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一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂及其应用

阅读：317发布：2024-01-30

专利汇可以提供一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂，以微生物、甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸、光引发剂和水为分散相，以十六烷和司盘80作为连续相，采用液滴微流控技术制得微球，所述微球尺寸为100-500μm之间。本发明还公开了上述聚谷氨酸凝胶微球菌剂的制备方法与应用。本发明的聚谷氨酸凝胶微球可缓释包埋菌剂和延长菌剂较高有效活菌数的有效期，具有高活性生物功能，利于功能菌剂在土壤中的定殖，能够有效防治多种作物病害，减少化学农药和化肥的使用量，有效的结合了生物防治和化学防治，取长补短，实现了作物防治一体，省时又省力。，下面是一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂，其特征在于，以微生物、甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸、光引发剂和水为分散相，以十六烷和司盘80作为连续相，采用液滴微流控技术制得微球，所述微球尺寸为100-500μm之间。
2.根据权利要求1所述的聚谷氨酸凝胶微球菌剂，其特征在于，所述的微生物为阿斯青霉菌(P.asturianum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和骆驼刺泛菌(Pantoeaalhagi)中的任意一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的聚谷氨酸凝胶微球菌剂，其特征在于，所述的聚谷氨酸，其分子量为50kDa-3000kDa；所述的聚谷氨酸用聚谷氨酸盐替换；所述的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸按照如下方法制备得到：将γ-聚谷氨酸溶解于水中，调节pH值为4-6，然后滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌溶解均匀，滴加过程中控制体系的pH值维持在
4-6，滴加完毕于50-70℃水浴锅下搅拌反应6-10小时。待反应结束后，利用透析袋室温透析
3-8天，最后冷冻干燥即得。
4.根据权利要求1所述的聚谷氨酸凝胶微球菌剂，其特征在于，所述的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。
5.根据权利要求1所述的聚谷氨酸凝胶微球菌剂，其特征在于，分散相中，微生物有效活菌数占水的比例为107-1010cfu/mL，甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸占水的比例为1～5g/100mL，光引发剂占水的比例为0.1-0.5g/100mL；连续相中，司盘80所占体积比为1％-10％，其余为十六烷。
6.权利要求1所述的聚谷氨酸凝胶微球菌剂的制备方法，其特征在于，将微生物悬浮于水中，添加甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸PBS缓冲液与光引发剂，混合均匀作为分散相；将十六烷和司盘80混匀作为连续相，通过液滴微流控技术制得单分散亚微米尺度的液滴，再通过光固化即得聚谷氨酸凝胶微球菌剂，所述微球尺寸介于100-500μm之间。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的液滴微流控技术，微流控芯片的具体参数为：注射管内径为500-600μm，外径为900-1000μm，注射管尖端内径为30-50μm，外径为40-60μm；接收管内径为100-200μm，外径为900-1000μm；方管内径为1mm；分散相流速控制在4-8μL/min，连续相流速控制在20-40μL/min。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，光固化条件为：将通过液滴微流控技术收集的液体置于可见光源下，固化1-3min。
9.权利要求1所述的聚谷氨酸凝胶微球菌剂在肥料、饲料或食品领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，聚谷氨酸凝胶微球菌剂作为肥料在植物抗病促生、土壤解磷、提高农作物产量、提高土壤肥力、增强农作物抗逆性中任意一种或几种的应用。

说明书全文

一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂及其应用。

背景技术

[0002] 土壤是农业种植的根基，土壤问题关乎国计民生。自改革开放以来，随着我国工业现代化和农业现代化进程的飞速发展，特别是农药化肥的过度使用、污水灌溉、连作管理等导致农田土壤的恶化日趋严重，并且形成逐年积累之势。农田土壤恶化主要体现在土壤板结、土壤盐渍化、土壤菌群失调、连作障碍、重金属浓度增加等方面。农田土壤恶化已成为制约农业可持续发展的瓶颈问题。

