항 대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움 및 헬리코박터 피로리의 특수면역단백질을 공유한 계란 생산방법 및 상기 생산방법으로 생산된 계란, 난황 및 상기 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 요구르트 및 아이스크림{The method for production of egg containing anti-E.coli IgY and anti-Helicobacter pylori IgY and anti-Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium simultaneously, and egg, yolk, yogurt and ice-cream containing specific IgY for anti-E.coli and anti-Helicobacter pylori and anti-Salmonella enteritidis and anti-Salmonella typhimurium}

본 발명은 장염을 일으키는 대장균( E. coli )과 위염균인 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori ) 및 위장 질환을 일으키는 살모넬라균( Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium )을 항원화시켜서, 어린 병아리에다 동시에 접종하여서 위염과 장염 그리고 식중독을 예방할 수 있는 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 계란 하나에 공유하게 하는 생산기술과, 독립적으로 네가지 항원을 병아리에다 접종한 후, 각각 생산된 특수항체를 적정 비율로 혼합하여 식품첨가제로 이용하는 기술을 제공하는데 그 특징이 있다.

또 다른 발명은 네가지 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황, 요구르트와 아이스크림에 관한 것이다.

또 다른 발명은 대장균과 살모넬라균( Salmonella enteritidis 와 Salmonellatyphimurium )을 항원화시켜서 동시에 접종하여서 식중독을 예방할 수 있는 특수항체(항-혼합균 특수면역단백질)를 계란 하나에 공유하게 하는 생산 기술을 제공하는 특징도 있다.

본 발명과 관련하여, 지금까지 보고된 대장균( Enterotoxigenic E.coli : 장관독소원성 대장균) 관련 자료를 보면 인체 및 가축의 장내에 상주하는 정상상주균총의 하나인 대장균은 소아뿐만 아니라 건강한 성인에게도 위장염과 관련있는 원인균으로 알려져 있다.

현재까지 사람의 설사원인 대장균으로서 다음의 5가지 종류가 밝혀지고 있다. 장관병원성 대장균(이하 EPEC라 함: Enteropathogenic E.coli ), 장관침습성 대장균(이하 EIEC라 함: Enteroinvasive E.coli ), 장관독소원성 대장균(이하 ETEC라 함: Enterotoxigenic E.coli ), 장관출현성 대장균(이하 EHEC라 함: Enterohemorrhageic E.coli ), 장관부착성 대장균(이하 EAEC라 함: Enteroadhesive E.coli )이다.

1923년 아담(Adam)은 유아의 설사환자에서 대장균을 분리하여 이 균이 위장염과 관련된다고 보고하였으며, 1940년대 중반에는 주로 영국에서 대장균에 의한 집단설사가 유아원에서 발생하였는데 이들 일군의 대장균을 최초로 엔테로페소제닉 이 콜라이( Enteropathogenic E.coli )라고 호칭한 것은 니터(Neter) 등으로서 병원성 대장균이라고 부르게 되었다.

종래의 대장균특허에 관한 기술을 요약하면 다음과 같다.

양광현(1994)은 동물의 설사증 예방 및 치료제에 대해 특허를 출원하였다.이는 동물의 설사증의 원인균을 포르말린으로 처리하여 불활성시킨 세포로 면역성을 가지는 항체를 제조함으로써 동물의 설사증의 원인균에 대한 효과를 가지는 치료제를 용이하게 제조하도록 하는 것으로 ETEC를 포르말린 처리하여 불활성화시킨 세포전체 또는 세포표면의 필라이(Pilli)를 면역원으로 이용하여 닭에 면역시켜, ETEC에 특이적으로 반응하는 항체를 함유하는 면역계란을 얻어, 동물 설사증의 원인균인 ETEC에 대하여 특이적으로 작용하는 동물의 설사예방 치료제를 제조하는 특허를 내었다. 그리고, 김정우(1999) 등은 돼지에서 ETEC K88균주의 항원과 계란의 난황중의 면역글로블린(IgY)을 이용하여 난황항체를 제조하고 이를 효과적으로 분리하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 하는 특허를 출원하였다. 또한, 김정우(1999) 등은 돼지에서 ETEC K99균주, K88균주의 항원을 계란의 난황 중에 면역글로블린(IgY)을 이용하여 난황항체를 제조하고 이를 효과적으로 분리하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 하는 특허를 출원하였다. 그리고, 김정우(1999) 등은 돼지에서 ETEC 987p균주, K88균주의 항원을 계란의 난황 중에 면역글로블린(IgY)를 이용하여 난황항체를 제조하고 이를 효과적으로 분리하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 하는 특허를 출원하였다. 그 외 고다마요시까스(1998)는 장관출형성 대장균(ETHC)에 의한 감염증의 예방 및 치료에 이용하고자 장관출형성 대장균 세포전체 및 항원으로서 베로톡소이드에 대해 면역된 암탉이 낳은 달걀로부터 수득된 항체 IgY를 이용하는 특허를 출원하였다. 국립수의과학검역원(1998)은 자돈 설사병의 원인체인 돼지대장균 및 유행성 설사바이러스에 의한 설사증 예방 및 치료용 난황항체를 이용한 복합 면역제제의 이용에 대한 특허를 출원하였다.

또한, 십이지장염을 일으키는 장염균인 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori ) 예방 치료제로서 개발된 세계 각국의 특허 중에서 일부를 요약하면 다음과 같다.

위염 및 십이지장염의 치료를 항원항체 반응으로 해결하려는 노력이 계속되어 왔는데, 코러들 등은 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori )에 기인하는 위염이나 소화기관 궤양 치료용 면역글로블린을 포유동물의 유방 분비물에서 분리하였다(1992). 타이요 카가쿠사는 산란계에 헬리코박터 피로리( H. pylori) 을 항원화한 후 면역시켜 특수 항체를 얻었으며(1992), 이때 사용된 항원은 헬리코박터 피로리 박테리아( H. pylori bacteria )ATCC 균주 43504, 43506, 43579 및 43629였다.

또한, 최근에는 살모넬라 엔테라이티디스( S.enteritidis ), 살모넬라 티피뮤리움( S.typhimurium ), 대장균 등과 같은 인수공통 전염병 중 장관내 병원성 미생물에 의한 사람의 피해가 날로 심각해지고 있는 실정이다.

