【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホタルなどの生物発光反応の仕組みを利用して、所望の色調の発光を得る生物発光方法及びこの方法を利用する発光遊具に関する。 本発明によれば、従来のホタルの放つ発光とは異なる色調の発光を楽しむことができるキャンドル、テーブルライト、ペンライト、イルミネーション、キャンプ用照明遊具、夜釣り用照明遊具、集魚灯、安全ロウソク、
ネオンライト、発光インク、発光ペンまたは発光塗料などの発光遊具を提供することができる。

【０００２】

【従来の技術】本特許出願人は、先にホタルなどの生物発光の仕組みを利用した発光遊具、即ちルシフェリン、
ルシフェラーゼ、ＡＴＰおよび金属塩の４成分を含む組合せからなり、かつ４成分が液体状態で同時で含まれることがない組合せからなる発光遊具を開発し、特許出願した（特願平８−３５４６６６、同９−９００１８）。
しかしながら、その発光の色調は、ルシフェラーゼの放つ発光に依存しており、所望の色調の発光を期待することはできない。 従来、発光の色調を変える方法としては、特許登録第２６６６５６１、発明の名称：「変異型ホタルシシフェラーゼ、変異型ホタルルシフェラーゼ遺伝子、新規な組換体ＤＮＡ及び変異型ホタルルシフェラーゼの製造法」が僅かに知られているに過ぎず、この方法を利用しても、所望の色調、微妙な色調の発光を期待することは殆ど不可能であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ホタルなどの生物発光反応の仕組みを利用して、所望の色調の発光を得る発光方法及びこの方法を利用する発光遊具を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、生物発光反応系に、着色料を添加含有させたところ、所望の色調の発光が得られることを知り、この知見に基づいて本発明を完成した。

【０００５】即ち、（１）本発明は、生物発光反応系に着色料を添加し、発光の色調を変化させることを特徴とする生物発光方法であり、（２）また本発明は、生物発光試薬と着色料との組合せを特徴とする発光遊具である。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。 先ず、本発明の生物発光反応系に用いる生物発光試薬としては、少なくともルシフェリン、ルシフェラーゼおよびＡＴＰの３成分を含む組合せからなる。

【０００７】この発光試薬は、マグネシシウムイオン、
カルシウムイオンを含有する水に溶解することにより発光反応が開始される。

【０００８】ここにおいて用いるルシフェリンとしては、ルシフェリン、ルシフェリン誘導体及びルシフェリン前駆体などが挙げられる。

【０００９】ルシフェリン誘導体としては、Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−硫酸塩（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−Ｏ−ｓ
ｕｌｐｈａｔｅ）、Ｄ−ルシフェリン メチルエステル（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅ
ｒ）、Ｄ−ルシフェリン−Ｏ−リン酸塩（Ｄ−ｌｕｃｉ
ｆｅｒｉｎ−Ｏ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｄ−ルシフェリン−Ｌ−フェニルアラニン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ
−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、Ｄ−ルシフェリン−Ｌ−Ｎα−アルギニン（Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ−
Ｌ−Ｎα−ａｒｇｉｎｉｎｅ）などが挙げられる。

【００１０】ルシフェリン前駆体としては、２−シアノ−６−メトキシベンゾチアゾール（２−Ｃｙａｎｏ−６
−ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌ）、Ｄ−システインなどが挙げられる。

【００１１】また、ルシフェラーゼとしては、ルシオラ・クルシアタ（Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ）、
ルシオラ・ラテラリス（Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａ
ｌｉｓ）、ルシオラ・ミングレリカ（Ｌｕｃｉｏｌａ
ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ）、ランピリス・ナクティルカ（Ｌａｍｐｙｒｉｓ ｎａｃｔｉｌｕｃａ）、フォティナス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉ
ｓ）、フォチュリス・ペンシルバニカ（Ｐｈｏｔｕｒｉ
ｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ）、ホタリア・パルブーラ（Ｈｏｔａｒｉａ ｐａｒｖｕｌａ）、ピロコエリア・ミヤコ（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ ｍｉｙａｋｏ）、
ピロホラス・プラギオフタラムス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕ
ｓ ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）などの甲虫類（コレオプテラＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ）由来のルシフェラーゼ、あるいはこれらのルシフェラーゼ及び変異ルシフェラーゼを遺伝子組換法で製造したもの、及びその他の非甲虫類由来のルシフェラーゼなどが挙げられる。

【００１２】また、ＡＴＰとは、ＡＴＰ、その塩及びＡ
ＴＰ生成反応系を意味する。 ＡＴＰ生成反応系としては、ホスホエノールピルビン酸とＡＤＰをピルベートキナーゼで触媒して生成させる方法、及びクレアチンリン酸とＡＤＰをクレアチンキナーゼで触媒して生成させる方法、その他の方法が挙げられる。

