技术领域
[0001] 本
发明涉及农药制备技术领域,尤其涉及一种新型工程菌制备
生物农药的方法。
背景技术
[0002] 众所周知,农药是确保农业丰收的重要保证,但
化学农药污染程度高,环境危害大,破坏生态平衡,在农副产品中含有高毒性、高残留给人类生命造成直接威胁,也形成了全球公害。但为了达到农业高产,必须向
农作物喷洒大量的化学
杀虫剂。
[0003] 在
现有技术中大多数农药都是由化学原料制成,虽然能杀死农作物上的
害虫,但是其产生的残留物也会对人体造成严重的损害,还会影响
土壤,使土地
碱化,污染了环境,严重的还会破坏生态平衡。
发明内容
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点,而提出的一种新型工程菌制备生物农药的方法。
[0005] 为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:一种新型工程菌制备生物农药的方法,该新型工程菌制备生物农药的方法如下:
第一步、准备一定数量比例的金龟子绿僵菌、苏
云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌,用做制备菌种;
第二步、对实验用品先进行消毒,后用无菌
水擦拭用品表面,然后培养金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌所需的固体培养基,过程要执行严格的进行无菌操作;
第三步、固体培养基制备完成后,将保藏斜面的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌分别放入四个培养基内,进行菌种活化,需要进行30℃-40℃的
温度控制,然后培养1-3天,过程要执行严格的进行无菌操作;
第四步、进行菌种的培养,待四个活化斜面的菌种长好以后,分别挑取单菌落转接至装有液体培养基的100ml三
角瓶内,在25℃下摇床培养,转速为120r/min,并培养8-24小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第五步、进行菌种的
发酵,将四个培养好的菌种分别接种于装有液体培养基的500ml的三角瓶内,在30℃下摇床培养,转速为140r/min,并培养8-20小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第六步、配制金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌混合物所需的发酵培养基;
第六步、进行四种不同菌种的混合发酵,将金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌得到的菌种按照
质量百分比进行菌种的混合,将混合后的菌种
混合液接种于发酵培养基中,并将培养基放置于
发酵罐中,进行发酵,控制ph值为5-7,接种数量为2%-6%,在温度25℃的环境下培养2-4天,即得到生物农药组合物。
[0006] 优选地,所述金龟子绿僵菌是一种广谱性的杀虫
真菌,由昆虫体壁进行主动入侵而感染不同昆虫,在昆虫血腔中可进行
酵母状繁殖,产生大量虫菌体,同时可产生破坏素等
杀虫毒素,抑制昆虫免疫、
加速杀虫。在昆虫寄主不存在时,金龟子绿僵菌还可与
植物根部形成
根际共生关系而进行长期宿存,所述苏云金杆菌是包括许多变种的一类产晶体的芽孢杆菌,该菌可产生两大类毒素,即内毒素和外毒素,害虫取食后,在肠道碱性消化液作用下,菌体释放毒素,害虫中毒并停止取食,最后害虫因饥饿和血液及神经中毒死亡,用于防治直翅目、鞘翅目、
双翅目、膜翅目,特别是鳞翅目的多种害虫,所述嗜酸乳杆菌主要存在小肠中,释放乳酸,乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素,所述多粘类芽孢杆菌 在农业中的应用主要体现在两个方面,一是作为
微生物肥料促进植物的生长和增产,二是作为生物农药防治植物多种病害,所述菌种的质量百分比为:金龟子绿僵菌15%-35%,苏云金杆菌20%-45%,多粘类芽孢杆菌18%-32%,嗜酸乳杆菌13%-24%。
[0007] 优选地,所述实验用品的消毒应在试验前进行消毒,大型器材用消毒剂(75%
