一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺
阅读：60发布：2020-05-12
专利汇可以提供一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 食品加工 技术领域，尤其涉及一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺。一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，包括如下步骤：第一步：准备材料和 试剂 ；第二步：配制培养基；第三步：处理样品；第四步：乳酸菌的分离；第五步：乳酸菌的筛选。通过所述的一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺得到的S26、S42、S53三株乳酸菌的特点是：经过12h的生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；对13种抗生素均有敏感性，可以作为肉品 发酵 的备选菌株，可用来发酵肉制品，比如羊肉。，下面是一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺专利的具体信息内容。
1.一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
第一步：准备材料和试剂
侗族地区传统发酵酸肉，以下简称侗族酸肉；
第二步：配制培养基：
参考现有技术配制MRS固体培养基、产粘性培养基、耐盐性试验培养基、耐硝性试验培养基、产H2S培养基、葡萄糖产气培养基、氨基酸脱羧酶培养基、硝酸盐还原培养基、产氨培养基、乳酸纸层析试剂、石蕊牛乳培养基、V-P反应培养基；
第三步：处理样品
在无菌条件下取侗族酸肉25g，切碎，加入到225mL的无菌生理盐水中，振荡均匀备用；
取1.0mL加至到9.0mL无菌生理盐水中进行梯度稀释；
第四步：乳酸菌的分离
选取合适的稀释度，涂布于含3％CaCO3的MRS固体培养基上，凝固后置于37℃培养；挑取产生碳酸钙溶解圈的单菌落反复划线，直至获得纯的菌株；对纯菌株进行革兰氏染色、菌体形态观察、过氧化氢酶活性测定，凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌；
第五步：乳酸菌的筛选
在发酵肉制品的生产中，乳酸菌应符合以下筛选标准：能够耐受6％的NaCl和150mg/kgNaNO2、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；
依据筛选标准，按照以下方法进行筛选：产黏性试验、耐盐性试验、耐硝性试验、产H2S试验、发酵葡萄糖产气试验、氨基酸脱羧酶试验、硝酸盐还原能力试验、产氨试验、乳酸的纸层析分析、石蕊牛乳试验、V-P试验、产酸性试验、抑菌试验、蛋白酶活性检测和脂肪酶活性检测。
2.一种乳酸菌，其特征在于，所述一种乳酸菌用于发酵肉制品。
3.根据权利要求2所述的一种乳酸菌，其特征在于，通过权利要求1所述的一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺提取。
4.根据权利要求3所述的一种乳酸菌，其特征在于，所述的一种乳酸菌具体为香肠乳杆菌或植物乳杆菌或乳酸片球菌。
5.根据权利要求4所述的一种乳酸菌，其特征在于，所述肉制品为羊肉。
一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺
技术领域
背景技术
[0002] 发酵肉制品是以各类畜禽肉为原料，采用微生物发酵技术，将原料肉经特定的微生物作用，产酸使pH值下降，并经过低温失水使产品的Aw降低，从而增加产品的保藏性能的一大类肉制品。侗族是中国少数民族之一，其制作的发酵酸肉营养丰富，风味独特，保存期长，是经过乳酸细菌、葡萄球菌、酵母菌、微球菌等多个微生物菌群自然发酵而成的发酵肉制品。在其发酵过程中，乳酸菌起到了至关重要的作用，一方面它能将原料中的碳化合物分解为乳酸，导致产品的pH值下降，有效抑制病原菌及有害菌的生长；另一方面它还赋予了产品特有的风味和坚实的质地。此外，乳酸的产生还会加速亚硝酸盐向一氧化氮肌红蛋白的转化，减少产品中亚硝酸盐的残留量，同时促进了良好色泽的形成，因此其常常被筛选出来用作肉品发酵剂。
[0003] 虽然我国是肉制品生产大国，但加工能力却远比不上西方国家。近年来，发酵肉制品因其感官性质独特、营养丰富、利于消化吸收、货架期长等众多的优点，越来越受广大人民的欢迎。但由于其生产周期长，工业化生产的规模受到限制，价格昂贵，不能满足日益增长的市场需求。因此，筛选用于发酵肉制品的乳酸菌株，对于缩短发酵肉制品生产周期，实现商业化具有重要意义。
