技术领域
[0001] 本
发明属于
放射性核素污染治理技术领域，具体涉及一株具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌及其应用。
背景技术
[0002] 铯是一类
碱性金属元素，铯有37种同位素及16种同质异能素，除了133Cs 是天然存在的
稳定性同位素，其余均为放射性同位素。在环境
放射性核素中，铯-137主要来源于核武器试验、
核反应堆的
放射性废物和核
燃料后处理厂的放射性废液等。
[0003] 随着核工业的发展和技术的广泛应用，放射性核素不可避免地进入大气、
土壤、
沉积物和
水体等环境中，进而进入
生态系统中，并通过食物链对人类健康造成潜在危害。
[0004] 铯离子的化学性质与
钾离子的类似，一般说来，浓度大于毫摩尔级的铯离子即对
微生物产生毒害作用。铯的
半衰期长达30年，能在环境中长时间保留和迁移，因此铯离子污染的治理须得尽早尽快。
[0005]
生物修复是当前铯离子污染治理的重要途径。其中，微生物若能被运用于放射性核素修复，则该微生物需要对放射性核素具有一定的耐受性，能在一定浓度的放射性核素中生存。目前，国内外分离到的耐受铯离子的微生物大多来源于土壤环境，且耐受的铯离子浓度多数小于200mM，对于铯离子的移除率也有高有低。
[0006] 目前亟需寻找能够在高浓度铯离子环境中生存，且具有一定铯离子移除率的微生物。
发明内容
[0007] 本
申请的发明目的是提供一种具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌及其应用。
[0008] 为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：
[0009] 本发明一株具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌，分类命名为芽孢杆菌 Cs-700(Bacillus sp.Cs-700)，已于2019年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20191032。
[0010] 本发明自海洋环境中分离到Bacillus sp.Cs-700菌株，Bacillus sp.Cs-700菌株具有耐受铯离子浓度高、去除铯离子能力强的优点。
[0011] 经测试，Bacillus sp.Cs-700菌株的铯离子耐受浓度大于700mM，在浓度 700mM的铯离子环境下，Bacillus sp.Cs-700菌株对铯离子的移除率可达 52.06％；在含氯化铯的1/2 2216E琼脂培养基上，铯离子对Bacillus sp.Cs-700 菌株的最小抑制浓度为1800mM；
在含氯化铯的1/2 2216E液体培养基中，铯离子对Bacillus sp.Cs-700菌株的最小抑制浓度为1500mM。
[0012] 基于此，本发明还提供了上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在移除铯离子中的应用。
[0013] 进一步地，本发明还提供了上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用。
[0014] 在上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用中，所述的铯离子污染环境为水体环境、沉积物环境、湿地环境或土壤环境。本发明的海洋细菌分离自海洋沉积物中，既能在水体环境中生长，也能在具有一定
含水量的土壤环境中生长，因此可用于对铯离子污染的水体环境、沉积物环境、湿地环境或土壤环境的原位修复。
[0015] 本发明的海洋细菌能够耐受高达1800mM的铯离子，因此，在上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用中，所述的铯离子污染环境中，铯离子浓度Cb的大小为：0mM＜Cb＜1800mM。
[0016] 作为优选，在上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用中，所述的铯离子污染环境中，铯离子浓度Cb的大小为： 200mM≤Cb＜1800mM。
[0017] 本发明的海洋细菌能够对具有低铯离子浓度(小于200mM)或高铯离子浓度(大于200mM)的铯离子污染环境进行修复，尤其适用于对具有高铯离子浓度的铯离子污染环境进行修复。
[0018] 经检测，本发明的海洋细菌为中度嗜盐菌，最适生长
盐度为11％NaCl，在 0NaCl下不生长，25％NaCl下可以生长。因此，在上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用中，所述的铯离子污染环境的盐度为2.8-25％。
[0019] 当将海洋细菌应用于本身具有盐度的铯离子污染环境中时，如海洋环境，则不必调整盐度；当将海洋细菌应用于不含盐的铯离子污染环境中时，需要相应地对环境盐度进行调整。