乙醇溶液)擦拭表面,1分钟后用无菌水冲洗,自然干燥,其他实验用品应当在洗净后用纸包好,放入压
力蒸汽灭菌器120℃灭菌20分钟方可使用。
[0008] 优选地,所述无菌操作是指在无菌室中进行以防止微
生物污染供试菌的操作技术,执行无菌操作前,先戴帽子、口罩、洗手,并将手擦干,注意空气和环境清洁,将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭,操作过程中保证操作空间与外界隔离,避免微生物的侵入。
[0009] 优选地,所述固体培养基为在含量
葡萄糖0.5%-8%,蛋白胨0.3%-6%,生物素0.02%-0.06%,玉米浆0.3%-6%,
牛肉膏0.3%-6%配制的所述液体培养基(培养基中各种成分的含量均为重量体积百分比,即g/100ml)中加入1.5% 2.0%左右的琼脂,加热至100℃溶解,40℃下~
冷却并
凝固,使其成为固体状态即为固体培养基。
[0010] 优选地,所述
温度控制,应当把培养基放入恒温水浴锅中,来达到控制温度的效果。
[0011] 优选地,所述摇床培养使用恒温培养摇床进行,可以更好的控制培养温度,达到更好的培养效果。
[0012] 优选地,所述发酵培养基为为葡萄糖 60-75g/L、
蔗糖25- 75g/L、乳
酪蛋白胨0.4-2.8g/L、KH2PO41~4.5g/L、尿素1.5 -4.5g/L、K2HPO4 8-16g/L、MgSO4·7H2O 8-16g/L、NaCl4-18g/L、(NH4)2SO44-18g/L,其余为蒸馏水。
[0013] 优选地,所述发酵罐主要用来培养发酵各种菌体,
密封性要好(防止菌体被污染)罐体当中有搅拌桨,用于发酵过程当中不停的搅拌,底部通气的Sparger,用来通入菌体生长所需要的空气或
氧气。
[0014] 本发明提供的一种新型工程菌制备生物农药的方法,通过制备生物农药的方法,来消灭危害农作物的害虫,避免了使用化学农药所产生的有害物质,保护了人体的健康,对环境和动植物也做出了保护,间接性的保护了生态环境。
具体实施方式
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体
实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
[0016] 实施例1:一种新型工程菌制备生物农药的方法,该新型工程菌制备生物农药的方法如下:第一步、准备一定数量比例的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌,用做制备菌种;
第二步、对实验用品先进行消毒,后用无菌水擦拭用品表面,然后培养金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌所需的固体培养基,过程要执行严格的进行无菌操作;
第三步、固体培养基制备完成后,将保藏斜面的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌分别放入四个培养基内,进行菌种活化,需要进行30℃-40℃的温度控制,然后培养1-3天,过程要执行严格的进行无菌操作;
第四步、进行菌种的培养,待四个活化斜面的菌种长好以后,分别挑取单菌落转接至装有液体培养基的100ml三角瓶内,在25℃下摇床培养,转速为120r/min,并培养8-24小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第五步、进行菌种的发酵,将四个培养好的菌种分别接种于装有液体培养基的500ml的三角瓶内,在30℃下摇床培养,转速为140r/min,并培养8-20小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第六步、配制金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌混合物所需的发酵培养基;
第六步、进行四种不同菌种的混合发酵,将金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌得到的菌种按照质量百分比进行菌种的混合,将混合后的菌种混合液接种于发酵培养基中,并将培养基放置于发酵罐中,进行发酵,控制ph值为5-7,接种数量为2%-6%,在温度25℃的环境下培养2-4天,即得到生物农药组合物。