식중독의 원인 중 가장 발생빈도가 높은 것은 세균성 식중독이다. 식중독의 주요 원인균으로는 살모넬라, 장염비브리오 및 포도상구균이며, 장관내 병원미생물 중 사람에서 식중독발생 원인이 되는 세균으로는 살모넬라가 가장 높은 빈도를 보인다. 살모넬라에 의한 식중독은 전체 환자수의 37.7%에 달한다. 주요 식중독의 원인균 중 장염비브리오에 의한 것은 여름에 집중적으로 나타나는 것에 반해 살모넬라에 의한 식중독은 연중 발생보고가 있어 그 중요성이 인정된다. 북미를 비롯하여 남미와 유럽에서도 살모넬라에 의한 식중독 피해는 계속 발생하고 있으며, 과거의 보균율에 비교하여 육류의 대량유통망 형성과 환경오염의 증가, 급식 등의 대단위식습관 형태가 늘어나면서 발생 및 보균율이 늘어나는 상황이다.

살모넬라 중 제한된 숙주영역을 갖고 있는 혈청형인 추백리균과 가금티푸스균을 제외한 나머지 2,400여종의 혈청형들은 특별한 숙주영역이 없어 아무런 환경에서 최소한 한가지 이상의 동물에 감염 또는 오염되어 있어서 이들의 근원적인 제거란 불가능하다. 살모넬라 균종 중 살모넬라 엔테라이티디스( Salmonella enteritidis )와 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhiumrium )이 식중독의 주원인으로 보고 되고 있다(국립보건원 감염병발생정보지, 김호훈(1997)). 일반적으로 계란의 외부에 의한(on egg infection) 감염경로가 대부분을 차지하지만 난계대 전염(in egg infection)도 살모넬라 감염증에서 일어난다. 특히, 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움의 경우는 난소에 감염되어있던 것이 계란의 난황에 이행되어 나타난 예가 있는 것으로 그 중요성이 더욱 강조된다. 따라서 이를 제거하는 것이면 바로 질병발생의 연결고리를 차단하는 것으로 살모넬라 유래 식중독에 대한 예방의 기본이 될 수 있다.

조류는 가축을 포함하여 동물 중에서 살모넬라 보균율이 높고, 따라서 검출빈도도 많다. 또한 계란을 통해 사람이 감염되는 전형적인 감염병은 살모넬라병이다. 따라서 가금의 산물인 계란의 살모넬라에 대한 우려가 있고, 이것으로 인한 고도의 살균과정을 필수로 하는 등의 가공공정과 조리시 한계성이 있는 상태이다.

최근 이 종구(2000)는 감염병발생정보지에서 각 시도의 국립보건원 방역과에서 보고한 내용을 바탕으로 최근 식중독 양상의 특징은 집단식중독이 증가하는 경향을 나타내고 있으며 이는 학교급식 등의 집단급식 보급확대 및 외식산업 발달 등식생활 구조의 변화에 기인하고 있다고 하였다. 또한 주요 원인균으로는 살모넬라, 장염비브리오 및 포도상구균이며, 이 중 살모넬라에 의한 식중독은 전체 환자수에서 37.7%에 달하여 대책이 시급한 것으로 보고하였다. 주요 식중독의 원인균 중 장염비브리오에 의한 것은 여름에 집중적으로 나타나는 것에 반해 살모넬라에 의한 식중독은 연중 발생보고가 있었다. 감염병발생정보지(제11권, 5호)에 의하면, 2000년 3월 16일부터 4월 15일까지 위장감염으로부터 분리한 세균중 살모넬라 엔테라이티디스가 60건으로 가장 많이 분리되었으며, 다음으로 살모넬라 티피뮤리움이 9건 분리되었다.

살모넬라와 관련한 종래기술로는 송경빈(2000)이 살모넬라 엔테라이티디스의 에이티에프에이 서브유니트의 말토오스 결합단백질과 융합된 단백질의 대장균에서 발현으로 특허를 출원하였다. 이는 닭에서 가장 문제되는 질병인 살모넬라 감염에 대한 진단용 키트와 백신개발에 이용하기 위한 것이다(출원번호: 10-2000-024818). 롱쁠링인코포레이티드(1991)에서는 세균증식 제어를 위한 도체 처리 방법으로 특허를 출원하였다. 이는 식용동물의 가공처리시 살모넬라와 같은 세균의 증식수준을 저하 및 지연시켜 반응특성의 저하를 일으키지 않으면서 동물 도체에 존재하는 세균을 제어하는 방법에 관한 것이다(출원번호: 10-1991-019081). 주식회사 미원(1993)에서는 살모넬라와 웰시균의 생육을 억제하는 방법으로 특허를 출원하였다. 가축의 장에 살모넬라와 웰시균의 성장을 저해하는 기능이 있는 효과적인 화합물을 투여하여 살모넬라균과 웰시균의 생육을 억제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다(출원번호: 10-1993-004430).

상기한 바와 같이, 헬리코박터, 살모넬라균의 성장억제에 대하여 항생제와 천연물질을 이용하는 등의 여러 방법이 시도되고 있으나 그 효능평가에서는 일정한 결론이 얻어지지 못하고 있는 실정이다. 그러나 해마다 식중독 문제는 대두되고 있으며, 근본적으로 계란에 살모넬라 항체를 다른 항체와 동시에 함유케 함으로서 보다 효과적인 예방책을 제시할 수 있다.

또한, 일반적으로 어떤 일정한 균에 대한 항체를 만들어내고, 그 항체를 이용하여 치료를 수행하는 것이 가장 이상적인 방법으로 알려져 있으나, 각각의 항체를 생산하는 것이 어렵고, 또한 항체 분리 등의 문제가 산업적으로 해결되지 못하는 문제점이 있다.

상술한 종래의 기술적 과제를 해결하기 위하여, 한 개의 계란에다 네가지 또는 세가지 항-혼합균 특수면역단백질(항-대장균 IgY, 항-헬리코박터 피로리 IgY, 항-살모넬라 엔테라이티디스 IgY 및 항-살모넬라 티피뮤리움 IgY/ 또는 항-대장균 IgY, 항-살모넬라 엔테라이티디스 IgY 및 항-살모넬라 티피뮤리움 IgY)을 동시에 함유하는 공유방법 및 이러한 네가지 또는 세가지 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황 및 상기 항-혼합균 특수면역단백질이 함유된 요구르트, 아이스크림 등의 유제품을 제공하는 데 있다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해서 장염을 유발하는 두가지 균, 대장균( Enteropathogenic E.coli )과 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori ) 항원 및 식중독균인 살모넬라 엔테라이티디스( Salmonella enteritidis )와살모넬라 티피뮤리움 ( Salmonella typhymurium )을 제조하여 병아리에다 동시에 면역시키고, 이 닭이 성장 후 산란된 계란에 이 네 가지 에 대한 항체를 공유한 계란을 생산하는 방법 및 각각 독립적으로 생산된 네 가지 항체를 혼합한 후 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 계란을 생산하는 방법과 상기 방법에서 생산된 계란, 난황 또는 면역단백질을 함유한 요구르트, 아이스크림 등을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또 다른 발명은 세가지 균, 대장균과 살모넬라균 2종류( Salmonella enteritidis 와 Salmonella typhimurium )를 항원화시켜서 동시에 접종하여서 식중독을 예방할 수 있는 특수항체를 계란 하나에 공유하게 하는 생산 방법을 제공하는 특징도 있다.