[0020] 所述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用包括：将所述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌接种至所述的铯离子污染环境中。
[0021] 作为优选，在上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用中，将处于稳定生长期的所述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌接种至所述的铯离子污染环境中。
[0022] 作为进一步优选，在上述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌在原位修复铯离子污染环境中的应用中，将所述的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌制成OD600为0.8-1.5的菌悬液，而后按1-5％的接种量接种至所述的铯离子污染环境中。
[0023] 与
现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0024] 本发明自海洋环境中分离到Bacillus sp.Cs-700菌株，具有耐受铯离子浓度高，去除铯离子能力强的优点。经测试，Bacillus sp.Cs-700菌株的铯离子耐受浓度大于700mM，在浓度700mM的铯离子环境下，Bacillus sp.Cs-700菌株对铯离子的移除率可达
52.06％；在含氯化铯的1/2 2216E琼脂培养基上，铯离子对Bacillus sp.Cs-700菌株的最小抑制浓度为1800mM；在含氯化铯的1/2 2216E 液体培养基中，铯离子对Bacillus sp.Cs-
700菌株的最小抑制浓度为1500mM。
附图说明
[0025] 图1是具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌Bacillus sp.Cs-700在含有不同铯离子浓度的液体2216E培养基中的生长曲线图；
[0026] 图2是具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌Bacillus sp.Cs-700的扫描
电子显微镜形态图。
[0027] 图3是不同菌体浓度的具有铯耐受和铯去除能力的海洋细菌Bacillus sp. Cs-700在含有不同浓度CsCl、KCl的1/2 2216E琼脂培养基上的生长情况图；
[0028] 其中，100、10-1、10-2、10-3、10-4表示对OD600＝0.5的菌液作不同稀释而获得的不同浓度的菌液；0mM、700mM、1500mM、1800mM、2000mM均表示 CsCl、KCl的浓度。
具体实施方式
[0029] 下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
[0031] 1、菌株的分离纯化
[0032] 本发明的目标菌株的分离纯化过程如下：
[0033] (1)取在中国广西防城港近岸海域采集的表层沉积物样品1g，加入到2mL 无菌
海水中，充分混匀，静置待用；
[0034] (2)吸取0.5mL上清液接入50mL筛选培养基中，在28℃、160rpm摇床上振荡培养24h；
[0035] 该筛选培养基为含氯化铯的2216E液体培养基，氯化铯的终浓度为50mM；该含氯化铯的2216E液体培养基的配方为：蛋白胨5.0g，
酵母膏1.0g，
柠檬酸铁0.1g，
氯化钠19.45g，氯化镁5.98g，
硫酸钠3.24g，氯化
钙1.8g，
氯化钾0.55g，
碳酸钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34.0mg，
硼酸22.0mg，
硅酸钠4.0mg，氟化钠2.40mg，
硝酸铵1.60mg，
磷酸氢二钠8.0mg，氯化铯8.42g，蒸馏水1000g， pH7.6；
[0036] (3)吸取步骤(2)获得的
种子液0.5mL，接入50mL氯化铯终浓度为200mM 的2216E液体培养基中(2216E液体培养基1L，氯化铯33.67g)，在28℃、160rpm 摇床上振荡培养24h；
[0037] (4)吸取步骤(3)获得的种子液0.5mL，接入50mL氯化铯终浓度为500mM 的2216E液体培养基中(2216E液体培养基1L，氯化铯84.18g)，在28℃、160rpm 摇床上振荡培养24h；
[0038] (5)吸取步骤(4)获得的种子液0.5mL，接入氯化铯终浓度为700mM的2216E液体培养基中(2216E液体培养基1L，氯化铯117.85g)，在28℃、160rpm 摇床上振荡培养24h；