[0017] 金龟子绿僵菌是一种广谱性的杀虫真菌,由昆虫体壁进行主动入侵而感染不同昆虫,在昆虫血腔中可进行酵母状繁殖,产生大量虫菌体,同时可产生破坏素等杀虫毒素,抑制昆虫免疫、加速杀虫。在昆虫寄主不存在时,金龟子绿僵菌还可与植物根部形成根际共生关系而进行长期宿存,所述苏云金杆菌是包括许多变种的一类产晶体的芽孢杆菌,该菌可产生两大类毒素,即内毒素和外毒素,害虫取食后,在肠道碱性消化液作用下,菌体释放毒素,害虫中毒并停止取食,最后害虫因饥饿和血液及神经中毒死亡,用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目,特别是鳞翅目的多种害虫,所述嗜酸乳杆菌主要存在小肠中,释放乳酸,乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素,所述多粘类芽孢杆菌 在农业中的应用主要体现在两个方面,一是作为微
生物肥料促进植物的生长和增产,二是作为生物农药防治植物多种病害,所述菌种的质量百分比为:金龟子绿僵菌15%-35%,苏云金杆菌20%-45%,多粘类芽孢杆菌18%-32%,嗜酸乳杆菌13%-24%。
[0018] 实验用品的消毒应在试验前进行消毒,大型器材用消毒剂(75%乙醇溶液)擦拭表面,1分钟后用无菌水冲洗,自然干燥,其他实验用品应当在洗净后用纸包好,放入压力蒸汽灭菌器120℃灭菌20分钟方可使用。
[0019] 无菌操作是指在无菌室中进行以防止微生物污染供试菌的操作技术,执行无菌操作前,先戴帽子、口罩、洗手,并将手擦干,注意空气和环境清洁,将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭,操作过程中保证操作空间与外界隔离,避免微生物的侵入。
[0020] 固体培养基为在含量葡萄糖0.5%-8%,蛋白胨0.3%-6%,生物素0.02%-0.06%,玉米浆0.3%-6%,牛肉膏0.3%-6%配制的所述液体培养基(培养基中各种成分的含量均为重量体积百分比,即g/100ml)中加入1.5% 2.0%左右的琼脂,加热至100℃溶解,40℃下冷却并凝~固,使其成为固体状态即为固体培养基。
[0021] 温度控制,应当把培养基放入恒温水浴锅中,来达到控制温度的效果。
[0022] 摇床培养使用恒温培养摇床进行,可以更好的控制培养温度,达到更好的培养效果。
[0023] 发酵培养基为为葡萄糖 60-75g/L、蔗糖25- 75g/L、乳酪蛋白胨0.4-2.8g/L、KH2PO41~4.5g/L、尿素1.5 -4.5g/L、K2HPO4 8-16g/L、MgSO4·7H2O 8-16g/L、NaCl4-18g/L、(NH4)2SO44-18g/L,其余为蒸馏水。
[0024] 发酵罐主要用来培养发酵各种菌体,密封性要好(防止菌体被污染)罐体当中有搅拌桨,用于发酵过程当中不停的搅拌,底部通气的Sparger,用来通入菌体生长所需要的空气或氧气。
[0025] 实施例2:一种新型工程菌制备生物农药的方法,该新型工程菌制备生物农药的方法如下:第一步、准备一定数量比例的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌,用做制备菌种;
第二步、对实验用品先进行消毒,后用无菌水擦拭用品表面,然后培养金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌所需的固体培养基,过程要执行严格的进行无菌操作;
第三步、固体培养基制备完成后,将保藏斜面的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌分别放入四个培养基内,进行菌种活化,需要进行30℃-40℃的温度控制,然后培养1-3天,过程要执行严格的进行无菌操作;