도 1은 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 및 헬리코박터 피로리 복합 접종시 항-헬리코박터 피로리 특수 IgY 역가 변화이다.

도 2는 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 및 헬리코박터 피로리 복합 접종시 항-살모넬라균 특수 IgY 역가 변화이다.

도 3은 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 및 헬리코박터 피로리 복합 접종시 항-헬리코박터 피로리 특수 IgY 평균 역가이다.

도 4는 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 및 헬리코박터 피로리 복합 접종시 항-살모넬라균 특수 IgY 평균 역가이다.

도 5는 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 복합 접종시 항-살모넬라균 특수 IgY 역가 변화이다.

도 6은 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 복합 접종시 항-대장균 특수 IgY 역가 변화이다.

도 7은 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 복합 접종시 항-살모넬라균 특수 IgY 평균 역가이다.

도 8은 대장균과 살모넬라 엔테라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 복합 접종시 항-대장균 특수 IgY 평균 역가이다.

상술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 구성은,

장염을 일으키는 대장균( E. coli )과 식중독균인 살모넬라 엔테라이티디스( Salmonella enteritidis )와 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhymurium ) 및 위염균인 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori )을 항원화시켜, 어린병아리에다 동시에 접종하여 장염을 예방할수 있는 복합 특수 항체(이하 항-혼합균 특수면역단백질이라 함)를 계란 하나에 공유하게 하는 생산방법과 독립적으로 네가지 항원을 병아리에다 접종한 후, 각각 생산된 항-혼합균 특수면역단백질을 적정 비율로 혼합하여 식품첨가제로 이용하는 기술을 제공하는데 그 특징이 있다.

또 다른 발명은 네가지 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 계란, 난황, 항-혼합균 특수면역단백질을 함유하는 요구르트와 아이스크림에 관한 것이다.

또 다른 발명은 대장균과 살모넬라균( Salmonella enteritidis 와 Salmonella typhimurium )을 항원화한 후 동시에 접종하여서 식중독을 예방할 수 있는 항-혼합균 특수면역단백질을 계란 하나에 공유하게 하는 생산기술을 제공하는 특징도 있다.

본 발명의 구성을 보다 상세하게 기술하면,

본 발명은 병아리에 대장균 항원과 살모넬라 엔테라이티디스 항원과 살모넬라 티피뮤리움 항원 및 헬리코박터 피로리 및 수산화 알루미늄으로 일정 비율로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 병아리 한쪽 다리에다 1회 접종하고, 2회 째부터 유화보조제(ISA25)를 사용한 혼합균 유화액을 2주 간격으로 1㎖씩 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 다시 3 달 간격으로 상기 유화보조제(ISA25)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화제와 동일한 비율로 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로, 생산한 한 개의 계란에 항-대장균, 항-살모넬라 엔테라이티디스, 항- 살모넬라 티피뮤리움, 항-헬리코박터 피로리의 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다. 상기 발명을 보다 구체적으로 기술하면, 병아리에 접종된 균체수가, 대장균 항원: 살모넬라 엔테라이티디스 항원: 살모넬라 티피뮤리움 항원: 헬리코박터 피로리 항원: 유화보조제의 비율이 1.5:1:1:3.5:3으로 하여, 4.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.15㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 사균액 항원 0.35㎖를 수산화 알루미늄 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 1회 접종하고, 2회 때부터는 2주 간격으로 유화보조제(ISA25)를 사용한 상기 혼합균 유화액을 동일 비율로 혼합한 혼합균 유화액 1㎖씩 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 동일한 비율로, 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.15㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.10㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.10㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 사균액 항원 0.35㎖와 유화 보조액(ISA25) 0.3㎖로 제조한 혼합균 유화액을 다리에다 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로, 생산한 한개의 계란에 항-대장균, 항-살모넬라 엔테라이티디스, 항-살모넬라 티피뮤리움, 항-헬리코박터 피로리의 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란생산방법에 관한 것이다.

또 다른 발명의 구성은, 병아리에 대장균 항원과 살모넬라 엔테라이티디스 항원과 살모넬라 티피뮤리움 항원과 헬리코박터 피로리 항원과 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 유화시킨 일정 비율의 혼합균 유화액 1㎖를 병아리 한쪽 다리에다 1회 접종하고, 2회 째부터 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 한 달 간격으로 상기 혼합균 유화액을 동일한 비율로 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란 생산방법에 관한 것이다. 상기 발명을 구체적으로 기술하면, 병아리에 접종된 균체수가 대장균 항원:살모넬라 엔테라이티디스 항원: 살모넬라 티피뮤리움 항원: 헬리코박터 피로리 항원:프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)의 비율이 1.5:1:1:3.5:3으로 하여, 4.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.15㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 사균액 항원 0.35㎖를 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 1회 접종하고, 2회 때부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 유화제로 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일비율로 1㎖씩 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 동일한 비율로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.15㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라균 사균액 항원 0.10㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라균 사균액 항원 0.10㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 사균액 항원 0.35㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액을 다리에다 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로, 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란 생산방법에 관한 것이다.

또 다른 발명의 구성은 상기의 방법으로 생산된 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유한 계란과, 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 20g을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 10) 20㎖를 첨가하여 교반하고, 24시간 저온(5∼10℃)에 방치 후 난황:알카리이온수(1:1)의 18배 분량(720㎖)의 알카리이온수를 섞은 후 48시간 방치하여 수용성 단백질을 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration) 시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하여 동결건조하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수 면역단백질의 생산방법 및 항-혼합균 특수 면역단백질에 관한 것이다.