【００１３】また本発明において用いる着色料としては、色素、発色剤（蛍光発色剤を含む）、絵の具などが挙げられる。 色素としては、食用赤色３号（濃桃色）、
同１０２号（濃紅色）、食用黄色５号（黄色）、食用緑色３号（青緑色）、食用青色１号（青色）、同２号（群青色）、βカロチン色素（山吹色）、パプリカ色素（朱色）、パプリカ色素（橙色）、クチナシ黄色素（レモン色）、アナトー色素（濃橙色）、アナトー色素（オレンジ色）、ベリー類色素（レッドワイン色）、カカオ色素（濃茶色）、コウリャン色素（淡茶色）、シソニン色素（紫色）、コチニール色素（ロゼワイン色）、銅クロロフィリンナトリウム（緑色）、モナスカス色素（赤紫色）、モナスカス黄色素（蛍光レモン色）、クチナシ青色素（濃群青色）、ＢＶ１４ ＭＡＧＥＮＴＡ ｐｄｒ
（大松産業社製、赤色）、Ｓｕｍｉｎｏｌ Ｍｉｌｌｉ
ｎｇ Ｇｒｅｅｎ Ｇ（住友化学社製、緑色）など、また絵の具としては、水彩の絵の具などが挙げられる。 これらは、生物発光反応液中において、濃度０．００００
１〜３．０（Ｗ／Ｖ）％、特に０．００１〜１．０（Ｗ
／Ｖ）％が好ましい。

【００１４】なお、本発明においては、上記の成分の他に、緩衝剤、酵素安定剤などを含むことができる。

【００１５】緩衝剤とは、発光反応溶液をルシフェラーゼの至適ｐＨの範囲に保持するものが好適であり、グリシン−ＮａＯＨ緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤など任意の緩衝剤が挙げられる。 この緩衝剤（緩衝液）を添加すると、発光が著しく持続する効果を奏する。

【００１６】酵素安定剤としては、シュークロースなどの糖類及びグリセロールなどが挙げられる。 この酵素安定剤を添加すると、発光が著しく持続する効果を奏する。

【００１７】このようにして、生物発光反応系に、着色料を添加することにより、所望の色調の発光色が得られる。

【００１８】この発光色を利用すると、各種の発光遊具例えば、クリスマスや誕生日などのパーティー、テーブルライト、結婚披露宴のキャンドルサービス、各種装飾用キャンドル、シャンパンタワー様の演出、イルミネーション、ネオンライトとして、またキャンプの照明、夜釣り時の照明遊具として、また集魚灯として、また安全ロウソク、ペンライトとして好適に用いることができる。 さらに発光イング、発光ペン、発光塗料としても好適に用いることができる。

【００１９】上記、夜釣り時の照明遊具としては、つり糸、つり針（疑似針を含む）、おもり、うき、つり竿などの釣具であって、水中を全体的あるいは局部的（スポット的）に明るく照明する場合などが挙げられる。 また集魚灯としては、魚類が光に集まる性質（走光性）を利用して、漁獲能率を高めることを目的としたもので、発光遊具そのものを水中で利用する場合が挙げられる。 水中で利用する場合としては、１）本発明の液体、固体、
あるいは粉末状の発光遊具を、そのままで、または水透過性あるいは水不透過性の袋状包装体に封入した後、海中、河川、湖沼などの水生動物（イカ、タコ、えびなどの軟体動物および魚類など）の餌（疑似餌・天然、合成あるいは半合成の餌・まき餌など）あるいは養魚用の餌、の内部に注入するか、埋没させるか、餌全体に混和するか、あるいは該餌の表面に塗布する（付着させる）
かして該餌自体を発光させる方法及び２）該発光遊具を、該餌、釣り針などに隣接して、近い位置に保持して、該餌、釣り針などの付近を明るく保持する方法などが挙げられる。 これらは魚の種類に応じて、また魚の好みの色に発光させることが可能となる。

【００２０】以下実施例を示して本発明をより具体的に説明する。

【実施例】実施例１ 結婚披露宴のキャンドルサービス用として好適な発光遊具の調製例 （１）Ａ溶液（ｐＨ７．５）（５０ｍｌ） 蒸留水に以下の４成分をそれぞれ所定濃度となるように添加溶解し、Ａ溶液を調製した。 ルシフェリン ０．７ｍＭ ルシフェラーゼ（キッコーマン社製） ０．６ｍｇ／
ｍｌ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）０．２Ｍ シュクロース（酵素安定剤） ３０ｍＭ （２）Ｂ溶液（ｐＨ７．５）（５０ｍｌ） 蒸留水に以下の３成分をそれぞれ所定濃度となるように添加溶解し、Ｂ溶液を調製した。 ＡＴＰ ５．３ｍＭ 硫酸マグネシウム ４０ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）０．２Ｍ 上記Ａ溶液に、食用青色１号（東京化成工業株式会社）
を０．０１（Ｗ／Ｖ）％となるように溶解した溶液を、
容量２００ｍｌの無色透明なワイングラスに注いだ。 次いで、これにＢ溶液を注いだところ、直ちにあざやかな青緑色の放光が開始された。

