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蛋白检测方法及蛋白检测 试剂盒

阅读：480发布：2020-05-14

专利汇可以提供蛋白检测方法及蛋白检测试剂盒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及新的蛋白检测方法、以及相应的蛋白检测试剂盒。具体而言，本发明涉及改良的双缩脲比色法，通过采用直链烷基硫酸钠和氢氧化钠的水溶液作为试剂A，并采用硫酸铜或水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠的水溶液作为试剂B，从而能够适用于对含有溶解性差的蛋白的样品中的蛋白含量进行快速、准确的测定。同时，本发明所述的蛋白检测试剂盒具有配制简单、成本低廉和保质期长等优点。，下面是蛋白检测方法及蛋白检测试剂盒专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种蛋白检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备试剂A和试剂B：使直链烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为45-
100mM和150-300mM，得到所述试剂A；将硫酸铜或水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中至摩尔浓度分别为5-10mM、15-30mM和150-750mM，得到所述试剂B；
(2)制备样品：使用不含蛋白的水或者缓冲液作为空白样品；将牛血清白蛋白溶于水或缓冲液中，并对所述蛋白的浓度进行调整，从而得到蛋白浓度处于0.2mg/mL-30mg/mL范围内的一系列溶液，作为标准蛋白样品；将含蛋白的待测原料分散于或溶于水或缓冲液中，并通过任选的稀释处理制成待测样品；
(3)将所述步骤(1)中制备的试剂A分别与所述步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品、待测样品等体积混合，得到相应的试剂A混合物，其中，所述待测样品的试剂A混合物中的蛋白含量符合线性范围的要求，将各试剂A混合物在温度为90-100℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；
(4)将所述步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别与所述步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，并将各试剂B混合物在温度为50-70℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；
(5)对所述步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤，以所述步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定所述步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度；
(6)根据所述步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用如下的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过如下的方程式(ii)计算得出所述步骤(2)中所述的待测样品中的蛋白含量：
(i)标准蛋白样品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；
(ii)待测样品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×2×D，其中，K、C为拟合常数，D＝所述步骤(2)中制备待测样品时的稀释倍数。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为10、11、12、13、14、15和16的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为11、12和13的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述直链烷基硫酸钠为选自如下物质中的一种或多种：正癸基硫酸钠、正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠、正十四烷基硫酸钠、正十五烷基硫酸钠、正十六烷基硫酸钠。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述直链烷基硫酸钠为选自于由正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠所组成的组中的一种或多种。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂A中的直链烷基硫酸钠的摩尔浓度为55mM-80mM。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂A中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-220mM。
8.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂B中的硫酸铜的摩尔浓度为5.5mM-8.0mM。
9.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂B中的酒石酸钠的摩尔浓度为19mM-25mM。
10.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂B中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-300mM。
11.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述含蛋白的待测原料为动、植物工业原料或衍生品。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述动、植物工业原料或衍生品为玉米、小麦、大豆、玉米粉、面粉、大豆蛋白、玉米黄粉、玉米朊、酒糟饲料、牛肉粒或它们的任意混合物。
13.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述含蛋白的待测原料为未经提纯处理的含蛋白原料。
14.如权利要求13所述的方法，其中，将所述未经提纯处理的含蛋白原料进行粉碎，然后分散于水或缓冲液中，使用高速剪切机在3000rpm-10000rpm下处理15-60秒后，通过任选的稀释处理制成待测样品。
15.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述缓冲液选自磷酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液。
16.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(3)中，所述水浴的温度为95-100℃。
17.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(3)中，将所述试剂A混合物在水浴中加热5-20min。
18.如权利要求17所述的方法，其中，将所述试剂A混合物在水浴中加热8-15min。
19.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(4)中，将所述步骤(3)中得到的各试剂A混合物以1:3.6-7.2的体积比分别与所述步骤(1)中制备的试剂B混合。
20.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(4)中，所述水浴的温度为55-65℃。
21.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(4)中，将所述试剂B混合物在水浴中加热15-30min。
22.如权利要求21所述的方法，其中，将所述试剂B混合物在水浴中加热18-25min。
23.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(5)中，使用0.45μm的滤器对所述步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤。
24.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(5)中，当所述冷却后的待测样品的试剂B混合物中含有干扰比色测定结果的脂质时，在过滤前将石油醚与所述冷却后的待测样品的试剂B混合物进行混合、震荡和离心，从而得到脱脂待测样品。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述离心在800g-5000g下进行20s-10min。
26.如权利要求24所述的方法，其中，所述石油醚与所述冷却后的待测样品的试剂B混合物以1:1-20的体积比混合。
27.如权利要求1或2所述的方法，其中，在所述步骤(5)中，所述吸光度采用吸光度检测仪器进行测定。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述吸光度检测仪器为可见光分光光度计、紫外-可见光分光光度计或具有可见光检测器的设备。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述具有可见光检测器的设备为酶标仪。