그리고, 또 다른 발명의 구성은 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 및 상기 난황을 동결건조하는 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 보유한 난황, 난황분말에 관한 것이며, 상기 항-혼합균 특수 면역단백질(IgY), 난황 또는 난황분말을 함유한 아이스크림, 요구르트에 관한 것이다.

그리고, 또 다른 발명의 구성은 병아리에다 대장균 항원:유화보조제의 비율을 1:1로 하고, 살모넬라 엔테라이티디스 항원:유화보조제의 비율을 1:1로 하고, 살모넬라 티피뮤리움 항원과 유화보조제의 비율을 1:1로 하고, 헬리코박터 피로리 항원:유화보조제의 비율을 1:1로 하여, 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖과 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 균 항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 개별적으로 유화시킨 후, 각 개별적으 로 균체수 10 ⁸ /㎖이 포함된 상기 개별균 유화액 1㎖를 서로 다른 병아리 한쪽 다리에다 1회 접종하고, 2주 째부터는 유화보조제 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 개별균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일 비율로 1㎖ 씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 한 달 간격으로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖과 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖과 프로인트 불완전보조제(adjuvantincomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화 시킨 후, 제조한 유화액을 한쪽 다리에다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총5회 접종하는 방법으로, 생산된 특수면역단백질을 보유한 별개의 계란을 생산하고, 상기 개별적으로 생산된 계란의 난황에서 추출한 각각의 수용성단백질(crude IgY) 분말을 배합비(헬리코박터 피로리: 대장균: 살모넬라 엔테라이티디스: 살모넬라 티피뮤리움)가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 난황 특수면역단백질분말의 혼합조성물 및 상기 항-혼합균 난황 특수면역단백질 분말의 혼합조성물을 함유하는 아이스크림, 요구르트에 관한 것이다.

또 다른 발명은, 전술한 동일방법으로 개별균 유화액(1회 접종시 완전 프로인트보조제 사용, 2회 이후 접종시 유화보조제 프로인트 불완전보조제 사용)을 접종하여 생산된 별개의 계란에서 분리한 각각 난황의 배합비(헬리코박터 피로리: 대장균: 살모넬라 엔테라이티디스: 살모넬라 티피뮤리움)가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질(IgY)함유 난황의 혼합조성물 및 상기 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)함유 난황의 혼합조성물을 함유하는 아이스크림, 요구르트에 관한 것이다.

그리고, 또 다른 발명은 상기 방법으로 개별균 유화액(1회 접종시 완전 프로인트보조제사용, 2회 이후 접종시 유화보조제 프로인트 불완전보조제사용)을 접종하여 생산한 별개의 계란에서 분리한 상기 난황을 동결건조하여 제조한 난황 분말의 혼합 조성물 및 상기 특수 면역단백질(IgY)함유 난황 분말의 혼합조성물을 함유하는 아이스크림, 요구르트에 관한 것이다.

또 다른 발명은, 병아리에다 대장균 항원: 유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 살모넬라 엔테라이티디스 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 살모넬라 티피뮤리움 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 헬리코박터 피로리 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하여, 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 따로 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 티피뮤리움사균액 항원과 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 사균액 항원 0.5㎖과 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시킨 후 개별적으로 균체수 10 ⁸ /㎖이 포함된 상기 유화액을 서로 다른 병아리 한쪽 다리에다 1㎖를 1회 접종하고, 2주 째부터는 유화보조제(ISA25)를 사용한 개별균 유화액을 상 기 개별균 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 1주 간격으로 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 3 달 간격으로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시킨 후 제조한 유화액을 다리에다 0.5㎖ 씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하는 방법으로, 생산된 특수면역단백질을 보유한 계란을 생산하고, 상기 개별적으로 생산된 계란에서 추출한 각각의 수용성 특수면역단백질(crude IgY) 분말의 배합비(헬리코박터 피로리: 대장균: 살모넬라 엔테라이티디스: 살모넬라 티� ��뮤리움)가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1 중 어느 하나 배합비율로 선택된 항-혼합균 특수면역단백질 분말의 생산방법 및 상기 생산방법으로 생산된 항-혼합균 특수면역단백질에 관한 것이며, 또한 상기 항-혼합균 특수면역단백질을 함유한 아이스크림, 요구르트에 관한 것이다.

또 다른 발명은, 전술한 동일방법으로 개별균 유화액(1회 접종시 수산화알루미늄 유화제 사용, 2회 이후 접종시 유화보조제(ISA25) 사용)을 접종하여 생산된 별개의 계란에서 분리한 각각의 난황의 배합비(헬리코박터 피로리: 대장균: 살모넬라 엔테라이티디스: 살모넬라 티피뮤리움)가 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1중 어느 하나 배합비율로 선택된 것을 특징으로 하는 특수면역단백질(IgY)함유 난황의 혼합 조성물 및 상기 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)함유 난황의 혼합조성물을 함유하는 아이스크림, 요구르트에 관한 것이다.

그리고, 또 다른 발명은 상기 방법으로 개별균 유화액(1회 접종시 수산화알루미늄 유화제사용, 2회 이후 접종시 유화보조제(ISA25) 사용)을 접종하여 생산한 별개의 계란에서 분리한 상기 난황을 동결건조하여 제조한 난황분말의 혼합조성물 및 상기 특수면역단백질(IgY)함유 난황분말의 혼합조성물을 함유하는 아이스크림, 요구르트에 관한 것이다.

또 다른 발명의 구성은, 병아리에 대장균 항원과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 항원과 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로유화시킨 일정 비율의 혼합균 유화액 1㎖를 병아리 한쪽 다리에다 1회 접종하고, 2회 째부터 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 한 달 간격으로 상기 혼합균 유화액을 동일한 비율로 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로, 생산한 한개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY)과 항- 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 특수면역단백질(IgY)을 보유한 � ��란 생산방법에 관한 것으로써, 상기 발명을 구체적으로 기술하면, 병아리에 접종된 균체수가 대장균 항원: 살모넬라 엔테라이티디스 항원: 살모넬라 티피뮤리움 항원: 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)의 비율이 3.5:1.8:1.7:3으로 하여, 4.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.35㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.18㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.17㎖와 프로인트 완전 보조제(adjuvant complete Freund's) 0.3㎖를 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 1회 접종하고, 2회 때부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 유화제로 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일비율로 1㎖씩 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 동일한 비율로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.35㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라균 사균액 항� �� 0.18㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라균 사균액 항원 0.17㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.3㎖로 제조한 혼합균 유화액을 다리에다 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하는 방법으로, 생산한 한개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY) 및 항-살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하게 하는 것을 특징으로 하는 항-혼합균 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란 생산방법 및 상기 생산방법으로 생산된 계란, 그리고 상기 계란에서 분리한 난황을 동결건조하여 제조한 난황분말, 특수면역단백질(IgY)을 함유하는 아이스크림, 요구르트에 관한 것을 특징으로 한다.