[0004] 为此，设计一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，以期为新型健康发酵肉制品，比如发酵羊肉的研究和开发提供优质菌种资源。
发明内容
[0005] 本发明为克服以上不足，提供一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，包括如下步骤：
[0006] 第一步：准备材料和试剂
[0007] 侗族地区传统发酵酸肉，以下简称侗族酸肉；
[0008] 第二步：配制培养基：
[0009] 参考现有技术配制MRS固体培养基、产粘性培养基、耐盐性试验培养基、耐硝性试验培养基、产H2S培养基、葡萄糖产气培养基、氨基酸脱羧酶培养基、硝酸盐还原培养基、产氨培养基、乳酸纸层析试剂、石蕊牛乳培养基、V-P反应培养基；
[0010] 第三步：处理样品
[0011] 在无菌条件下取侗族酸肉25g，切碎，加入到225mL的无菌生理盐水中，振荡均匀备用；取1.0mL加至到9.0mL无菌生理盐水中进行梯度稀释；
[0012] 第四步：乳酸菌的分离
[0013] 选取合适的稀释度，涂布于含3％CaCO3的MRS固体培养基上，凝固后置于37℃培养；挑取产生碳酸钙溶解圈的单菌落反复划线，直至获得纯的菌株；对纯菌株进行革兰氏染色、菌体形态观察、过氧化氢酶活性测定，凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌。
[0014] 第五步：乳酸菌的筛选
[0015] 在发酵肉制品的生产中，乳酸菌应符合以下筛选标准：能够耐受6％的NaCl和150mg/kgNaNO2、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；
[0016] 依据筛选标准，按照以下方法进行筛选：产黏性试验、耐盐性试验、耐硝性试验、产H2S试验、发酵葡萄糖产气试验、氨基酸脱羧酶试验、硝酸盐还原能力试验、产氨试验、乳酸的纸层析分析、石蕊牛乳试验、V-P试验、产酸性试验、抑菌试验、蛋白酶活性检测和脂肪酶活性检测。
[0017] 一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，筛选出三株菌S26、S42和S53，S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌，可用来发酵肉制品，比如羊肉；
[0018] S26、S42、S53三株乳酸菌的特点是：在12h生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；S26、S42、S53三株乳酸菌对13种抗生素均有敏感性，可以作为肉品发酵的备选菌株；所述13种抗生素包括头孢噻肟(CEF)、头孢氨苄(CEP)、氨卡西林(AMP)、卡那霉素(KAN)、庆大霉素(GEN)、新霉素(NEO)、链霉素(STR)、四环素(TET)、红霉素(ERY)、万古霉素(VAN)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(EVO)、阿莫西林(AMO)。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] 本发明所述的一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，从侗族酸肉中提出了三株适宜发酵肉类的乳酸菌S26、S42和S53；S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌；
[0021] S26、S42、S53三株乳酸菌的特点是：经过12h的生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；对13种抗生素均有敏感性，可以作为肉品发酵的备选菌株，可用来发酵肉制品，比如羊肉。附图说明
[0022] 图1为乳酸菌主要发酵特性阳性菌数表；
[0023] 图2为菌株S26、S42、S53的形态学特征；
[0024] 图3为菌株S26、S42、S53生理生化鉴定结果；
[0025] 图4为菌株S26、S42、S53的生长曲线及pH值变化曲线；
[0026] 图5为乳酸菌对13种抗生素的敏感性检测结果表；
[0027] 图6为菌株S26、S42和S53株菌拮抗效果比较。
具体实施方式
[0028] 以下将结合本发明的实施例进行详细叙述。
[0029] 一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，包括如下步骤：