第四步、进行菌种的培养,待四个活化斜面的菌种长好以后,分别挑取单菌落转接至装有液体培养基的100ml三角瓶内,在25℃下摇床培养,转速为120r/min,并培养8-24小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第五步、进行菌种的发酵,将四个培养好的菌种分别接种于装有液体培养基的500ml的三角瓶内,在30℃下摇床培养,转速为140r/min,并培养8-20小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第六步、配制金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌混合物所需的发酵培养基;
第六步、进行四种不同菌种的混合发酵,将金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌得到的菌种按照质量百分比进行菌种的混合,将混合后的菌种混合液接种于发酵培养基中,并将培养基放置于发酵罐中,进行发酵,控制ph值为5-7,接种数量为2%-6%,在温度25℃的环境下培养2-4天,即得到生物农药组合物。
[0026] 金龟子绿僵菌是一种广谱性的杀虫真菌,由昆虫体壁进行主动入侵而感染不同昆虫,在昆虫血腔中可进行酵母状繁殖,产生大量虫菌体,同时可产生破坏素等杀虫毒素,抑制昆虫免疫、加速杀虫。在昆虫寄主不存在时,金龟子绿僵菌还可与植物根部形成根际共生关系而进行长期宿存,所述苏云金杆菌是包括许多变种的一类产晶体的芽孢杆菌,该菌可产生两大类毒素,即内毒素和外毒素,害虫取食后,在肠道碱性消化液作用下,菌体释放毒素,害虫中毒并停止取食,最后害虫因饥饿和血液及神经中毒死亡,用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目,特别是鳞翅目的多种害虫,所述嗜酸乳杆菌主要存在小肠中,释放乳酸,乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素,所述多粘类芽孢杆菌 在农业中的应用主要体现在两个方面,一是作为微生物肥料促进植物的生长和增产,二是作为生物农药防治植物多种病害,所述菌种的质量百分比为:金龟子绿僵菌15%-35%,苏云金杆菌20%-45%,多粘类芽孢杆菌18%-32%,嗜酸乳杆菌13%-24%。
[0027] 实验用品的消毒应在试验前进行消毒,大型器材用消毒剂(75%乙醇溶液)擦拭表面,1分钟后用无菌水冲洗,自然干燥,其他实验用品应当在洗净后用纸包好,放入压力蒸汽灭菌器120℃灭菌20分钟方可使用。
[0028] 无菌操作是指在无菌室中进行以防止微生物污染供试菌的操作技术,执行无菌操作前,先戴帽子、口罩、洗手,并将手擦干,注意空气和环境清洁,将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭,操作过程中保证操作空间与外界隔离,避免微生物的侵入。
[0029] 固体培养基为在含量葡萄糖0.6%-9%,蛋白胨0.3%-6%,生物素0.02%-0.06%,玉米浆0.3%-6%,牛肉膏0.3%-6%配制的所述液体培养基(培养基中各种成分的含量均为重量体积百分比,即g/100ml)中加入1.5% 2.0%左右的琼脂,加热至100℃溶解,40℃下冷却并凝~固,使其成为固体状态即为固体培养基。
[0030] 温度控制,应当把培养基放入恒温水浴锅中,来达到控制温度的效果。
[0031] 摇床培养使用恒温培养摇床进行,可以更好的控制培养温度,达到更好的培养效果。
[0032] 发酵培养基为为葡萄糖 60-75g/L、蔗糖25- 75g/L、乳酪蛋白胨0.4-2.8g/L、KH2PO41~4.5g/L、尿素1.5 -4.5g/L、K2HPO4 8-16g/L、MgSO4·7H2O 8-16g/L、NaCl4-18g/L、(NH4)2SO44-18g/L,其余为蒸馏水。
[0033] 发酵罐主要用来培养发酵各种菌体,密封性要好(防止菌体被污染)罐体当中有搅拌桨,用于发酵过程当中不停的搅拌,底部通气的Sparger,用来通入菌体生长所需要的空气或氧气。
[0034] 实施例3:一种新型工程菌制备生物农药的方法,该新型工程菌制备生物农药的方法如下:第一步、准备一定数量比例的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌,用做制备菌种;
第二步、对实验用品先进行消毒,后用无菌水擦拭用品表面,然后培养金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌所需的固体培养基,过程要执行严格的进行无菌操作;