说明书全文

蛋白检测方法及蛋白检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及利用生化方法对食品、饲料等中的蛋白进行检测的方法及相应的蛋白检测试剂盒。

背景技术

[0002] 天然动、植物中的蛋白依其溶解特性，一般可分为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白四大类。其中，只有清蛋白具有良好的水溶性，其它三种蛋白只有在盐、醇、稀酸和/或碱的存在下才能溶于水相。并且，食品或饲料原料中的蛋白还常常由于加工过程中的加热处理或化学反应等操作而在结构和溶解性方面发生变化，造成其溶解性进一步变差。

[0003] 《食品安全国家标准GB5009.5-2010--食品中蛋白质的检测》以及《GB/T 6432-1994--饲料中粗蛋白检测方法》中公开的蛋白检测方法主要包括：凯氏定氮法(第一法)、分光光度法(第二法)和燃烧法(第三法)。其中，前两种方法均需先将蛋白消化分解，再通过滴定或显色方法测定所产生的氨的含量，并进一步通过换算得出蛋白总量。所述第一法使用最为广泛，然而由于采用消化步骤和蒸馏步骤，检测所需时间较长(一般为2-4小时)。就所述第二法而言，虽然总体检测时间相对缩短，但由于仍需存在消化步骤(耗时约1小时或更长)，使用该方法进行检测仍然不够快捷。燃烧法是一种较新的快速蛋白检测方法，该方法通过使样品在高温下燃烧生成氮气，从而测定蛋白总量，然而该方法所需设备及日常消耗成本均较高，且样品检测通量较低，对于大批量的蛋白样品检测并不适用。

[0004] 除了上述中国国家标准中描述的检测方法，生化实验室中还常采用双缩脲法、BCA法、考马斯亮蓝法、Lowry法和紫外吸收法等生化检测方法来测定蛋白含量。这些方法通过在化学显色后进行比色或者直接进行比色来检测纯度较高的蛋白样品中的蛋白含量，而无需消化步骤，因此，能够显著缩短检测时间。然而，上述方法均要求样品中的蛋白充分溶解，并且要求显色体系澄清、对光路无干扰。此外，上述方法还存在如下缺点：例如，考马斯亮蓝法对测试样品中的蛋白分子大小有更多限制；紫外吸收法基于蛋白中的芳香族氨基酸残基在280nm下的光吸收值进行检测，由于不同蛋白中的芳香族氨基酸的含量不同，该方法的检测准确性和专一性不好；同时，对于传统的双缩脲法、BCA法和Lowry法而言，并不适用于对含有溶解性差的醇溶蛋白和谷蛋白的谷物样品以及大部分动、植物工业衍生品中的蛋白含量进行检测。而且，待测样品体系中存在的淀粉、脂类以及纤维等成分也会影响上述实验室方法的检测准确度。

[0005] 因此，上述实验室方法很难达到国家标准中对蛋白含量检测的准确度要求。对于溶解性差的蛋白，虽然可以通过添加大量的变性剂(如尿素、胍盐或十二烷基硫酸钠)来增高溶解度。然而，这些变性剂并不能与双缩脲法、BCA法和Lowry法兼容。经典的双缩脲试剂主要由硫酸铜、酒石酸钾钠和氢氧化钠等组成，为了解决钾与十二烷基硫酸盐反应形成沉淀以及碘所引起的双缩脲试剂不稳定的问题，Watters C.提出了主要由硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠等组成的改良双缩脲试剂，其中，1L该改良试剂中含有1.5g的CuSO4·5H2O、4.9g的Na2C4H4O6·2H2O和7.5g的NaOH，测定样品中的蛋白含量时，将0.5mL含2％(w/v)去污剂的可溶的样品加入至2.5mL改良双缩脲试剂中(参见Watters C.，1978年，A one-step biuret assay for protein in the presence of detergent，Analytical Biochemistry，88(2):695-8)。也就是说，Watters C.所提出的改良双缩脲试剂可与十二烷基硫酸钠(2％，w/v)相兼容，然而该方法符合Lambert-Beer定律的线性范围较窄(待测样品中的蛋白浓度需满足
0.4-8mg/mL)，这增高了待测样品稀释重测的工作量。此外申请人经实验验证发现，采用Watters C.改良双缩脲试剂对如玉米、小麦等谷物及其工业衍生品中的蛋白含量进行测定时，虽然该试剂中含有更高浓度的十二烷基硫酸钠，但是仍然存在由于比色液混浊而无法直接测定其中的蛋白含量的问题，而在除去不溶物质后，样品通过显色得到的测定结果往往与通过凯氏定氮法得到的检测结果之间差距很大(相对标准偏差RSD>40％)。