[0003] 研究表明，土壤有益微生物能够通过自身的增殖及分泌活性物质，激发土壤活力，增加土壤团粒结构，使土壤疏松，缓解过量施用化学肥料对土壤的污染和板结，还可强力分解、释放多年沉积的磷、钾、铁、硅等微量元素，增加土壤营养。施用微生物菌剂，能够提高土壤有益微生物的数量，不仅能增加土壤有机质与有效养分，减轻板结症状，还能改善作物根际土壤环境，抑制有害微生物的生长，促进作物对养分的吸收，抵抗非生物胁迫，增强抗重茬能力，提高作物产量，提升农产品品质。因此，发展微生物肥料成为实现农田土壤改良的重要推动手段。

[0004] 我国从本世纪初开始逐渐迎来微生物肥料开发热潮，微生物肥料研发取得长足进展。尽管微生物肥料市场日趋繁荣，然而尚有一些技术难题亟待解决：①微生物活性保护剂研究缺乏，菌体活性保持时间和货架期短；②胶囊化活性保护剂的生物相容性和尺寸效应两个关键因素制约微生物肥料新剂型的发展。而微生物活性保护剂材料的选择及剂型制备工艺是上述问题解决的突破口。

[0005] 水凝胶材料因具有高含水量、成分与细胞外基质相似、生物相容性良好等优势，近年来在细胞和药物载体领域得到广泛应用。将细胞包覆在水凝胶材料中，不仅为细胞提供一个三维的仿生微环境，还可以避免细胞在储存和运输过程中所受到的损伤。但因传统水凝胶组分多为化学高分子，生物相容性和降解性较差，且交联过程有毒交联剂的使用均大大影响了内部包裹细胞的生物活性；聚谷氨酸(γ-PGA)是微生物利用L-谷氨酸和D-谷氨酸单体通过γ-酰胺键聚合而成的一种阴离子多肽型聚合物，是部分微生物自身分泌的一种保护荚膜。近几年的一些研究发现，γ-PGA是一种优良的细胞保护剂，可以避免食品、活细胞及生物活性物质在冷冻及解冻过程中出现变质现象。Bhat等人研究发现，γ-PGA能够提高三种益生菌(L.paracasei，B.longum，B.breve)在冷冻干燥过程中的存活率。同时，γ-PGA也是一种高效的植物生物刺激素，能显著提高作物肥料利用率，增强作物抗逆能力，提高作物产量和品质。糖蜜，又俗称桔水，具有营养物质含量高、来源广泛、生物安全性高等特性，本课题组前期研究显示可高效维持微生物菌剂活性。因此，γ-PGA和糖蜜是是微生物保护剂材料的理想选择。此外，传统水凝胶细胞载体尺寸大，不利于水凝胶内所有细胞的营养物质和代谢产物的输送，水凝胶内部的细胞会因缺氧、营养不足等因素而死亡。

[0006] 在作物的栽培过程中，各种土传病害如死苗、烂根、青枯、立枯、枯萎、根腐、茎基腐、猝倒等常常困扰农民，解决的办法多为施用农药或微生物菌剂，且因现有技术水平限制，目前市场上所售的微生物菌剂都存在有效菌数含量低，有效菌易失活等缺陷，且施用后见效比较慢。目前尚无用聚谷氨酸缓释微球包埋微生物菌剂的报道，微生物菌剂微球在防治上述农业病害的也未见报道。

发明内容

[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂，以提高有效菌的含量以及有效菌的存活时间。

[0008] 本发明还要解决的技术问题是提供上述聚谷氨酸凝胶微球菌剂的制备方法。

[0009] 本发明最后要解决的技术问题是提供上述聚谷氨酸凝胶微球菌剂的应用。

[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

[0011] 一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂，以微生物、甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸(PGA-GMA)、光引发剂和水为分散相，以十六烷和司盘80作为连续相，采用液滴微流控技术制得微球，所述微球尺寸为100-500μm之间。

[0012] 其中，所述的微生物优选为阿斯青霉菌(P.asturianum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和骆驼刺泛菌(Pantoeaalhagi)中的任意一种或几种的组合。所述的微生物更优选为阿斯青霉菌(P.asturianum)CGMCC No.17198(记载于中国专利201910324342.1)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CCTCC NO:M 2016264(记载于中国专利201610665832.4)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)CCTCC NO:M2016265(记载于中国专利201610665832.4)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CCTCC NO:M 2016266(记载于中国专利201610665832.4)、骆驼刺泛菌(Pantoeaalhagi)CGMCC NO.15525(记载于中国专利201810815380.2)中的任意一种或几种的组合。