第三步、固体培养基制备完成后,将保藏斜面的金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌分别放入四个培养基内,进行菌种活化,需要进行30℃-40℃的温度控制,然后培养1-3天,过程要执行严格的进行无菌操作;
第四步、进行菌种的培养,待四个活化斜面的菌种长好以后,分别挑取单菌落转接至装有液体培养基的100ml三角瓶内,在25℃下摇床培养,转速为120r/min,并培养8-24小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第五步、进行菌种的发酵,将四个培养好的菌种分别接种于装有液体培养基的500ml的三角瓶内,在30℃下摇床培养,转速为140r/min,并培养8-20小时,过程要执行严格的进行无菌操作;
第六步、配制金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌混合物所需的发酵培养基;
第六步、进行四种不同菌种的混合发酵,将金龟子绿僵菌、苏云金杆菌、嗜酸乳杆菌、多粘类芽孢杆菌得到的菌种按照质量百分比进行菌种的混合,将混合后的菌种混合液接种于发酵培养基中,并将培养基放置于发酵罐中,进行发酵,控制ph值为5-7,接种数量为2%-6%,在温度25℃的环境下培养2-4天,即得到生物农药组合物。
[0035] 金龟子绿僵菌是一种广谱性的杀虫真菌,由昆虫体壁进行主动入侵而感染不同昆虫,在昆虫血腔中可进行酵母状繁殖,产生大量虫菌体,同时可产生破坏素等杀虫毒素,抑制昆虫免疫、加速杀虫。在昆虫寄主不存在时,金龟子绿僵菌还可与植物根部形成根际共生关系而进行长期宿存,所述苏云金杆菌是包括许多变种的一类产晶体的芽孢杆菌,该菌可产生两大类毒素,即内毒素和外毒素,害虫取食后,在肠道碱性消化液作用下,菌体释放毒素,害虫中毒并停止取食,最后害虫因饥饿和血液及神经中毒死亡,用于防治直翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目,特别是鳞翅目的多种害虫,所述嗜酸乳杆菌主要存在小肠中,释放乳酸,乙酸和一些对有害菌起作用的抗菌素,所述多粘类芽孢杆菌 在农业中的应用主要体现在两个方面,一是作为微生物肥料促进植物的生长和增产,二是作为生物农药防治植物多种病害,所述菌种的质量百分比为:金龟子绿僵菌15%-35%,苏云金杆菌20%-45%,多粘类芽孢杆菌18%-32%,嗜酸乳杆菌13%-24%。
[0036] 实验用品的消毒应在试验前进行消毒,大型器材用消毒剂(75%乙醇溶液)擦拭表面,1分钟后用无菌水冲洗,自然干燥,其他实验用品应当在洗净后用纸包好,放入压力蒸汽灭菌器120℃灭菌20分钟方可使用。
[0037] 无菌操作是指在无菌室中进行以防止微生物污染供试菌的操作技术,执行无菌操作前,先戴帽子、口罩、洗手,并将手擦干,注意空气和环境清洁,将操作空间中的细菌和病毒等微生物杀灭,操作过程中保证操作空间与外界隔离,避免微生物的侵入。
[0038] 固体培养基为在含量葡萄糖0.8%-10%,蛋白胨0.3%-6%,生物素0.02%-0.06%,玉米浆0.3%-6%,牛肉膏0.3%-6%配制的所述液体培养基(培养基中各种成分的含量均为重量体积百分比,即g/100ml)中加入1.5% 2.0%左右的琼脂,加热至100℃溶解,40℃下冷却并凝~固,使其成为固体状态即为固体培养基。
[0039] 温度控制,应当把培养基放入恒温水浴锅中,来达到控制温度的效果。
[0040] 摇床培养使用恒温培养摇床进行,可以更好的控制培养温度,达到更好的培养效果。
[0041] 发酵培养基为为葡萄糖 60-75g/L、蔗糖25- 75g/L、乳酪蛋白胨0.4-2.8g/L、KH2PO41~4.5g/L、尿素1.5 -4.5g/L、K2HPO4 8-16g/L、MgSO4·7H2O 8-16g/L、NaCl4-18g/L、(NH4)2SO44-18g/L,其余为蒸馏水。
[0042] 发酵罐主要用来培养发酵各种菌体,密封性要好(防止菌体被污染)罐体当中有搅拌桨,用于发酵过程当中不停的搅拌,底部通气的Sparger,用来通入菌体生长所需要的空气或氧气。