[0039] (6)吸取步骤(5)获得的种子液0.1mL，涂布于氯化铯终浓度为700mM 的2216E固体培养基上(2216E液体培养基1L，氯化铯117.85g，琼脂20.0g)，在28℃下恒温培养3-5天，直到有可辨认的单菌落长出；
[0040] (7)用灭菌竹签挑取单菌落至氯化铯终浓度为700mM的2216E固体培养基上进行纯化，最后获得纯菌株，用75％(v/v)甘油(1:4；甘油：菌液)保存在 -80℃。
[0041] 该菌株在含有不同铯离子浓度的液体2216E培养基中的生长曲线如图1所示。
[0042] 2、菌株鉴定
[0043] 对分离到的菌株进行形态特征、生长条件、系统发育树分析，获悉该菌株具有以下特点：
[0044] (1)菌株形态特征：该菌为
革兰氏阳性菌，在2216E固体培养基上培养3d 后形成淡黄色、凸起、表面光滑、直径约为1-1.5mm的圆形菌落，在扫描电子显微镜下观察(如图2所示)，菌体呈短杆状，长1.9-3.8μm，宽0.9-1.2μm。
[0045] (2)生长条件：该菌为中度嗜盐菌，最适生长盐度为11％NaCl，在0NaCl 下不生长，25％NaCl下可以生长。
[0046] (3)系统发育树分析：该菌株的16s RNA序列和全基因组已上传至NCBI，收录号分别为MN715811和CP041063；根据16s系统发育进化树分析，该菌株与Bacillus.hwajinpoensis SW-72T的相似性最高，为99％；因此命名为Bacillus sp. Cs-
700。
[0047] 实施例2菌株对铯的耐受能力测定
[0048] 通过琼脂稀释法在含有不同浓度CsCl、KCl的1/2 2216E琼脂培养基上测定 Bacillus sp.Cs-700对铯的最小抑制浓度，KCl用来作为高渗透压的对照处理。
[0049] 取在1/2 2216E液体培养基中生长24h的菌液，调整OD600＝0.5后，稀释成100、10-1 -2 -3 -4、10 、10 、10 不同梯度，取10μL稀释后的菌液点样于上述琼脂培养基上，在28℃
培养箱中培养三天，观察生长状况。
[0050] 同时取稀释前的菌液(已知Bacillus sp.Cs-700耐受700mM CsCl)按1％的接种量接种于浓度为1000mM，1200mM，1500mM CsCl的培养基中。
[0051] 如图3所示，在1800mM CsCl固体培养基上，无菌落的形成；而同浓度的 KCl的培养基上，菌落形成明显；在1500mM CsCl的液体培养基中也没有观察到Bacillus sp.Cs-700的生长迹象。
[0052] 实施例3菌株从环境中移除铯能力的测定
[0053] 从实施例1中可以看出，Bacillus sp.Cs-700菌株对铯离子具有较强的耐受能力，因此本实施例对菌株能否从环境中移除铯离子进行测定。测定方法包括：
[0054] (1)挑取2216E固体培养基上Bacillus sp.Cs-700单菌落，接种于30mL 2216E液体培养基中，于28℃，200rpm摇床培养24h；
[0055] (2)将上述菌液于4℃下、6000rpm离心10min，弃掉培养基；菌体用ddH2O 洗涤3次后，重悬于无菌海水中，至OD600＝1.5；
[0056] (3)吸取重悬后的菌液0.5mL，接种至50mL氯化铯终浓度为700mM的 1/2 2216E液体培养基中，于28℃，200rpm摇床培养；
[0057] (4)在摇床培养的第12h、第24h、第36h、第48h、第60h、第72h，分别取1.5mL步骤(3)获得的菌液，于4℃下、12000rpm离心10min，取上清液；菌体用ddH2O洗涤3次，每次0.5mL，合并上清液和洗涤液，测定合并液中的铯离子浓度；
[0058] (5)合并液中铯离子浓度通过
原子吸收分光光度计(普析通用TAS 990)来测定：灯
电流4mA，
光谱宽度0.4nm，
燃烧器高度5mm，分析
波长852.1nm；
[0059] (6)在对应时间点另取990μL菌液与10μL 50％戊二
醛混合均匀，利用流式细胞仪(BD AccuriTM C6)测定细菌丰度。
[0060] (7)Bacillus sp.Cs-700菌株对铯离子移除率的计算方式为：
[0061] 铯移除率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％；
[0062] 其中，C0表示培养基中铯离子初始浓度，Ct表示t时刻下培养基中铯离子的浓度。
[0063] 菌体中累积的铯离子浓度的计算公式为：
[0064] 铯累积浓度(mM/109cells)＝(C0-Ct)/Nt；
[0065] 其中，Nt表示t时刻下培养基中细菌丰度。
[0066] 测试结果见表1。
[0067] 表1
[0068]
[0069] 由表1可见，在700mM铯离子环境下，Bacillus sp.Cs-700在培养48h时对铯离子的移除率达到最大，为52.06％；菌体中累积的铯离子浓度也达到最高，达2.97mmol/109cells，此时细胞处于平台期后期。