[0013] 上述微生物发酵培养至稳定期后再用于制备菌剂。枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌由高密度发酵所得，并通过冷藏法使菌体进入芽孢形态，芽孢状态是芽孢杆菌的休眠状态，在不萌发的状态下可存活几年及至几十年。阿斯青霉菌经过固态发酵后，生理盐水洗涤，4层擦镜纸过滤，获得孢子悬浮液。骆驼刺泛菌经液体发酵后经固液分离获得菌体。

[0014] 其中，骆驼刺泛菌发酵培养条件如下：骆驼刺泛菌接种于LB培养基中活化12-24h，活化温度为25-35℃，将活化的骆驼刺泛菌接种于液体发酵培养基中，30-35℃培养36-50h得到发酵液；发酵结束后固液分离得菌体。所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-30g/L，无机盐0.01-50g/L，pH5.0-9.0。

[0015] 其中，枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌发酵培养条件如下：将斜面保存的促生菌(枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌)接种于活化培养基上，培养18-24h；挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30-35℃培养12-24h，将发酵液或发酵液浓缩液置于4℃冷库中低温处理35-55h；之后固液分离得孢子。所述活化培养基为LB培养基，配方如下：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH6.0-8.0，所述溶剂为水。所述发酵培养基的配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-40g/L，无机盐0.01-50g/L，溶剂为水，pH5.0-9.0。

[0016] 其中，阿斯青霉菌的发酵培养条件如下：阿斯青霉菌经过固态发酵后，生理盐水洗涤，4层擦镜纸过滤，获得孢子悬浮液。固态发酵培养基为混合营养物和水，所述混合营养为麦麸、木薯粉、木薯渣、秸秆中的任意一种或几种，优选为麦麸75g，秸秆25g，水80mL，培养基灭菌于20cm*40cm透气袋中固态发酵，接种量为阿斯青霉孢子悬浮液1×10720mL，发酵条件为7天，28℃。

[0017] 所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中任意一种或几种的组合；所述无机盐为硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中任意一种或几种的组合。

[0018] 其中，所述的聚谷氨酸，其分子量为50kDa-3000kDa(优选1000kDa)；所述的聚谷氨酸可以用聚谷氨酸盐替换(比如聚谷氨酸钠盐、聚谷氨酸钾盐)；所述的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸按照如下方法制备得到：将γ-聚谷氨酸溶解于水中，优选去离子水中，调节pH值为4-6(优选4.5)，然后滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯，室温搅拌溶解均匀，滴加过程中控制体系的pH值维持在4-6(优选4.5)，滴加完毕于50-70℃(优选60℃)水浴锅下搅拌反应6-10小时(优选8小时)。待反应结束后，利用透析袋室温透析3-8天(优选5天)，最后冷冻干燥即得。其中，将γ-聚谷氨酸溶解于水中，水的质量为聚谷氨酸质量的10～20倍，γ-聚谷氨酸的羧酸根和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1:1～1:5。

[0019] 其中，所述的光引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。

[0020] 分散相中，微生物有效活菌数占水的比例为107-1010cfu/mL，甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸占水的比例为1-5g/100mL，光引发剂占水的比例为0.1-0.5g/100mL；连续相中，司盘80所占体积比为1％-10％，其余为十六烷。

[0021] 当所述微生物为阿斯青霉菌(P.asturianum)时，有效活菌数以孢子数计算，优选占水的比例为1×108-1×1010cfu/mL；当所述微生物为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)时，有效活菌数以芽孢计算，优选占水的比例为1×108-1×1010cfu/mL。当所述微生物为骆驼刺泛菌(Pantoeaalhagi)时，有效活菌数以菌体计算，优选占水的比例为1×108-1×1010cfu/mL。

[0022] 上述聚谷氨酸凝胶微球菌剂的制备方法，将微生物悬浮于水中，添加甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸PBS缓冲液与光引发剂，混合均匀作为分散相；将十六烷和司盘80混匀作为连续相，通过液滴微流控技术制得单分散亚微米尺度的液滴，再通过光固化即得聚谷氨酸凝胶微球菌剂，所述微球尺寸介于100-500μm之间。