이하에서는 본 발명의 구성을 보다 구체적으로 실시예 및 도면이나 도표에 의거하여 보다 상세히 설명하기로 하겠다. 다만, 본 발명의 권리범위는 실시예나 도면에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

1. 대장균( Enteropathogenic E.coli) 분리동정 및 항원제조

가) 사람에서의 대장균( Enterotoxigenic Escherichia coli ; ETEC) 분리 및 동정

본 시험에 사용된 대장균은 사람에서 분리하였다. 즉, 항원으로 사용된 대장균( Enterotoxigenic E.coli )은 설사증상을 나타낸 소아의 분변에서 분리하였다. 균의 분리는 다음과 같은 방법으로 하였다. 소아의 설사분변을 혈액한천배지에 도말 후, 37℃ 항온기에서 18시간 배양하여 α-용혈성을 나타내는 하나의 대장균 집락을 선택하였다. 선택된 집락은 멕콩키 배지(MacConkey agar)에서 핑크색의 집락으로자랐으며, EMB 배지(EMB agar)에 도말하여 철녹색(metalic green)으로 자라는 대장균의 특이적인 집락성상을 확인하였다.

나) 독소(Toxin) 생산능 확인

대장균(E.coli)의 장관독소원성(Enterotoxigenicity)의 주요원인인 장관성독소(Enterotoxin)의 생산능을 중합효소반응(Polymerase chain reaction; 이하 PCR이라 함)기법을 이용하여 확인하였다. 열안정성 독소(이하 ST: heat stable toxin)의 STa1 유전자과 열 불안정성 독소(이하 LT: heat lable toxin)의 LTh 유전자에 대한 특이 원형체(Primer)를 이용한 다복합(multiplex) PCR기법을 이용하여 증폭하였다.

ST 독소 확인용 원형체는

sense primer ; CCCCTCTTTTAGTCAGTC

anti-sense primer ; CCAGCACAGGCAGGATTACA

165bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다.

LT 독소 확인용 원형체는

sense primer ; CAGACTATCAGTCAGAGGTTG

anti-sense primer ; TTCATACTGATTGCCGCA

417bps의 최종산물을 증폭하도록 작제된 것을 사용하였다.

PCR조건은, 전-변성 온도(Pre-denaturation temperature )는 95℃ 온도 하에서 5분간, 변성온도(Denaturation temperature)는 94℃ 온도 하에서 1분간, 병합온도(Annealing temperature)는 56℃ 온도 하에서 1분간, 연장온도(Elongation temperature)는 72℃ 하에서 1분간, 후-연장온도(Post-elongation temperature)는72℃ 하에서 10분간으로 진행되었다. 증폭된 산물은 2% 한천겔(agarose gel)을 이용한 전기영동으로 확인하였다. 본 발명에 사용된 분리균주는 ST 독소를 생산하는 것이 확인되었다. 이 대장균은 EB-E01로 명명했다.

다) 대장균 ETEC( Enterotoxigenic E.coli ) 항원제조

대장균 ETEC 균주를 트립티케이스 소이 배지(Trypticase soy agr) 접종 후 37℃ 항온기에서 18시간 배양 후 하나의 집락(colony)을 5㎖의 트립티케이스 소이 브로쓰(Trypticase soy broth)에 접종했다. 2시간 후 대량의 트립티케이스 소이 브로쓰에 접종 후 37℃에서 48시간 정치 배양하였다. 배양된 균액은 포름알데하이드(formaldehyde)를 총량의 5% 되도록 섞고 실온에서 24시간 불활화시켰다. 불활화된 균액은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균을 수확하였고 멸균 피비에스(phosphate buffered saline: 이하 PBS라 함)(pH 7.2)로 3회 세척하였다. 수확된 균체는 410㎚에서 OD(Oculus Dexter)가 1.2∼1.3 되도록 PBS에 부유시킨뒤 사용하였다.

2. 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori) 항원제조

가) 헬리코박터 피로리

헬리코박터 피로리 (Helicobacter pylori) 는 아메리컨 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection:ATCC 43504)에서 분양받아 사용하였다. 실험균주는 트립티케이스 소이 배지(Trypticase soy agar:BBL)에 면양 혈청(sheep serum)을 10% 첨가한 평판 배지에서 3∼5일 간격으로 계대하며, 37℃, CO ₂ 농도 10%환경의 CO ₂ 인큐베이터(incubator)에서 배양하였다. 실험균주의 검정은 현미경적 관찰, 요소분해효소 활성 테스트(urease activity test)를 통해 실시하였다.

나) 요소분해효소 활성(Urease activity) 측정

요소분해효소 활성(Urease activity)의 측정은 요소(urea)와 페놀레드(phenol red)를 포함한 요소분해효소 테스트 브로쓰(urease test broth)를 이용하여 실시하였다. 요소 브로쓰(Urea broth)와 배양액 또는 시료를 4:1의 비율로 섞어 30분 동안 반응시킨 후 540㎚에서 흡광도를 측정하여 요소분해효소 활성(urease activity)을 결정하였다.

다) 세균의 형태 조사

3일과 5일 동안 배양된 균의 형태 변화를 육안적으로 관찰하고, 균 집락을 슬라이드 그라스(slide glass)에 도말하여 그람 염색한 후 광학 현미경(×1,000)으로 세균의 형태가 그람음성 나선형(curved form)인지 또는 구형(coccoid form)으로 변형 됐는지를 관찰하였다.

라) 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori) 항원제조

배양된 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori) 균주는 세포 콜렉터(cell collector)로 회수하여 생리식염수에 부유시킨 다음 60℃ 항원수조에서 30분간 열처리하여 항원을 불활화시킨 후 10,000 ×g에서 15분간 원심분리하여 균체를 회수하고 회수된 균체에 생리식염수를 넣어 원심분리하는 과정을 3회 반복하여 균체 내의 배지성분을 제거하였다. 불활성화된 균체원액의 균수는헤마토사이토메타(hematocytometer)로 측정하였다.

