一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法
专利汇可以提供一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种利用恶性胸腔积液分离培养原代 肿瘤 细胞的方法。包括：胸腔积液样本置于样本收集液，离心弃上清；加入红细胞裂解液去除红细胞，加入PBS缓冲液洗涤细胞，离心弃上清；用KL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶中于 培养箱 中培养。当 细胞增殖 至85%以上的丰度时，PBS缓冲液洗涤细胞，胰酶-EDTA消化，终止液中和消化反应；离心收集细胞，用KL培养基重悬细胞，按比例将细胞接种于细胞瓶里传代培养。本发明的方法分离培养所得的胸腔积液原代肿瘤细胞可用于生理学、药学、以及新药研发等方面的相关研究，探索 肺 癌相关 疾病 的致病机理、对不同药物的药敏检测，抗癌药物的筛选、新药研发以及针对患者的个性化 治疗 方案 的制定。，下面是一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法专利的具体信息内容。
1.一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）、胸腔积液原代肿瘤细胞分离、接种：
（a）取1支50mL离心管（已灭菌），加入8～10mL的样本收集液用来收集胸腔积液；
（b）收集病人的胸腔积液样本至上述离心管中，一般每管可收集30mL胸腔积液，建议每个病人收集2～3管，冷藏条件下运输至细胞培养室；
（c）1000～1500rmp离心，时间为4～5min，离心弃掉上清，若观察离心管内的细胞沉淀收集不好，可适当延长离心时间；
（d）加入细胞沉淀量6～10倍体积的红细胞裂解液去除红细胞，轻轻混匀，室温放置，中间可适当晃动，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（e）如果发现红细胞仍然较多，可以重复上述步骤（d）一次；
（f）加入10～15mL的PBS缓冲液洗涤1～2次，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（g）用1 mL KL培养基重悬沉淀，根据沉淀量接种细胞，然后接种1～3个T25的培养瓶，每瓶补充培养基到7mL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养；
(2)、胸腔积液原代肿瘤细胞的换液：
（a）细胞培养24h后，在显微镜下观察，若漂浮细胞较多，吸掉培养基，用不含钙镁离子的PBS缓冲液轻轻的洗1～2次，更换新的KL培养基继续培养；实验操作时动作要轻柔；
（b）培养过程2～4天更换培养基，注意观察培养基颜色，若变黄则需要更换新的胸腔积液原代肿瘤细胞培养基继续培养；
所述样本收集液为含2%青/链霉素和100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液；所述培养基KL的成分包括：DMEM与Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine），5-20μM Y-27632、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、5-20 ng/ml激活素A（Activin A）以及5-10ng Adenine，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
2.根据权利要求1所述的方法培养的胸腔积液原代肿瘤细胞的传代培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1) 胸腔积液原代肿瘤细胞的传代
（a）待权利要求1所述的方法培养的胸腔积液原代肿瘤细胞融合度达85%以上即可消化传代，弃掉旧的培养基；
（b）用PBS缓冲液润洗细胞去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，操作步骤一定要动作轻柔；
（c）加入1mL 0.05%胰酶-EDTA，37℃孵育1～3min消化，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍，细胞未见变圆也可拍下；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，室温1000rmp，离心4min弃上清；