[0023] 其中，将得到的聚谷氨酸凝胶微球菌剂冻干处理。

[0024] 其中，所述的液滴微流控技术，微流控芯片的具体参数为：注射管内径为500-600μm(优选550μm)，外径为900-1000μm(优选960μm)，注射管尖端内径为30-50μm(优选40μm)，外径为40-60μm(优选50μm)；接收管内径为100-200μm(优选150μm)，外径为900-1000μm(优选960μm)；方管内径为1mm；分散相流速控制在4-8μL/min(优选6μL/min)，连续相流速控制在
20-40μL/min(优选30μL/min)。

[0025] 其中，光固化条件为：将通过液滴微流控技术收集的液体置于可见光源下，固化1-3min。

[0026] 最终制备的聚谷氨酸凝胶微球菌剂中，有效活菌数≥6×108CFU/mL(优选≥6×109CFU/mL)。

[0027] 微流控技术技术是在微通道(数十到数百微米)内精确操控和处理微尺度流体的技术，不仅可以精准地控制单个乳化液滴的大小和结构，同时具有极高的比表面积，其高效传质传热特性有效避免了微胶囊形成过程中产生的热量对菌剂活性的影响。基于此，本专利利用微流控技术，拟从自然环境生防菌株及分泌物协同促进植物生长抗逆机制出发，以γ-PGA为主体壁材，微生物菌剂为芯材，利用液滴微流控技术构建γ-聚谷氨酸/微生物仿生核壳结构微胶囊，通过调控微流控通道参数制备尺寸均一、分散性良好、结构稳定的微胶囊菌肥，长效保护微胶囊内微生物活性，解决微生物肥料在生产、保存和应用过程中货架期短难题。

[0028] 上述聚谷氨酸凝胶微球菌剂在肥料、饲料或食品领域中的应用也在本发明的保护范围之内。优选的是，聚谷氨酸凝胶微球菌剂作为肥料在植物抗病促生、土壤解磷、提高农作物产量、提高土壤肥力、增强农作物抗逆性中任意一种或几种的应用。

[0029] 所述聚谷氨酸凝胶微球菌剂可与传统化学肥料以及农药配合使用，也可作为菌肥直接施用；将聚谷氨酸凝胶微球菌剂加水稀释10-1000倍，通过水培、喷施或灌根处理农作物。本发明的聚谷氨酸凝胶微球菌剂，具有高活性生物功能，利于功能菌株在土壤中的快速定殖和缓释，能够有效防治多种作物病害，减少化学农药和化肥的使用量，有效的结合了生物防治和化学防治，取长补短，实现了作物防治一体，省时又省力。

[0030] 所述农作物为粮食作物(例如水稻、小麦、玉米等)、蔬菜类作物(例如青菜、番茄、辣椒等)或瓜果类作物(例如草莓、葡萄、甜瓜、黄瓜等)。

[0031] 有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：

[0032] (1)聚谷氨酸缓释微球在聚谷氨酸凝胶微球菌剂中为抗病促生菌提供荚膜保护，并使芽孢杆菌形成生物薄膜系统，达到一种稳定平衡态，使其处于芽孢状态；聚谷氨酸由微生物发酵产生，由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过谷氨酰胺键均聚而成，具有无毒、生物可降解和环境友好等优点，具有提高植物对养分的吸收等功效。

[0033] (2)当聚谷氨酸凝胶微球菌剂被稀释施用时，聚谷氨酸又可为促生菌的生长提供营养，促进促生菌的快速增殖；聚谷氨酸的凝胶微球有利于保持有益菌的活力，大大延长了聚谷氨酸凝胶微球菌剂的货架期，使聚谷氨酸凝胶微球菌剂中的有益菌的活菌数量在24个月内维持≥6×109CFU/mL。

[0034] (3)本发明中所述的五种微生物，施加到农作物中能改善作物根系微生物群落结构，增加土壤中有益微生物数量，能够改良土壤结构、提高土壤肥力，防止土壤板结，能够提高作物产量，增强作物抗盐、抗病、抗寒等抗逆能力。附图说明