3. 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 항원제조

살모넬라 엔테라이티디스( Salmonella enteritidis )와 살모넬라 티피뮤리움( Salmonella typhimurium )을 각각 트립티케이스 소이 아가(Trypticase soy agr)에 접종 후, 37℃ 항온기에서 18시간 배양했다. 하나의 집락(colony)을 대량의 트립틱 소이 브로쓰(Tryptic soy broth)에 접종 후 37℃에서 48시간 정치 배양하였다. 배양된 균액은 포름알데하이드(formaldehyde)를 총량의 0.2% 되도록 섞고 실온에서 24시간 불활화시켰다. 불활화된 균액은 4,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균을 회수하였고 멸균생리식염수(pH 7.2)로 3회 세척하였다. 회수된 균체는 -70℃ 보관하여 사용하였다.

4. 복합된 네가지 항원을 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)

가) 중추 12주령의 병아리에다 접종된 균체수는 10 ⁸ /㎖였으며, 대장균 항원: 살모넬라 엔테라이티디스 항원: 살모넬라 티피뮤리움 항원: 헬리코박터 피로리 항원, 유화보조제의 비율은 1.5:1:1:3.5:3으로 하였다. 상세하게는, 4.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.15㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움균 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.35㎖를 수산화 알루미늄 0.3㎖로 유화시킨 후 1회 접종을 하였고, 2회 째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 ISA25를 사용하여 접종하였는데,일차적으로 혼합균 유화액을 1회째 접종을 포함하여 병아리 한쪽 다리에다 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 28주령의 산란계에다 3달 간격으로 동일한 비율로 제조한 유화액을 다리에다 0.5㎖씩 2회 접종하였다. 상기 네가지 항원을 함께 총 5회 접종하였다.

나) 도 3과 도 4에서 보는 바와 같이 ISA25 유화제를 사용한 경우에 항-살모넬라 엔테라이티디스 IgY 평균 역가와 항-헬리코박터 피로리 IgY 평균 역가가 대조구 단독 투여구에 비해서 두가지 이상 혼합항원 처리구에서 유의적으로 항-헬리코박터 피로리 IgY 평균 역가나 항-살모넬라 엔테라이티디스 IgY 역가가 높게 나타났음을 알 수 있다.

다) 중추 12주령의 병아리에다 접종된 균체수는 10 ⁸ /㎖였으며, 대장균 항원: 살모넬라 엔테라이티디스 항원: 살모넬라 티피뮤리움 항원: 헬리코박터 피로리 항원: 유화보조제의 비율은 1.5:1:1:3.5:3으로 하였다. 상세하게는, 4.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.15㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.10㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.35㎖와 프로인트 완전유화제(Adjuvant complete Freund's) 0.3㎖를 유화시킨 후 1회 접종하였고, 2회 째부터 부스팅에 사용된 보조제는 공지된 프로인트 불완전 유화제(Adjuvant incomplete Freund's)를 사용하여 접종하였는 데, 상기 혼합균 유화액을 병아리 한쪽 다리에다 1㎖씩 2주 간격으로 1회째 접종을 포함하여3회 접종한 후, 28주령의 산란계에다 3달 간격으로 동일한 비율로 제조한 유화액을 다리에다 0.5㎖씩 2회 접종하였다. 상기 네가지 항원을 함께 총 5회 접종하였다. 그 결과 상기 혼합균 유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 한개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)과 항-헬리코박터 피로리 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유한 계란을 생산하였다.

5. 혼합된 세가지 항원을 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)

12주령의 병아리에 접종된 항원과 유화보조제의 비율은 대장균 항원: 살모넬라 엔테라이티디스 항원: 살모넬라 티피뮤리움 항원: 유화보조제의 비율이 3.5:1.8:1.7:3으로 하였으며, 4.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.35㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.18㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.17㎖를 수산화 알루미늄 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖ 1회 접종했으며, 2회 때부터는 2주 간격으로 유화보조제(ISA25)를 사용한 상기 혼합균 유화액을 동일 비율로 혼합한 혼합균 유화액 1㎖씩 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 동일한 비율로, 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.35㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.18㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.17㎖와 유화 보조액(ISA25) 0.3㎖로 제조� � 혼합균 유화액을 다리에다 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하였다. 생산한 한개의 계란에항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하는 계란을 생산했다.

또 다른 발명의 구성은, 병아리에 대장균 항원과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움 항원을 프로인트 완전보조제(Adjuvant complete Freund's)로 유화시킨 일정 비율의 혼합균 유화액 1㎖를 병아리 한쪽 다리에다 1회 접종했으며, 2회 째부터 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일한 비율로 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 한달 간격으로 상기 혼합균 유화액을 동일한 비율로 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하였다. 생산한 한개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하는 특수 면역단백질(IgY)을 보유한 계란을 생산하였다. 상기한 발명을 구체적으로 기술하면, 병아리에 접종된 균체수가 대장균 항원: 살모넬라 엔테라이티디스 항원: 살모넬라 티피뮤리움 항원: 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's)의 비율이 3.5:1.8:1.7:3으로 하여, 4.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.35㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.18㎖와 4.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원 0.17㎖를 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.3㎖로 유화시킨 혼합균 유화액 1㎖를 1회 접종하였고, 2회 때부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 유화제로 사용한 혼합균 유화액을 상기 혼합균 유화액과 동일비율로 1㎖씩 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 동일한 비율로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.35㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라균 사균액 항원 0.18㎖와 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬 라균 사균액 항원 0.17㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.3㎖로 제조한 혼합균 유화액을 다리에다 3달마다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회를 접종하였다. 생산한 한개의 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY) 및 항-살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유하는 특수면역단백질(IgY)을 보유한 계란을 생산하였다.

또 다른 발명의 구성은 상기의 방법으로 생산된 항-대장균 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY)과 항-살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)을 동시에 공유한 계란과, 상기의 방법으로 생산된 계란을 소정의 용기에서 난황막을 제거한 난황 20g을 넣고, 동량의 알카리이온수(pH 10) 20㎖를 첨가하여 교반하고, 24시간 저온(5∼10℃)에 방치 후 난황:알카리이온수(1:1)의 18배 분량(720㎖)의 알카리이온수를 섞은 후 48시간 방치하여 수용성 단백질을 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration) 시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하여 동결건조하는 것을 특징으로 하는 항 혼합균 수용성 특수면역단백질의 생산방법 및 항-혼합균 IgY를 보유한 특수면역단백질에 관한 것이다.

6. 난황분리, 난황분말추출, 면역단백질 분리 및 역가 측정

가) 난황분리

상기 방법에 의하여 생산된 계란을 깨서 난황을 제외한 나머지를 분리하여 신선 난황을 분리하여 플라스크나 병에 넣는다.