[0030] 第一步：准备材料
[0031] 侗族地区传统发酵酸肉，以下简称侗族酸肉，购买于京东网站；
[0032] 第二步：配制培养基：
[0033] 参考现有技术配制MRS固体培养基、产粘性培养基、耐盐性试验培养基、耐硝性试验培养基、产H2S培养基、葡萄糖产气培养基、氨基酸脱羧酶培养基、硝酸盐还原培养基、产氨培养基、乳酸纸层析试剂、石蕊牛乳培养基、V-P反应培养基；
[0034] 第三步：处理样品
[0035] 在无菌条件下取侗族酸肉25g，切碎，加入到225mL的无菌生理盐水中，振荡均匀备用；取1.0mL加至到9.0mL无菌生理盐水中进行梯度稀释；
[0036] 第四步：乳酸菌的分离
[0037] 选取合适的稀释度，涂布于含3％CaCO3的MRS固体培养基上，凝固后置于37℃培养；挑取产生碳酸钙溶解圈的单菌落反复划线，直至获得纯的菌株；对纯菌株进行革兰氏染色、菌体形态观察、过氧化氢酶活性测定，凡是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性的菌株初步确定为乳酸菌。
[0038] 第五步：乳酸菌的筛选
[0039] 在发酵肉制品的生产中，乳酸菌应符合以下筛选标准：能够耐受6％的NaCl和150mg/kgNaNO2、不产粘液、发酵葡萄糖不产气、不产H2S、不产氨、不具有氨基酸脱羧酶活性、产酸速度快、发酵碳水化合物产物主要为乳酸、能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
[0040] 依据筛选标准，按照以下方法进行筛选：产黏性试验、耐盐性试验、耐硝性试验、产H2S试验、发酵葡萄糖产气试验、氨基酸脱羧酶试验、硝酸盐还原能力试验、产氨试验、乳酸的纸层析分析、石蕊牛乳试验、V-P试验、产酸性试验、抑菌试验、蛋白酶活性检测和脂肪酶活性检测。
[0041] 一种从传统侗族酸肉中筛选乳酸菌的工艺，筛选出具有明显溶钙圈的菌落进行反复纯化，在经革兰染色以及过氧化氢酶活性测定后，共获得G+、过氧化氢酶试验阴性的疑似乳酸菌共54株，分别命名为S1～S54；
[0042] 对54株菌株的分析检测结果：
[0043] 乳酸菌共54株具有的特点，所有乳酸菌菌株都能耐受2％Nacl和50mg/kg的亚硝酸盐；
[0044] 52个乳酸菌菌株能耐受4％Nacl；
[0045] 50个乳酸菌菌株能耐受6％Nacl；
[0046] 51个乳酸菌菌株能耐受100mg/kg的亚硝酸盐；
[0047] 49个乳酸菌菌株能耐受150mg/kg的亚硝酸盐；
[0048] 所有乳酸菌菌株发酵葡萄糖不产气，不生成H2S，产酸；
[0049] 53个乳酸菌菌株不产粘液；
[0050] 40个乳酸菌菌株V-P反应阳性；
[0051] 28个乳酸菌菌株不会发生氨基酸脱羧反应；
[0052] 28个乳酸菌菌株可抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长；
[0053] 48个乳酸菌菌株能使牛奶酸凝。
[0054] 三株菌鉴定及结果：
[0055] 54株中的S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌，对三株菌进行如下鉴定：
[0056] A、乳酸菌的鉴定：
[0057] (1)形态特征鉴定
[0058] 将纯化好的菌株利用平板划线的方法接种于MRS培养基平板上，在37℃条件下恒温培养，观察并记录菌株的菌落形态。对菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下油镜观察并记录待测菌株的菌体形态特征，分离得到符合发酵条件的三株乳酸菌，琼脂培养基上的菌落形态、革兰氏染色后显微镜下的菌体形态描述，如图2所示，如证明文件所示。
[0059] (2)生化鉴定
[0060] 按照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》等文献上的试验方法将筛选所得的菌株接入生化鉴定管，18～72h后观察记录现象。初步鉴定S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌，结果如图3所示。
[0061] (3)16SrDNA分子鉴定