[0035] 图1聚谷氨酸凝胶微球菌剂的制备示意图。

[0036] 图2 显微镜下不含微生物的聚谷氨酸凝胶微球。

[0037] 图3显微镜下含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球。

[0038] 图4不同分子量聚谷氨酸对含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂缓释时间的影响。

[0039] 图5四种不同包埋技术对P.asturianum悬浮孢子液有效活菌数的影响。

[0040] 图6四种采用聚谷氨酸凝胶微球包埋菌剂有效活菌数随时间的变化。

具体实施方式

[0041] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

[0042] 以下实施例使用的微流控芯片的具体参数为：注射管内径为550μm，外径为960μm，注射管尖端内径为40μm，外径为50μm；接收管内径为150μm，外径为960μm；方管内径为1mm。

[0043] 实施例1聚谷氨酸缓释微球(不含微生物)的制备

[0044] 取1g(7.8mmol羧酸根)γ-聚谷氨酸(分子量2000kDa)溶于20mL去离子水中，搅拌充分溶解后，用稀盐酸(0.1wt％浓度)调节γ-聚谷氨酸溶液的pH值为4.5。然后，缓慢滴加1.02ml(7.8mmol)甲基丙烯酸缩水甘油酯室温搅拌溶解均匀，滴加过程中用稀盐酸(0.1％浓度)控制反应溶液的pH值维持在4.5，于60℃水浴锅下搅拌反应8小时。待反应结束后，利用3500Da分子截留量的透析袋室温透析5天，最后冷冻干燥得到白色絮状的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸固体。

[0045] 在十六烷中加入司盘80充分搅拌作为连续相，其中，司盘80占连续相总体积的5％。取制得的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸固体溶于去离子水，并加入光引发剂苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐充分搅拌作为分散相，甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸的占比为2g/100mL，光引发剂的占比为0.5g/100mL。

[0046] 将两相分别吸入型号相同的注射器中，分别固定在两台型号相同的蠕动泵上，注射器与芯片的管道之间用PE管连接。开启分散相机械泵，溶液被缓慢推进微通道装置，调整连续相流速为20μL/min，分散相流速为4μL/min，确保管道中形成稳定的微球。将液滴收集至离心管中，用可见光照射2-3min，直至聚谷氨酸凝胶微球完全固化(图1-2)。微球尺寸大概在400μm。

[0047] 实施例2阿斯青霉菌的发酵

[0048] 按如下步骤制备本发明所述微生物菌剂：

[0049] 其中，阿斯青霉菌的发酵培养条件如下：阿斯青霉菌CGMCC No.17198经过固态发酵后，生理盐水洗涤，4层擦镜纸过滤，获得孢子悬浮液。固态发酵培养基为混合营养物和水，所述混合营养为麦麸、木薯粉、木薯渣、秸秆中的任意一种或几种，优选为麦麸75g，秸秆25g，水80mL，培养基灭菌于20cm*40cm透气袋中固态发酵，接种量为阿斯青霉孢子悬浮液1×107 20mL，发酵条件为7天，28℃。用无菌水洗下孢子制成孢子悬浮液，经血球计数板计
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数，孢子悬液中孢子数为1×10～1×10CFU/mL。

[0050] 实施例3骆驼刺泛菌、枯草芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的发酵[0051] 将4℃斜面保存的骆驼刺泛菌CGMCC NO.15525接种于茄形培养瓶培养基(即活化培养基)上，30℃培养16h。挑取活化培养基上的菌种，接种于发酵培养基中，30℃，培养40h，将发酵液或者发酵液浓缩液置于4℃冷库中低温处理48h，经平板涂布测定，骆驼刺泛菌发酵液中的活菌数量可达到1×1010CFU/mL以上。所述茄形培养瓶中的培养基为LB培养基；发酵培养基组分为：蔗糖50g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 8g/L，蛋白胨8g/L，pH为6.0-9.0。