[0006] 因此，本领域迫切需要开发出既能够保证测定结果准确度，同时还具有测定所需时间短、适用测定对象范围宽(尤其是能够直接用于对含有难溶蛋白的样品中的蛋白含量进行测定)等优点的蛋白检测方法、以及相应的蛋白检测试剂盒。

发明内容

[0007] 本发明人通过研究首次发现，通过采用特定浓度的直链烷基硫酸钠与氢氧化钠预先混合，并对待测蛋白样品进行两次特定的加热，从而能够明显提高难溶蛋白等各种蛋白样品的溶解度，并能够改善待测样品的澄清度，使得对该待测样品进行的吸光度测量更加准确，从而减小测量偏差。

[0008] 因此，在一方面，本发明提供了一种蛋白检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

[0009] (1)制备试剂A和试剂B：使直链烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为45-100mM和150-300mM，得到所述试剂A；将硫酸铜或水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中至摩尔浓度分别为5-10mM、15-30mM和150-750mM，得到所述试剂B；

[0010] (2)制备样品：使用不含蛋白的水或者缓冲液作为空白样品；将牛血清白蛋白溶于水或缓冲液中，并对该蛋白的浓度进行调整，从而得到蛋白浓度处于0.2mg/mL-30mg/mL范围内的一系列溶液，作为标准蛋白样品；将含蛋白的待测原料分散于或溶于水或缓冲液中，并通过任选的稀释处理制成待测样品；

[0011] (3)将步骤(1)中制备的试剂A分别与步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品、待测样品等体积混合，得到相应的试剂A混合物，其中，所述待测样品的试剂A混合物中的蛋白含量符合线性范围的要求，并将各试剂A混合物在温度为90-100℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；

[0012] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别与步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，并将各试剂B混合物在温度为50-70℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；

[0013] (5)对步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤，以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度；

[0014] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用如下的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过如下的方程式(ii)计算得出步骤(2)中所述的待测样品中的蛋白含量：

[0015] (i)标准蛋白样品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；

[0016] (ii)待测样品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×2×D，其中，K、C为拟合常数，D＝步骤(2)中制备待测样品时的稀释倍数。

[0017] 在第二方面，本发明提供了蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含试剂A和试剂B：

[0018] 其中，所述试剂A为45-100mM直链烷基硫酸钠和150-300mM氢氧化钠的水溶液；

[0019] 所述试剂B为5-10mM硫酸铜或水合硫酸铜、15-30mM酒石酸钠和150-750mM氢氧化钠的水溶液。

[0020] 具体而言，本发明可通过如下述段落[1]-[40]中的任一段所述的技术方案加以实现：

[0021] [1].一种蛋白检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

[0022] (1)制备试剂A和试剂B：使直链烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为45-100mM和150-300mM，得到所述试剂A；将硫酸铜或水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中至摩尔浓度分别为5-10mM、15-30mM和150-750mM，得到所述试剂B；

[0023] (2)制备样品：使用不含蛋白的水或者缓冲液作为空白样品；将牛血清白蛋白溶于水或缓冲液中，并对所述蛋白的浓度进行调整，从而得到蛋白浓度处于0.2mg/mL-30mg/mL范围内的一系列溶液，作为标准蛋白样品；将含蛋白的待测原料分散于或溶于水或缓冲液中，并通过任选的稀释处理制成待测样品；

[0024] (3)将所述步骤(1)中制备的试剂A分别与所述步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品、待测样品等体积混合，得到相应的试剂A混合物，其中，所述待测样品的试剂A混合物中的蛋白含量符合线性范围的要求，并将各试剂A混合物在温度为90-100℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；

[0025] (4)将所述步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别与所述步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，并将各试剂B混合物在温度为50-70℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；