나) 난황분말

상기 분리된 신선 난황을 원심분리한 후 동결건조하여 난황분말을 추출한다.

다) 면역단백질 분리 및 역가 측정

시험 분석에 사용된 면역단백질의 분리 및 측정법은 공지된 방법으로 하였다.

막을 제거한 난황 35g을 250㎖ 병에 넣은 다음, 알카리이온수 35㎖를 첨가하여 교반하였다. 24간 저온(5∼10℃)에서 방치한 후 난황:알카리이온수(1:1)액의 18배 분량(1260㎖)의 알카리이온수와 혼합한 후 48시간 방치하여 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration) 시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하여 동결건조하였다.

상기 여과에 의해 얻어진 수용성 단백질 중 특수 IgY의 함량을 다음과 같이 측정하였다.

또한, 특수 IgY의 함량 측정도 샌드위치 엘리사(ELISA)방법에 의해 수행되었다. 헬리코박터 피로리를 OD값이 660㎚에서 0.05가 되도록 완충액으로 희석하였다. 상기 희석된 균체를 마이크로플레이트에 코팅하고 철야로 방치하였다. 이 마이크로플레이트를 세척한 후 상기 여과된 수용성 단백질을 넣고 반응시킨 다음 세척하여, 1/10,000로 희석된 래빗 항-치크 IgG Ab-HRP를 첨가한다. HRP의 기질로는 TMB를 사용하였고, 반응 정지액으로는 2N-H ₂ SO ₄ 를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이 결과를 도 3과 도 4에서 도시하였다.

7. 네가지 항체를 함유한 요구르트 제조

가) 수용성 특수면역단백질 추출

수용성 특수면역단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다.

막을 제거한 난황 35g을 250㎖ 병에 넣은 다음, 알카리이온수 35㎖를 첨가하여 교반하였다. 24간 저온(5∼10℃)에서 방치한 후 난황:알카리이온수(1:1)액의 18배 분량(1260㎖)의 알카리이온수와 혼합한 후 48시간 방치하여 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration) 시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리방법으로 농축하여 동결건조하였다.

나) 신선 난황을 함유한 요구르트 제조

앞장에서와 같이 헬리코박터 피로리 항원과 대장균 항원 및 살모넬라 엔테라이티디스 항원과 살모넬라 티피뮤리움 항원으로 혼합시킨 복합 항원을 접종 후 생산된 계란에서 난황을 분리하여 요구르트에 사용하였다(표 3, 4). 요구르트 제조 공정에서 살균문제가 아주 심각한데 65℃에서 1분 처리하기 때문에 병원균을 살균하는 조건이 적합지 않아 제품의 유통기간이 짧아지는 문제점이 등장했다. 본 발명에서는 이러한 문제점을 살모넬라균 IgY가 난황 자체에 함유되게 함으로서 살균을 하지 않고 요구르트에 사용할 수 있는 기술을 개발했다.

다) 추출한 수용성 특수 면역단백질을 함유한 요구르트 및 아이스크림 제조

전술한 바와 같이 대장균 항원과 살모넬라 엔테라이티디스 항원과 살모넬라 티피뮤리움 항원 및 헬리코박터 피로리 항원으로 혼합시킨 복합 항원을 접종 후 생산된 계란에서 난황을 분리한 후, 추출한 수용성 단백질(crude IgY)분말을 첨가하였고, 아이스크림과 요구르트의 제조 배합비는 아래 표 1, 2, 3, 4에서 제시된 바와 같다.

8. 세가지(대장균, 살모넬라 엔테라이티디스, 살모넬라 티피뮤리움) 항체를 함유한 요구르트 제조

가) 수용성 특수면역단백질 추출

수용성 단백질 추출은 다음과 같은 방법으로 하였다.

막을 제거한 난황 35g을 250㎖ 병에 넣은 다음, 알카리이온수 35㎖를 첨가하여 교반하였다. 24간 저온(5∼10℃)에서 방치한 후 난황:알카리이온수(1:1)액의 18배 분량(1260㎖)의 알카리이온수와 혼합한 후 48시간 방치하여 추출한 다음, 상등액을 울트라 필터레이션(Ultra filteration) 시스템에서 홀로우 화이버(Hollow fiber) 막분리 방법으로 농축하여 동결건조하였다.

나) 신선 난황을 함유한 요구르트의 제조

상술한 바와 같이 대장균 항원 및 살모넬라 엔테라이티디스 항원과 살모넬라 티피뮤리움 항원으로 혼합시킨 복합 항원을 접종 후, 생산된 계란에서 난황을 분리하여 요구르트에 사용하였다(표 7, 8). 요구르트 제조 공정에서 살균문제가 아주 심각한데 65℃에서 1분 처리하기 때문에 병원균을 살균하는 조건이 적합지 않아 제품의 유통기간이 짧아지는 문제점이 등장했다. 본 발명에서는 이러한 문제점을 살모넬라균 IgY가 난황 자체에 함유되게 함으로서 살균을 하지 않고 요구르트에 사용할 수 있는 기술을 개발했다.

다) 추출한 수용성 특수면역단백질을 함유한 요구르트 및 아이스크림의 제조

앞 항에서와 같이 대장균 항원과 살모넬라 엔테라이티디스 항원과 살모넬라 티피뮤리움 항원으로 혼합시킨 복합 항원을 접종 후, 생산된 계란에서 난황을 분리한 후, 추출한 수용성 단백질(crude IgY) 분말을 첨가하였고, 아이스크림과 요구르트의 제조 배합비는 아래 표 5, 6, 7, 8에서 제시된 바와 같다.

실시예 2

실시예 2는 네가지 항체를 독립적으로 생산한 후 항체 혼합 및 그 생산방법에 의하여 생산된 계란에서 추출한 특수면역단백질을 이용한 요구르트, 아이스크림에 관한 것이다.

1. 대장균( Enteropathogenic E.coli ) 분리동정 및 항원제조

본 발명에 사용된 대장균은 사람에서 분리하였다.

대장균의 분리, 동정 및 항원제조는 실시예 1에 제시된 바와 동일하다.

2. 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori ) 항원제조

헬리코박터 피로리의 항원제조도 실시예 1에 제시된 바와 동일하다.

3. 살모넬라 엔테라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 항원제조

살모넬라 엔테라이티디스 및 살모넬라 티피뮤리움 항원제조도 실시예 1에 제시된 바와 같다.