[0052] 将4℃斜面保存的枯草芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016264、胶冻样芽孢杆菌CCTCCNO:M 2016265、解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO:M 2016266活化，分别接种于茄形培养瓶培养基(即活化培养基)上，30℃培养18h。将长好的菌种分别转移至发酵培养基中，30℃培养24h后，将发酵液置于4℃冷库中低温处理48h，经平板涂布测定，每种微生物发酵液中的活菌数量可达到1×1010CFU/mL以上。所述茄形培养瓶中的培养基为LB培养基，发酵培养基组分为：葡萄糖
50g/L，蛋白胨10g/L，(NH4)2SO4 0.05g/L，NaCl1g/L，MnSO4·4H2O 0.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，pH为6.0-9.0。

[0053] 以上所述的生产罐的发酵培养过程中无菌空气的通气量为0.6vvm，搅拌速度为220rpm。

[0054] 实施例4含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂制备

[0055] 在含有光引发剂的聚谷氨酸(分子量1000kDa)溶液中加入2％实施例2得到的8
P.asturianum菌剂，微生物有效活菌数占水的比例为10cfu/mL，甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸占水的比例为3g/100mL，光引发剂占水的比例为0.3g/100mL；连续相中，司盘80所占体积比为5％，其余为十六烷。重复制备聚谷氨酸凝胶微球的操作，制得含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂，其中活菌数约为107cfu/mL。(图3)。

[0056] 实施例5不同分子量聚谷氨酸对含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂缓释时间的影响

[0057] 聚谷氨酸分子量大小是影响微球缓释的一个重要因素。以实施例4包埋菌剂制备工艺为例，其中不同的是选用分子量分别为50kDa、100kDa、500kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa的聚谷氨酸作为微球载体，制成粒径为200μm的P.asturianum微球，在25℃进行缓释实验并采用平板计数法计数。结果见图4。

[0058] 通过实验得出结论，聚谷氨酸分子量越小，P.asturianum微球释放有效活菌数更快；分子量越大，微球释放有效活菌数越慢。50kDa分子量的聚谷氨酸制成的微球缓释时间最短，1000kDa聚谷氨酸缓释微球制成的复合微生物菌剂缓释微球缓释速率可以满足于不同作物以及不同生长阶段的需求，施用该菌剂第一天可以释放达到30％，足以在作物土壤中建立该菌株的优势菌株，并可以缓释达到15天。

[0059] 实施例6不同粒径P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂稳定性比较

[0060] 在含有光引发剂的聚谷氨酸(分子量1000kDa)溶液中加入2％实施例2得到的P.asturianum菌剂，微生物有效活菌数占水的比例为108cfu/mL，甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰的γ-聚谷氨酸占水的比例为3g/100mL，光引发剂占水的比例为0.5g/100mL；连续相中，司盘80所占体积比为5％，其余为十六烷。

[0061] 将两相分别吸入型号相同的注射器中，重复聚谷氨酸凝胶微球的操作，制备不同粒径的微球菌剂，其相关工艺如下：

[0062] (1)连续相流速为30μL/min，分散相流速为3μL/min，微球尺寸大概在100μm。

[0063] (2)连续相流速为30μL/min，分散相流速为6μL/min，微球尺寸大概在400μm。

[0064] (3)连续相流速为30μL/min，分散相流速为15μL/min，微球尺寸大概在500μm。

[0065] 将两相分别吸入型号相同的注射器中，分别开启分散相机械泵，溶液被缓慢推进混合管道，调整连续相流速和分散相流速，确保管道中形成稳定的凝胶球。将液滴收集至离心管中，用可见光照射5min，直至聚谷氨酸凝胶微球完全固化。具体相关工艺如下：

[0066] (1)连续相流速为1mL/min，分散相流速为0.2mL/min，凝胶球尺寸大概在300mm。

[0067] (2)连续相流速为1mL/min，分散相流速为0.1mL/min，凝胶球尺寸大概在100mm。

[0068] 将不同尺寸的凝胶球分别与生理盐水中静置3个月，期间每周取样观察，发现尺寸100mm和300mm的凝胶球在7天就出现了部分团聚，经过细胞死活染色，发现尺寸100mm和
300mm的凝胶球中包埋的P.asturianum在第28天死细胞占30％以上，而100μm，400μm和500μm尺寸的凝胶微球3个月始终保持稳定的球形胶囊结构，活细胞不低于85％，利用微流控技术制备的100μm-500μm凝胶微球稳定性显著增强。