[0026] (5)对所述步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤，以所述步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定所述步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度；

[0027] (6)根据所述步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用如下的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过如下的方程式(ii)计算得出所述步骤(2)中所述的待测样品中的蛋白含量：

[0028] (i)标准蛋白样品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；

[0029] (ii)待测样品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×2×D，其中，K、C为拟合常数，D＝所述步骤(2)中制备待测样品时的稀释倍数。

[0030] [2].如段落[1]所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为10、11、12、13、14、15和16的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。

[0031] [3].如段落[2]所述的方法，其中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为11、12和13的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。

[0032] [4].如段落[1]或[2]所述的方法，其中，所述直链烷基硫酸钠为选自如下物质中的一种或多种：正癸基硫酸钠、正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠、正十四烷基硫酸钠、正十五烷基硫酸钠、正十六烷基硫酸钠。

[0033] [5].如段落[1]-[4]中任一段所述的方法，其中，所述直链烷基硫酸钠为选自于由正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠所组成的组中的一种或多种。

[0034] [6].如段落[1]-[5]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂A中的直链烷基硫酸钠的摩尔浓度为55mM-80mM。

[0035] [7].如段落[1]-[6]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂A中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-220mM。

[0036] [8].如段落[1]-[7]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂B中的硫酸铜的摩尔浓度为5.5mM-8.0mM。

[0037] [9].如段落[1]-[8]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂B中的酒石酸钠的摩尔浓度为19mM-25mM。

[0038] [10].如段落[1]-[9]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(1)中，所述试剂B中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-300mM。

[0039] [11].如段落[1]-[10]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述含蛋白的待测原料为动、植物工业原料或衍生品。

[0040] [12].如段落[11]所述的方法，其中，所述动、植物工业原料或衍生品为玉米、小麦、大豆、玉米粉、面粉、大豆蛋白、玉米黄粉、玉米朊、酒糟饲料、牛肉粒或它们的任意混合物。

[0041] [13].如段落[1]-[10]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述含蛋白的待测原料为未经提纯处理的含蛋白原料。

[0042] [14].如段落[13]所述的方法，其中，将所述未经提纯处理的含蛋白原料进行粉碎，然后分散于水或缓冲液中，使用高速剪切机在3000rpm-10000rpm下处理15-60秒后，通过任选的稀释处理制成待测样品。

[0043] [15].如段落[1]-[14]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(2)中，所述缓冲液选自磷酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液、3-吗啉丙磺酸缓冲液或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液。

[0044] [16].如段落[1]-[15]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(3)中，所述水浴的温度为95-100℃。

[0045] [17].如段落[1]-[16]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(3)中，将所述试剂A混合物在水浴中加热5-20min。

[0046] [18].如段落[17]所述的方法，其中，将所述试剂A混合物在水浴中加热8-15min。

[0047] [19].如段落[1]-[18]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(4)中，将所述步骤(3)中得到的各试剂A混合物以1:(3.6-7.2)的体积比分别与所述步骤(1)中制备的试剂B混合。

[0048] [20].如段落[1]-[19]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(4)中，所述水浴的温度为55-65℃。

[0049] [21].如段落[1]-[20]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(4)中，将所述试剂B混合物在水浴中加热15-30min。

[0050] [22].如段落[21]所述的方法，其中，将所述试剂B混合物在水浴中加热18-25min。

[0051] [23].如段落[1]-[22]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(5)中，使用0.45μm的滤器对所述步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤。

[0052] [24].如段落[1]-[23]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(5)中，当所述冷却后的待测样品的试剂B混合物中含有干扰比色测定结果的脂质时，在过滤前将石油醚与所述冷却后的待测样品的试剂B混合物进行混合、震荡和离心，从而得到脱脂待测样品。

[0053] [25].如段落[24]所述的方法，其中，所述离心在800g-5000g下进行20s-10min。

[0054] [26].如段落[24]或[25]所述的方法，其中，所述石油醚与所述冷却后的待测样品的试剂B混合物以1:(1-20)的体积比混合。

[0055] [27].如段落[1]-[26]中任一段所述的方法，其中，在所述步骤(5)中，所述吸光度采用吸光度检测仪器进行测定。

[0056] [28].如段落[27]所述的方法，其中，所述吸光度检测仪器为可见光分光光度计、紫外-可见光分光光度计或具有可见光检测器的设备。

[0057] [29].如段落[28]所述的方法，其中，所述具有可见光检测器的设备为酶标仪。

[0058] [30].一种蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含试剂A和试剂B：

[0059] 其中，所述试剂A为45-100mM直链烷基硫酸钠和150-300mM氢氧化钠的水溶液；

[0060] 所述试剂B为5-10mM硫酸铜或水合硫酸铜、15-30mM酒石酸钠和150-750mM氢氧化钠的水溶液。

[0061] [31].如段落[30]所述的试剂盒，其中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为10、11、12、13、14、15和16的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。