[0062] DNA的提取：分别用细菌基因组DNA提取试剂盒对分离纯化的细菌进行提取，提取步骤按试剂盒说明书进行；PCR扩增及测序：PCR反应体系(50uL)：10×ExTaqbuffer5.0uL，2.5mmol/LdNTPMix4.0uL，10pPrimer12.0uL，10pPrimer22.0uL，5uExTaq0.5uL，Template2.0uL，ddH2O36.5uL；反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s(24次循环)；PCR扩增产物使用1％琼脂糖凝胶电泳检测，120V，20min，恒压对PCR产物进行电泳，并在凝胶成像系统下观察，并照相分析；将PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行纯化和测序；序列分析：测序结果在NCBI利用Blast做相似性比对分析；
另外，用ContigExpress软件对序列进行拼接及人工校正，生成Fasta格式文件，利用Mega7软件按照Neighbor-Joining法聚类构建系统发育树。
另外，用ContigExpress软件对序列进行拼接及人工校正，生成Fasta格式文件，利用Mega7软件按照Neighbor-Joining法聚类构建系统发育树。
[0063] 对提取菌株的总DNA进行PCR扩增，如证明文件所示，扩增出3条特异的、大小约为1500bp的条带。获得的特异性片段纯化后进行测序，将测序结果用BLAST进行序列同源性比对，根据比对结果显示，S26为香肠乳杆菌，S42为植物乳杆菌，S53为乳酸片球菌。
[0064] B、菌株产酸能力和生长曲线的测定
[0065] 将新鲜培养的适龄待测菌株接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下培养24h，用不接菌的MRS液体培养基作为空白对照，每隔2h用721型分光光度计于600nm波长下测定各菌株的菌液的OD值，并用酸度计测定pH值。其OD值大小表示菌株的生长情况，pH值可反应出菌株的产酸能力。
[0066] 分别绘制三株菌的生长曲线及pH值变化曲线，如图4所示，a、b、c分别为香肠乳杆菌S26、植物乳杆菌S42、乳酸片球菌S53的生长曲线及pH值变化曲线。
[0067] C、菌株安全性分析
[0068] (1)抗生素敏感性试验
[0069] 采用药敏纸片琼脂扩散(直径6.0mm)法检测从酸肉中分离到的三株乳酸菌对头孢噻肟(CEF)、头孢氨苄(CEP)、氨卡西林(AMP)、卡那霉素(KAN)、庆大霉素(GEN)、新霉素(NEO)、链霉素(STR)、四环素(TET)、红霉素(ERY)、万古霉素(VAN)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(EVO)、阿莫西林(AMO)的敏感性。使用涡旋混匀器混匀实验菌液，各取100uL菌液涂布于MRS固体培养基上，待菌液被培养基完全吸收后，将药敏纸片放于培养基上，静置15min后，倒置放于37℃培养箱中培养20h，测量并记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小。
[0070] 结果判定参照《CLSI抗菌药物敏感性试验标准》，被测菌株对抗生素的敏感性检测结果如证明文件所示，香肠乳杆菌S26对这几类抗生素均表现出敏感性；植物乳杆菌S42对糖肽类抗生素中的万古霉素表现为耐药，对其他类抗生素均有敏感性；乳酸片球菌S53对氨基糖苷类中的卡那霉素和喹诺酮类中的环丙沙星表现为耐药，对其他抗生素均有敏感性。
[0071] (2)质粒提取
[0072] 通过琼脂糖凝胶电泳对S26、S42和S53做质粒检测，同时以含有质粒的菌株(pET-22b)作对照，结果如证明文件所示，对照菌株所在泳道出现荧光条带，而被测菌株所在泳道均未出现荧光条带，可以认定3株菌不含有质粒。
[0073] (3)溶血试验在血平板培养基上涂布100uL实验菌液，待菌液被培养基完全吸收后，倒置放于37℃培养箱中培养20h，观察是否出现溶血现象。如证明文件所示，S26、S42和S53均无溶血现象产生。
[0074] D、菌株的拮抗试验用接种环挑取S26菌株，在MRS固体培养基上划一直线接菌；37℃条件下培养48h，待形成菌落后，沿菌落边缘(不接触)用接种环从垂直方向接S42，37℃条件下培养24h，观察S26对于S42的抑制效果。同理，检测S26对S53的抑制效果。
[0075] 如图6所示，S26、S42和S53之间均无拮抗性，可以用来复配发酵。
[0076] 三株菌的鉴定结果：
[0077] 在12h生长均能到达稳定期，并且产酸速度24h内可以将pH值降到3.5；同时对这三株菌进行了安全性方面的评估，发现乳酸菌对13种抗生素均有敏感性，安全性好，可以作为肉品发酵的备选菌株。
[0078] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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