S1-5菌落上刮取孢子置于无菌水中，振荡 10min，配成浓度1×108个/ml的孢子悬浮液，以10％(V/V)接种量接入 发酵培养基内，在摇床上250ml三角烧瓶，置于恒温摇床培养5d，得发 酵液，备用。

实施例2：发酵液提取物的获得与测定

取发酵液50ml，5000r/min，离心10min，上清液加等体积无水乙醇 即为生物活性物质上清液粗提物。滤饼用蒸馏水水洗两次离心，弃去上清 液，滤饼加无水乙醇至还原到发酵液体积，浸泡1h后，5000r/min离心 10min，取上清液即生物活性物质菌丝体粗提物。将此两种粗提物与发酵 液经离心后的上清液一起进行抑菌作用和杀螨试验的测定，同时以相同的 乙醇水溶液作对照。

抑菌作用测定方法：(四种植物病原真菌为浙江大学植保系惠赠，其 它试验微生物为浙江工业大学微生物实验室保藏)

参照夏谌恩等的方法，分别采用菌饼法、滤纸片法和杯碟法，均设置 3次重复。用滤纸片分别浸取少量离心后上清液、上清液粗提物和生物活 性物质菌丝体提取物放到褐枝孢菌、烟草疫霉菌、长柄格孢菌、主枯丝核 菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的含菌平板上。将平板在28℃条件 下培养2-3天，分别用游标卡尺测定其抑菌圈直径大小。结果见表1：

表1：S1-5生物活性物质粗提物对植物病原真菌的抑菌作用

供试菌株名称   抑菌圈直径/mm   离心后上清液   上清液粗提物   菌丝体粗提物 番茄叶霉病菌   14.00   6.62   6.80 烟草赤星病菌   15.00   6.45   7.33 水稻纹枯病菌   12.00   6.43   11.56 烟草疫霉菌   16.00   6.00   7.00 金黄色葡萄球菌   13.0   未测   6.54 枯草芽孢杆菌   12.5   未测   6.81 生理盐水作对照   -   -   - 等量生理盐水+乙醇作对照   -   -   -

杀螨作用测定方法：

将离心后上清液分别以原液和稀释10倍液、稀释100倍液供试，蒸 馏水对照，每浓度处理设3个重复，从柑桔园采集柑桔全爪螨雌成螨于室 内进行杀螨测定，每隔6h观察一次，杀螨率＝已杀螨数\原螨数。结果见 表2：

表2：S1-5生物活性物质杀螨试验测定结果

    稀释倍数   杀螨率(杀螨率＝已杀螨数\原螨数)   6h后   12h后   18h后   24h后     离心后上清液原液   94％   100％     稀释10倍液   87％   100％   100％     稀释100倍液   88％   98％   100％     蒸馏水对照   0   0   0   0

结论：S1-5生物活性物质上清液原液6h后对杀灭棉花红蜘蛛就有 很好的杀灭效果，10倍稀释液12h后基本可杀灭棉花红蜘蛛，100倍稀释 液18h后对棉花红蜘蛛杀灭率为100％。

实施例3：生物活性物质的获得与测定

链霉菌S1-5发酵液离心后，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯，萃取， 将上层减压浓缩收集。将下层收集做抑菌测定，用乙酸乙酯作为淋洗剂走 柱子，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯，柱层析硅胶(200～300目)为固定相，使 用干法装柱，用试管于下端收集洗脱液，每管收集10mL，一共收集10管。 生物活性跟踪：将收集的10管洗脱液及萃取的下层溶液使用滤纸片法分别 测定其对供试菌(长柄格孢菌和立枯丝核菌，浙江大学植保系惠赠)的抑 菌效果(结果数据见图2、图3)。HPLC检测柱层析效果，样品在 Carbohydrate Analysis 3.9×300mm Column分析柱上分析时，其抑菌物质主 峰对应的流出液同时于Water 2996 Photodiode二极管阵列全波长(190～ 400nm)检测器上进行扫描，测定其最大吸收峰处的波长，并绘制紫外吸 收光谱。柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μL；流动相：甲醇∶ 水(30∶70体积比)。

将以上具有抑菌活性的分离液于15000r/min下离心10min，取上清 液，加入等体积二甲苯，萃取，取有机相，再用旋转蒸发器浓缩成浓稠状 液体，于室温下放置一天。将结晶用甲醇洗下，离心弃去沉淀，再次旋转 浓缩，于室温下放置过夜，得到生物活性物质结晶。将结晶用甲醇洗下(色 谱醇)，收集做HPLC，条件同上(HPLC色谱图见图4、表3)。

表3：HPLC结果数据

名称  处理通道说明   保留时间(分)   面积(微伏·秒)   ％面积   高度(微伏) 峰1  PDA270.0微米   3.360   17992   4.71   1321 峰3  PDA270.0微米   4.382   364283   95.28   16887

实施例4：乳剂制备与测定

取按实施例3方法所得生物活性物质结晶，按生物活性物质结晶、胶 体硫(杭州高晶精细化工有限公司)、水、二甲苯、洗衣粉(市购，雕牌 普通洗衣粉)质量之比为0.1∶1∶2∶2∶0.03进行配制，先将胶体硫溶于 水中，加入洗衣粉搅拌，之后慢慢地倒入二甲苯，边倒边搅，持续5～10min， 最后加入生物活性物质结晶混匀，得到所述的乳剂。