[0069] 实施例7含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂可开放保存长达24个月[0070] 本实施例中所用的菌剂如下所示：

[0071] (1)将实施例2中阿斯青霉菌悬浮孢子液稀释至有效活菌数为7×108cfu/mL，作为菌剂1；

[0072] (2)将实施例2中阿斯青霉菌悬浮孢子液稀释至有效活菌数为7×108cfu/mL并用壳聚糖和三聚磷酸钠包埋(技术来源：[中国发明,中国发明授权]CN201510565088.6一种微生物复合菌剂及其制备方法和应用)，作为菌剂2；

[0073] (3)将实施例2中阿斯青霉菌悬浮孢子液稀释至有效活菌数为7×108cfu/mL，用十二烷基硫酸钠、三聚磷酸钠和海藻酸钠三者形成的复合的凝固浴A包埋(技术参考：CN201710892119.8一种多层包埋微胶囊的制备方法)，作为菌剂3；

[0074] (4)将实施例4制备的菌剂作为菌剂4。

[0075] 将上述4种菌剂置于25℃，相对湿度40％的环境下储藏，每隔2个月各取1mL菌剂，稀释108倍，涂布固体LB培养基中，置于32℃环境下，培养18-24h，利用平板计数法获取有效活菌数量，连续取样26个月。设三组平行实验，不同菌剂中有效活菌数随时间变化如图5所示。

[0076] 由图5可知，菌剂1、菌剂2、菌剂3有效活菌数≥6×107CFU/mL分别能维持10个月、16个月、18个月，菌剂4的有效活菌数量在24个月前均达到≥6×107CFU/mL的水平。由此可见，本专利保护的聚谷氨酸凝胶微球菌剂的有效期可长达24个月，优于常用的海藻酸钠和壳聚糖包埋处理。

[0077] 实施例8聚谷氨酸凝胶微球对不同菌剂有效期的影响

[0078] 本实施例中所用的菌剂如下所示：

[0079] (1)本实施例中对实施例3中骆驼刺泛菌稀释至7×108cfu/mL，参照实施例4的方法用聚谷氨酸凝胶微球进行包埋，作为菌剂a；

[0080] (2)本实施例中对实施例3中胶冻样芽孢杆菌稀释至7×108cfu/mL，参照实施例4的方法用聚谷氨酸凝胶微球进行包埋，作为菌剂b；

[0081] (3)本实施例中对实施例3中解淀粉芽孢杆菌稀释至7×108cfu/mL，参照实施例4的方法用聚谷氨酸凝胶微球进行包埋，作为菌剂c；

[0082] (4)本实施例中对实施例3中枯草芽孢杆菌稀释至7×108cfu/mL，参照实施例4的方法用聚谷氨酸凝胶微球进行包埋，作为菌剂d；

[0083] 将上述4种菌剂置于25℃，相对湿度40％的环境下储藏，每隔2个月各取1mL菌剂，稀释108倍，涂布固体LB培养基中，置于32℃环境下，培养18-24h，利用平板计数法获取有效活菌数量，连续取样26个月。设三组平行实验，不同菌剂中有效活菌数随时间变化如图6所示。

[0084] 由图6可知，菌剂a有效活菌数量≥5×107CFU/mL维持18个月，菌剂b、菌剂c、菌剂d有效活菌数均能达到24个月的标准且均达到≥6×107CFU/mL的水平。由此可见，聚谷氨酸凝胶微球可有效延长微生物菌剂的较高有效活菌数的保存时间。

[0085] 实施例9含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂可以减少化肥的施用

[0086] 本实施例中的含P.asturianum的聚谷氨酸凝胶微球菌剂选用实施例4制备菌剂。以盆栽黄瓜为实验对象，试验设3个处理，每个处理3次重复，其中处理1为试验对照普通肥料，处理2为普通肥料+聚谷氨酸凝胶微球菌剂，处理3为减施40％质量的普通肥料+聚谷氨酸凝胶微球菌剂。所施加的肥料为每千克土150mg，聚谷氨酸凝胶微球菌剂的用量为每千克土0.2mL，结果见表2。