[0062] [32].如段落[31]所述的试剂盒，其中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为11、12和13的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。

[0063] [33].如段落[30]或[31]所述的试剂盒，其中，所述直链烷基硫酸钠为选自如下物质中的一种或多种：正癸基硫酸钠、正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠、正十四烷基硫酸钠、正十五烷基硫酸钠、正十六烷基硫酸钠。

[0064] [34].如段落[30]-[33]中任一段所述的试剂盒，其中，所述直链烷基硫酸钠为选自于由正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠所组成的组中的一种或多种。

[0065] [35].如段落[30]-[34]中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂A中的直链烷基硫酸钠的摩尔浓度为55mM-80mM。

[0066] [36].如段落[30]-[35]中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂A中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-220mM。

[0067] [37].如段落[30]-[36]中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂B中的硫酸铜的摩尔浓度为5.5mM-8.0mM。

[0068] [38].如段落[30]-[37]中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂B中的酒石酸钠的摩尔浓度为19mM-25mM。

[0069] [39].如段落[30]-[38]中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂B中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-300mM。

[0070] [40].如段落[30]-[39]中任一段所述的试剂盒，其中，所述试剂盒由所述试剂A和试剂B组成。

[0071] 本发明涉及将改良的双缩脲比色法用作蛋白检测方法，从而能够适用于对含有醇溶蛋白、谷蛋白或溶解性差的其它蛋白的动、植物中的蛋白含量进行测定。

[0072] 本发明所述的蛋白检测具有如下优点：该方法本身所需要的检测时间较短，同时本发明所述方法由于使用与蛋白变性剂相兼容的改良双缩脲试剂的配方，从而增加了不溶性蛋白的溶解性。同时，通过采用特定浓度的直链烷基硫酸钠，并将其与氢氧化钠预先混合，以及通过两次特定的加热环节使绝大多数或全部蛋白变为可测定的溶解态蛋白，并且还进一步起到了澄清待测样品溶液的效果。因此，本发明的方法能够适用于更广泛范围的含蛋白原料(特别是，该方法能够适用于对含有醇溶蛋白、谷蛋白或溶解性差的其它蛋白的动、植物样品进行检测)，并得到准确的测定结果。并且，本发明所述的方法抗非蛋白成分(如淀粉、油脂、纤维等)干扰的能力强。而且，本发明所述方法得出的测定结果与采用凯氏定氮法得到的测定结果相比无显著差异，因此，本发明所述方法的整体准确性高。此外，本发明所述方法的测定结果之间的变异系数(CV)≤4％，且该方法适用的线性范围为0.1-15mg/mL，因此，本发明所述的方法具有线性范围宽、灵敏度高、精确度高和重现性好等优点。另外，本发明所述的检测方法能够与高通量测量配件和设备(如酶标板和酶标仪等)相兼容，可快速检测大批量样品，更加适用于大规模的工业过程。

[0073] 另一方面，本发明的试剂盒具有配制简单、成本低廉、保质期长(冷藏储存可达1年以上)等优点。

具体实施方式

[0074] 在本发明中，术语“室温”是指温度为22℃±2℃。

[0075] 在本发明中，术语“线性范围”是指当待测蛋白样品中的蛋白含量变化与吸光度呈数学上的线性关系时，该待测蛋白样品中的蛋白含量的变化区间。除非另有说明，本发明中所述的“线性范围”是指样品中的蛋白含量处于0.1mg/mL-15mg/mL的区间内。

[0076] 本发明的一个实施方式涉及蛋白检测方法，其中，所述方法包括如下步骤：

[0077] (1)制备试剂A和试剂B：使直链烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为45-100mM和150-300mM，得到所述试剂A；将硫酸铜或水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中至摩尔浓度分别为5-10mM、15-30mM和150-750mM，得到所述试剂B；