（f）用KL培养基重悬细胞，以1/3～1/2的比例传代，培养基补至7mL;
(2)上述(1)中胸腔积液原代肿瘤细胞的冻存方法，包括如下步骤：
（a）待细胞融合度达85%以上，弃旧培养基；
（b）动作轻柔地用PBS缓冲液润洗细胞以去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次；
（c）加入0.6ml，0.05%胰酶-EDTA消化，轻柔晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍（注意：细胞未见变圆也可拍下）；37℃孵育1～3min；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，1000rmp，4min离心弃上清；
（f）用冻存液重悬细胞沉淀，按照一定的比例将细胞悬液置于冻存管中；冻存液的配方比例优选为90%胎牛血清（FBS）+10%DMSO；
（g）将冻存管移至冻存盒内，置于-80℃冰箱，后移放至液氮永久保存。
3.权利要求1或2的方法制备的原代肿瘤细胞在以下方面的应用：
（1）筛选抗肿瘤药物；
（2）药敏检测。
一种利用恶性胸腔积液分离培养原代肿瘤细胞的方法
技术领域
背景技术
发明内容
（1）、胸腔积液原代肿瘤细胞分离、接种：
（a）取1支50mL离心管（已灭菌），加入8～10mL的样本收集液用来收集胸腔积液；
（b）收集病人的胸腔积液样本至上述离心管中，一般每管可收集30mL胸腔积液，建议每个病人收集2～3管，冷藏条件下运输至细胞培养室；
（c）1000～1500rmp离心，时间为4～5min，离心弃掉上清，若观察离心管内的细胞沉淀收集不好，可适当延长离心时间；
（d）加入细胞沉淀量6～10倍体积的红细胞裂解液去除红细胞，轻轻混匀，室温放置，中间可适当晃动，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（e）如果发现红细胞仍然较多，可以重复上述步骤（d）一次；
（f）加入10～15mL的PBS缓冲液洗涤1～2次，1000～1500rmp离心，时间为4～5min，弃上清；
（g）用1 mL KL培养基重悬沉淀，根据沉淀量接种细胞，然后接种1～3个T25的培养瓶，每瓶补充培养基到7mL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
（b）培养过程2～4天更换培养基，注意观察培养基颜色，若变黄则需要更换新的胸腔积液原代肿瘤细胞培养基继续培养；
所述样本收集液为含2%青/链霉素和100μg/mL制菌霉素的PBS缓冲液；所述培养基KL的成分包括：DMEM与Ham’s F-12 NUTRIENT MIX按体积比3:1混合的培养基，同时添加4-6％胎牛血清、1-3nM三碘甲状腺氨酸（triiodothyronine），5-20μM Y-27632、9-11ng/mL表皮生长因子、0.3-0.5μg/mL氢化可的松、0.5-1.5nM霍乱毒素、5-20 ng/ml激活素A（Activin A）以及5-10ng Adenine，上述培养基需经0.22μm孔径滤膜过滤。
（a）待上述胸腔积液原代肿瘤细胞融合度达85%以上即可消化传代，弃掉旧的培养基；
（b）用PBS缓冲液润洗细胞去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，操作步骤一定要动作轻柔；
（c）加入1mL0.05%胰酶-EDTA，37℃孵育1～3min消化，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍（注意：细胞未见变圆也可拍下）；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，室温1000rmp，离心4min弃上清；
（f）用KL培养基重悬细胞，以1/3～1/2的比例传代，培养基补至7mL;
(2)上述(1)中胸腔积液原代肿瘤细胞的冻存方法，包括如下步骤：
（a）待细胞融合度达85%以上，弃旧培养基；
（b）动作轻柔地用PBS缓冲液润洗细胞以去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次；
（c）加入0.6ml，0.05%胰酶-EDTA消化，轻柔晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍（注意：细胞未见变圆也可拍下）；37℃孵育1～3min；