[0087] 表2聚谷氨酸凝胶微球菌剂对盆栽黄瓜生长特性及产量的影响

[0088]

[0089] 本发明中含P.asturianum的聚谷氨酸凝胶微球菌剂与肥料混施，能够促进黄瓜根部的发育，使根增粗、增大，对黄瓜植株株高、地下部鲜重、地上部鲜重都有明显的促进作用，总鲜重可增加26.9％。当减施40％质量的肥料时，依然可以对黄瓜产量提高11.5％，这说明本发明中聚谷氨酸、生物有机质、促生菌剂的聚谷氨酸凝胶微球菌剂可以促进植物生长，并且有效的减少化肥的使用量。

[0090] 实施例10含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂可以减少农药的施用[0091] 本实施例中的含P.asturianum的聚谷氨酸凝胶微球菌剂制备选用实施例4制备菌剂。以盆栽小青菜为实验对象，试验设3个处理，每个处理3次重复，其中处理1为试验硝钠·萘乙酸，处理2为硝钠·萘乙酸+聚谷氨酸凝胶微球菌剂，处理3为减施40％体积的硝钠·萘乙酸+聚谷氨酸凝胶微球菌剂。所施加的农药为每千克土喷施2000倍液50ml，聚谷氨酸凝胶微球菌剂的用量为每千克土0.2mL，结果见表3。

[0092] 表3含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂对盆栽小青菜生长特性及产量的影响[0093]

[0094] 本发明中含P.asturianum的聚谷氨酸凝胶微球菌剂与肥料混施，能够促进小青菜根部以及叶片的发育，使根增粗、叶片增大，对小青菜植株株高、地下部鲜重、地上部鲜重都有明显的促进作用，可增产26.9％。当减施40％质量的肥料时，依然可以对小青菜产量提高13.2％，这说明本发明中聚谷氨酸凝胶微球菌剂可以促进植物生长，并且有效的减少化学农药的使用量。

[0095] 实施例11含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂显著防治植物病害

[0096] 本实施例中含P.asturianum的聚谷氨酸凝胶微球菌剂选用实施例4制备菌剂。以盆栽草莓为实验对象，试验共设四个处理，每个处理设置3个平行。处理T1为对照组，先后加入等量蒸馏水，处理T2为先添加等量蒸馏水，Fusariun oxysporun 105/mL孢子悬浮液侵染草莓植株，处理T3为先施加等量聚谷氨酸凝胶微球菌剂稀释液，三周后加入Fusariun oxysporun 105/mL孢子悬浮液侵染草莓植株，处理T4为只添加等量聚谷氨酸凝胶微球菌剂稀释液，草莓管理为日常管理，并计算病情指数及相对防治效果。病级如下：0：未发病；1：病根数占总根数的0～25％；2:病根数占总根数的25～50％；3：病根数占总根数的50～75％；4：病根数占总根数的75～100％。根据草莓根腐病的分级标准调查各个处理草莓根腐病的病情，计算病情指数。

[0097]

[0098] 式中Z、X及N分别表示病情级数、各病级株数及调查样本总根段数；10为最高病级[0099] 根据公式计算草莓根腐病的其中DIT2是处理2的病情指数,DIT3是处理3的病情指数

[0100] 采用单因素方差分析，并进行F检验。结果见表4。

[0101] 表4含P.asturianum聚谷氨酸凝胶微球菌剂对草莓根腐病的防治作用

[0102]

[0103] 本发明中含P.asturianum的聚谷氨酸凝胶微球菌剂与肥料混施，有效抑制草莓根腐病的发病率，并能够提高草莓的产量。处理T3与处理T2相比，聚谷氨酸凝胶微球菌剂有效降低了草莓植株的患病率，从45.3％降低到了4.4％。从处理T4和T1相比可见，在正常草莓中，复合微生物菌剂缓释微球也起到了防病、促生的作用，使草莓植株鲜重提高了42.1％。试验结果表明，本发明中的聚谷氨酸凝胶微球菌剂不但可以有效防控草莓根腐病害，而且还能显著提高草莓的产量。

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一种聚谷氨酸凝胶微球菌剂及其应用

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