4. 네가지 항원을 독립적으로 병아리에 접종 및 산란계에 부스팅(boosting)

가) 중추 12주령의 병아리에다 접종된 균체수는 10 ⁸ /㎖였으며, 대장균 항원:유화보조제의 비율은 1:1, 살모넬라 엔테라이티디스 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 살모넬라 티피뮤리움 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 헬리코박터 피로리 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하여, 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 따로 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 살모넬라 티피뮤리움 사균액 항원과 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시키고, 따로 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 수산화 알루미늄 0.5㎖를 유화시킨 후 각각 개별적으로 균체수 10 ⁸ /㎖이 포함된 상기 유화액을 서로 다른 병아리 한쪽 다리에다 1㎖를 1회 접종하고, 2주 째부터는 유화보조제(ISA25)를 사용한 � �별균 유화제를 상기 개별균 유화제와 동일한 비율로 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 한 달 간격으로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 개별적으로 유화시킨 후 제조한 유화액을 서로 다른 병아리 한쪽 다리에다 1㎖씩을 1회 접종하고, 2회 째부터 유화보조제(ISA25)를 사용하여 2주 간격으로 1회 접종을 포함하여 1㎖씩을 3회 접종했다. 성장 후 28주령의 산란계에다 3달 간격으로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA 25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA 25) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 유화보조제(ISA 25) 0.5㎖를 유화시킨 각각의 유화액을 다리에다 0.5㎖씩 2회 접종하였다. 상기 네가지(대장균과 살모넬라 엔테라이티디스와 살모넬라 티피뮤리움과 헬리코박터 피로리) 항원을 혼합하지 않고 개별적으로 총 5회 접종하였다.

나) 중추 12주령의 병아리에다 접종된 균체수는 10 ⁸ /㎖였으며, 대장균 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 살모넬라 엔테라이티디스 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 살모넬라 티피뮤리움 항원과 유화보조제의 비율은 1:1로 하고, 헬리코박터 피로리 항원:유화보조제의 비율은 1:1로 한 후, 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움균 항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant completeFreund's) 0.5㎖를 유화시키고, 따로 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 프로인트 완전보조제(adjuvant complete Freund's) 0.5㎖를 개별적으로 유 화시킨 후, 개별적으로 균체수 10 ⁸ /㎖가 포함된 상기 개별균 유화액 1㎖를 서로 다른 병아리 한쪽 다리에다 1회 접종하고, 2주째부터는 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's)를 사용한 개별균 유화제를 상기 개별균 유화액과 동일 비율로 1㎖씩 2주 간격으로 2회 접종한 후, 성장한 산란계에다 3달 간격으로 2.0×10 ⁸ /㎖ 대장균 사균액 항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 엔테라이티디스 사균액 항원 0.5㎖과 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 살모넬라 티피뮤리움 항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시키고, 2.0×10 ⁸ /㎖ 헬리코박터 피로리 항원 0.5㎖와 프로인트 불완전보조제(adjuvant incomplete Freund's) 0.5㎖를 유화시킨 후 제조한 유화액을 한쪽 다리에다 0.5㎖씩 2회 접종을 포함하여 총 5회 접종하였다. 그 결과 상기 개별균 유화액을 접종한 산란계로부터 생산한 계란에 항-대장균 특수면역단백질(IgY), 항-헬리코박터 피로리 특수면역단백질(IgY), 항-살모넬라 엔테라이티디스 특수면역단백질(IgY) 또는 살모넬라 티피뮤리움 특수면역단백질(IgY)을 독립적으로 함유한 계란을 생산하였다.

5. 난황분리, 난황분말추출, 면역단백질 분리 및 역가 측정

난황분리, 난황분말추출, 시험분석에 사용한 면역단백질의 분리 및 측정법은 실시예 1과 같다.

6. 혼합 면역단백질을 함유한 요구르트 및 아이스크림 제조

상술한 바와 같이 개별적으로 헬리코박터 피로리( Helicobacter pylori) 항원과 대장균 항원과 살모넬라 엔테라이티디스 항원 및 살모넬라 티피뮤리움 항원을 접종 후 생산된 계란에서 추출한 수용성 특수면역단백질(crude IgY) 분말이나 신선한 난황 또는 건조 난황을 각각 1:1:1:1, 2:1:1:1, 3:1:1:1, 4:1:1:1, 5:1:1:1(헬리코박터 피로리: 대장균: 살모넬라 엔테라이티디스: 살모넬라 티피뮤리움)로 혼합 식품첨가제로 사용하였으며, 아이스크림과 요구르트의 제조 배합비는 아래 표 9, 10, 11, 12에서 제시된 바와 같다.

본 발명은 상술한 특정의 실시예, 도표나 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.

본 발명에 의해서 생산된 네가지 항 혼합균 또는 세가지 항- 혼합균 특수면역단백질 공유(항-대장균 IgY, 항-헬리코박터 피로리 IgY, 항-살모넬라 엔테라이티디스 IgY 및 항-살모넬라 티피뮤리움 IgY/ 또는 항-대장균 IgY, 항-살모넬라 엔테라이티디스 IgY 및 항-살모넬라 티피뮤리움 IgY) 또는 함유 계란이나 유제품은 위장보호에 탁월한 효능이 있으며, 항생제를 사용하여 일단 치료되더라도 재발율이 아주 높은 위장염 및 십이지장염을 계란에서 생산된 특수면역단백질로 예방하는 효과가 있다.

특히 난황을 분리하는 공장에서 감염되는 병원미생물 때문에 요구르트 제조시에 살균하는데도 불구하고 병원미생물을 통제하지 못하며, 제품의 수명이 짧아지는 현상이 나타났다. 본 발명에서 생산된 살모넬라균 IgY함유 계란을 사용시에는 살균을 최소화할 수 있으며 살모넬라에 2차 오염을 방지할 수 있다. 또한 일부 오염되더라도 섭취 후에 본 발명에 의한 항-살모넬라 IgY가 함유돼 있어서 식중독 문제를 완화시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 생산방법에 의하여 생산된 계란에서 추출된 난황이나 난황분말, 또는 수용성 특수면역단백질을 이용한 요쿠르트, 아이스크림을 제조, 판매하여 일반 소비자가 용이하게 항-대장균 특수면역단백질(IgY), 항-살모넬라균 특수 면역단백질(IgY) 및 항-헬리코박터 피로리 특수면역단백질(IgY)을 동시에 함유한 기능성 식품을 섭취하게 할 수 있는 효과가 있다.