（d）当90%细胞从培养瓶脱落后加入1-2mL终止液终止；
（e）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶将瓶中剩余细胞一同洗下，1000rmp，4min离心弃上清；
（f）用冻存液重悬细胞沉淀，按照一定的比例将细胞悬液置于冻存管中；冻存液的配方比例优选为90%胎牛血清（FBS）+10%DMSO;
（g）将冻存管移至冻存盒内，置于-80℃冰箱，后移放至液氮永久保存。
（2）本发明提供的传代培养方法，优点在于提供了一种优化培养基，可以在整个培养过程中优化上皮细胞的培养条件，让其在成分复杂恶性胸腔积液细胞中作为优势种群显著提高细胞数量和活性，使其集落形成数量增多，改善以往其他原代胸腔积液肿瘤细胞培养方法培养时肿瘤细胞生长缓慢，肿瘤细胞集落形成少的情况；
（3）本发明提供的传代培养方法，优点在于提供的优化培养基已减少甚至剔除利于成纤维细胞的配方及成分，使成纤维细胞的增殖受到抑制，因此可以排除其对上皮来源的恶性胸腔积液肿瘤细胞造成的细胞污染，解决胸腔积液原代肿瘤细胞培养失败最主要的难题；
（4）本发明提供的分离和传代培养方法，短期内扩增早代胸腔积液肿瘤细胞并让其稳定生长，成功建立了来源于癌症病人的胸腔积液原代肿瘤细胞药敏检测模型，可用于癌症病人个性化治疗的药物筛选以及抗癌新药的研发。
附图说明
图3是不同病人的胸腔积液原代肿瘤细胞生长曲线图；
图4是来源于病人1的胸腔积液原代肿瘤细胞对不同抗癌药物的药敏检测图；
图5是来源于病人2的胸腔积液原代肿瘤细胞对不同抗癌药物的药敏检测图。
具体实施方式
（2）收集病人的胸腔积液样本至上述离心管中，每管可收集30mL胸腔积液，每个病人收集2管，冷藏条件下运输至细胞培养室；
（3）离心1000rmp，5min，弃掉上清；
（4）加入5mL的红细胞裂解液去除红细胞，轻轻混匀，室温放置5min，中间可适当晃动，离心1000rmp，5min弃上清；
（5）加入15mL的PBS缓冲液洗涤2次，离心1000rmp，4min弃上清；
（6）用1mL的KL培养基重悬细胞沉淀，接种细胞于T25的培养瓶中培养，将培养基补至
7mL，放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
（2）用PBS缓冲液润洗细胞以去除阻碍胰酶消化的细胞分泌物，洗涤2次，注意动作要轻柔；
（3）加入1ml，0.05%的胰酶-EDTA于37℃孵育2min，轻轻晃动细胞培养瓶，使消化液铺满整个细胞层后，轻拍；
（4）当90%细胞从培养瓶脱落后加入2mL含10%胎牛血清的PBS终止液终止消化反应；
（5）将终止消化的细胞悬液全部转移至15mL离心管中，用PBS缓冲液润洗培养瓶1次，离心弃上清；
（6）用1mL的KL培养基重悬细胞，按照1:2的比例传代，补足培养基至6mL。
（2）胸腔积液原代肿瘤细胞消化离心种板时，重复实例2（2）～（5）操作步骤；
（3）用KL培养基制备成单细胞悬液，台盼蓝与细胞悬液1:1混匀细胞计数仪检测细胞数量与活力，每孔200μL细胞悬液接种于96孔板，细胞数为6000个/孔，每日设置12个复孔，放入37℃CO2培养箱分别培养1～7天；
（4）每日移去板内溶液，每孔加入含有10μLCKK-8检测试剂的无血清DMEM培养基100μL；
（5）在37℃CO2细胞培养箱继续孵育1.5h，酶标仪在450nm处测定的吸光度；
（6）所有数据经统计软件GraphPad Prism7进行统计学分析和作图，输出并保存图形和数据，由实验结果可知，胸腔积液原代肿瘤细胞短期内增殖较快，适宜大量扩增（如图3）。
（2）次日吸去孔内溶液加药，病人1来源的胸腔积液原代肿瘤细胞设置靶向单药组埃克替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、奥希替尼和联用组顺铂+多西他赛、顺铂+吉西他滨、顺铂+培美曲塞和顺铂+紫杉醇处理细胞，病人2来源的胸腔积液原代肿瘤细胞设置靶向单药组色瑞替尼、克唑替尼和联用组顺铂+多西他赛、顺铂+培美曲塞、卡铂+多西他赛和卡铂+培美曲塞处理细胞，每孔加入200μL含不同浓度药物的培养基。设置合理药物浓度梯度，各个药物实验组的各个梯度均设置6个复孔，同时设置细胞对照组（同体积细胞培养基替代）及空白对照组（同体积PBS缓冲液替代）每组设置6个复孔。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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