室内杀螨、杀卵效果测定：

从柑桔园采集柑桔全爪螨雌成螨和卵于室内进行自制乳剂2500倍液 杀螨和杀卵测定，并用40％水胺硫磷1500倍液、20％三氯杀螨醇1500 倍液作对比，设清水对照，杀螨率＝已杀螨数\原螨数。结果表明，自制乳 剂2500倍液对柑桔全爪螨雌成虫和卵的杀伤力很强，杀虫率达 92.1％～94.8％，杀卵率达89.7％～93.4％，与40％水胺硫磷和20％三氯杀螨 醇500倍液效果基本一致。

实施例5：自制乳剂防治棉花红蜘蛛

乳剂的配制：

取生物活性物质结晶，按生物活性物质结晶∶胶体硫∶水∶二甲苯∶ 洗衣粉＝0.1∶1∶2∶2∶0.03的重量比配制，先将胶体硫溶于水中，加入洗衣粉 搅拌，之后慢慢地倒入二甲苯，边倒边搅，持续5～10min，最后加入生物 活性物质结晶混匀，制成母液。使用时按不同浓度稀释加水。

田间防治试验：

在棉花田进行了自制乳剂3000倍液田间喷雾防治棉花红蜘蛛试验， 以40％水胺硫磷1500倍液、20％三氯杀螨醇1500倍液为对照。结果如下：

自制乳剂3000倍液：药后5d防效为87.8％，药后10d防效为89.3％， 药后15d为98.5％；

40％水胺硫磷1500倍液：药后5d防效为99.6％，药后10d为96.1％。 药后15d仅63.5％；

20％三氯杀螨醇1500倍液：药后5d防效为99.7％，药后10d为98.7％， 药后15d仅为56.1％。

在自制乳剂1000ml中加入7.5％鱼藤乳油60ml混合得混合液，取其 1500倍液施用，5d后虫口减退率可达90％以上，30～60d时，防治效果稳 定在90％～99％之间，而水胺硫磷、三氯杀螨醇处理区仅为40％左右。

本制剂原料易得，成本低廉，配制简便，使用安全，对天敌杀伤作用 小，无残毒、残留，同时可兼治其他害虫，可在果树及其他作物上广泛推 广使用。

实施例6：防治水稻纹枯病研究

(1)菌株S1-5在田间植株上的定殖能力测定

在水稻苗期，将按实施例1方法制得的菌株S1-5发酵液(3.6×105 cfu/mL)喷施在水稻植株上，从接种后第1天开始观察记载叶片上每平方 厘米的菌体数量变化。

(2)田间防治效果测定

处理分别为S1-5发酵液(3.6×105cfu/mL)，20％井岗霉素WP(湖南生 物药厂)(CK1)为药剂对照和清水对照(CK2)。每个处理4次重复，每 重复小区面积30m2。各小区双埂包膜隔离，小区间距和小区与保护行间 距为80cm，保护行品种为岗优527。移栽前，用玉米粉培养的纹枯病 菌与河沙混匀混合。每小区200g，均匀撒栽小区内，于分蘖盛期和孕穗 期进行防治。根据水稻叶鞘和叶片危害症状程度分级，以株为单位每小区 对角线五点取样，每点调查相连5丛，共25丛，记录总株数、病株数和 病级数。0级：全株无病；1级：第四叶片及以下各叶鞘、叶片发病(以 剑叶为第一片叶)；3级：第三叶片及以下各叶鞘、叶片发病；5级：第 二叶片及以下各叶鞘、叶片发病；7级：剑叶叶片及以下各叶鞘、叶片发 病；9级：全株发病，提早枯死。

链霉菌S1-5发酵液对水稻纹枯病具有显著的控制效果，4年多点田 间试验结果显示，链霉菌S1-5发酵液防治纹枯病效果稳定在80％～85％ 之间，与对照药剂20％井岗霉素的防治效果相当。根据实际小区测产结 果，供试链霉菌S1-5发酵液处理均有显著的保产作用(6.91％～18.13％)。

实施例7：二次防治法突击防治桑园鳞翅目类害虫

每年的8月中下旬以后，桑园中的鳞翅目害虫特别是桑尺蠖进入高发 期，正处于1龄期，虫量达2400～62000只/亩。桑园中桑螟成虫也陆续羽 化，在9月初进入幼虫盛孵期。本实施例提到的二次防治法突击防治桑园 鳞翅目类害虫，第一次防治时间可定在8月下旬，第二次防治时间可在9 月上旬。

乳剂的配制：取生物活性物质结晶，按生物活性物质结晶∶胶体硫∶ 水∶80％敌敌畏(湖南生物药厂)1000倍稀释液＝0.1∶1∶2∶2的重量 比配制，先将胶体硫溶于水中，加入敌敌畏1000倍稀释液，边倒边搅， 持续5～10min，最后加入生物活性物质结晶混匀，制成母液。使用时按不 同浓度稀释加水。安全用叶间隔期5天。

田间防治试验：

在大蚕用叶桑园进行了自制乳剂2500倍液田间喷雾防治桑园中的鳞 翅目害虫特别是桑尺蠖的试验，以40％桑宝(江苏省常州市江南农药厂) 2500倍加60％敌马(江苏省常州市江南农药厂)1500倍加40％乐果(江 苏省常州市江南农药厂)1000倍液为对照。结果如下：

自制乳剂2500倍液：药后5d防效为79.4％，药后10d防效为93.7％， 药后15d为92.3％；

以40％桑宝2500倍加60％敌马1500倍加40％乐果1000倍液：药后 5d防效为88.4％，药后10d为96.7％。药后15d仅63.5％；

中秋期桑树枝条长、长势旺，如果再加上气候干燥，温度较高，桑条 上下的叶片农药残毒期有一定的差异，因此用叶前必须做到先试后吃，谨 防蚕儿农药中毒。在喷药时要使用专用喷雾器、用洁净水配药、浓度配准、 喷雾要细、药液喷足，以提高防效和确保养蚕安全。