【００２１】実施例２ テーブルライトとして好適な発光遊具の調製例 上記実施例１で調製したＡ溶液に、着色料ＢＶ１４ Ｍ
ＡＧＥＮＴＡ ｐｄｒ（大松産業社製）を０．００４
（Ｗ／Ｖ）％となるように溶解した溶液を、容量２００
ｍｌの無色透明なワイングラスに注いだ。 次いで、これにＢ溶液を注いだところ、直ちにあざやかなオレンジ色の放光が開始された。 また、上記着色料の添加料（濃度）を変えることにより、オレンジ色と赤色の中間色や、オレンジ色と黄色の中間色の光に変化させることができることが判明した。

【００２２】実施例３ パーティー用として好適な発光遊具の調製例 実施例１で調製したＡ溶液に、Ｓｕｍｉｎｏｌ Ｍｉｌ
ｌｉｎｇ ＧｒｅｅｎＧ（住友化学社製）を０．００５
（Ｗ／Ｖ）％となるように溶解した溶液を、容量２００
ｍｌの無色透明なワイングラスに注いだ。 次いで、Ｂ溶液を注いだところ、直ちにあざやかな淡黄緑色の放光が開始された。

【００２３】 実施例４ 集魚灯として好適な発光遊具の調製例 トリス−コハク酸緩衝液 ０．１５Ｍ ルシフェラーゼ（キッコーマン社製） ０．３ｍｇ ＡＴＰ ８ｍＭ ルシフェリン ３．６ｍＭ デキストリン（賦形剤） ５（Ｗ／Ｖ）％ カルボキシメチルセルロース（結合剤） ２（Ｗ／Ｖ）％ ＥＤＴＡ（金属キレート剤） ２５ｍＭ 食用青色１号（着色料、東京化成工業社製） １０ｍｇ 上記成分を蒸留水１００ｍｌに溶かし、ｐＨを７．５に調整した。 この溶液は、発光遊具としての目的を満たすのに十分な金属塩を含んでおらず、実際は殆ど発光しない。 この溶液に、１ｃｍ角のセルロースキューブ（商品名マイクロキューブ）を浸し、十分に溶液を吸着させた後凍結乾燥した。 このセルロースキューブに硫酸マグネシウムを振りかけたのち、０．１ｍｌを水を添加したところ、鮮やかな緑色に発光した。

【００２４】 実施例５ 生物発光によるイルミネーションとして好適な発光遊具の調製例 トリス−コハク酸緩衝液 ０．１５Ｍ ルシフェラーゼ（キッコーマン社製） ０．３ｍｇ ＡＴＰ ８ｍｇ ルシフェリン ３．６ｍＭ デキストリン（賦形剤） ５（Ｗ／Ｖ）％ カルボキシメチルセルロース（結合剤） ２（Ｗ／Ｖ）％ ＥＤＴＡ（金属キレート剤） ２５ｍＭ 上記成分を蒸留水１００ｍｌに溶かし、ｐＨを７．５に調整した溶液を、溶液ＹＥとした。 この溶液ＹＥを４つの区分に分け、第１区分には着色料を添加せずそのままとし（溶液ＹＥという、溶液は無色透明）、第２区分には食用青色１号（東京化成工業社製）を０．０１％となるように添加溶解し（溶液ＢＬという、溶液は淡い青色）、第３区分にはＢＶ１４ ＭＡＧＥＮＴＡ ｐｄｒ
（大松産業社製）を０．００４（Ｗ／Ｖ）％添加溶解し（溶液ＲＥという、溶液は淡い赤色）、そして第４区分にはＳｎｍｉｎｏｌ Ｍｉｌｌｉｎｇ Ｇｒｅｅｎ Ｇ
（住友化学社製）を０．００５（Ｗ／Ｖ）％となるように添加溶解し（溶液ＧＲという、溶液は淡い緑色）、４
種類の発光試薬溶液を調製した。 これらの溶液ＹＥ、溶液ＢＬ、溶液ＲＥ、溶液ＧＲに、布を浸し、十分に溶液を吸収させた後凍結乾燥した。 これらの凍結乾燥した布で、ドライフラワーを作成した。 このドライフラワーに、マグネシウムを含有させた水を吸収させると、花びらが黄色、青緑色、オレンジ色及び淡黄緑色に発光し、
いままでに無い発光遊具を得ることができた。