[0078] (2)制备样品：使用不含蛋白的水或者缓冲液作为空白样品；将牛血清白蛋白溶于水或缓冲液中，并对该蛋白的浓度进行调整，从而得到蛋白浓度处于0.2mg/mL-30mg/mL范围内的一系列溶液，作为标准蛋白样品；将含蛋白的待测原料分散于或溶于水或缓冲液中，并通过任选的稀释处理制成待测样品；

[0079] (3)将步骤(1)中制备的试剂A分别与步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品、待测样品混合，得到相应的试剂A混合物，其中，所述待测样品的试剂A混合物中的蛋白含量符合线性范围的要求，并将各试剂A混合物在温度为90-100℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；

[0080] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别与步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，并将各试剂B混合物在温度为50-70℃的水浴中加热后，取出冷却至室温；

[0081] (5)对步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤，以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度；

[0082] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用如下的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过如下的方程式(ii)计算得出步骤(2)中所述的待测样品中的蛋白含量：

[0083] (i)标准蛋白样品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；

[0084] (ii)待测样品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×2×D，其中，K、C为拟合常数，D＝步骤(2)中制备待测样品时的稀释倍数。

[0085] 其中，所述步骤(2)中制备待测样品时的稀释倍数为1表示未对该待测样品进行稀释。步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量为0.1mg/mL-15mg/mL。

[0086] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(1)中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为10、11、12、13、14、15和16的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。在本发明进一步优选的实施方式中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为11、12和13的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。在本发明特别优选的实施方式中，所述直链烷基硫酸钠例如为选自如下物质中的一种或多种：正癸基硫酸钠、正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠、正十四烷基硫酸钠、正十五烷基硫酸钠、正十六烷基硫酸钠。在本发明尤其优选的实施方式中，所述直链烷基硫酸钠为选自于由正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠所组成的组中的一种或多种。

[0087] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(1)中，所述试剂A中的直链烷基硫酸钠的摩尔浓度为55mM-80mM。在本发明的另一优选实施方式中，在上述步骤(1)中，所述试剂A中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-220mM。

[0088] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(1)中，所述试剂B中的硫酸铜的摩尔浓度为5.5mM-8.0mM。在本发明的另一优选实施方式中，在上述步骤(1)中，所述试剂B中的酒石酸钠的摩尔浓度为19mM-25mM。在本发明的又一优选实施方式中，在上述步骤(1)中，所述试剂B中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-300mM。

[0089] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(2)中，所述含蛋白的待测原料为动、植物工业原料或衍生品，例如玉米、小麦、大豆、玉米粉、面粉、大豆蛋白、玉米黄粉、玉米朊、酒糟饲料、牛肉粒或它们的任意混合物。在本发明的另一优选实施方式中，在上述步骤(2)中，所述含蛋白的待测原料为未经提纯处理的含蛋白原料。在本发明进一步优选的实施方式中，将所述未经提纯处理的含蛋白原料进行粉碎，然后分散于水或缓冲液中，使用高速剪切机在3000rpm-10000rpm下处理15-60秒后，通过任选的稀释处理制成待测样品。

[0090] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(2)中，所述缓冲液选自磷酸缓冲液(PB缓冲液)、磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)、1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液(PIPES缓冲液)、3-吗啉丙磺酸缓冲液(MOPS缓冲液)或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸缓冲液(HEPES缓冲液)。

[0091] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(3)中，所述水浴的温度为95-100℃。在本发明的另一优选实施方式中，在上述步骤(3)中，将所述试剂A混合物在水浴中加热5-20min，从而加快显色反应进程。在本发明进一步优选的实施方式中，将所述试剂A混合物在水浴中加热8-15min。

[0092] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(4)中，将步骤(3)中得到的各试剂A混合物以1:(3.6-7.2)的体积比分别与步骤(1)中制备的试剂B混合。在本发明进一步优选的实施方式中，在上述步骤(4)中，所述水浴的温度为55-65℃。在本发明的另一优选实施方式中，在上述步骤(4)中，将所述试剂B混合物在水浴中加热15-30min。在本发明进一步优选的实施方式中，将所述试剂B混合物在水浴中加热18-25min。

[0093] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(5)中，使用0.45μm的滤器对步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤。在本发明优选的实施方式中，在上述步骤(5)中，当所述冷却后的待测样品的试剂B混合物中含有干扰比色测定结果的脂质时，在过滤前将石油醚与所述冷却后的待测样品的试剂B混合物进行混合、震荡和离心，从而得到脱脂待测样品。在本发明进一步优选的实施方式中，所述离心在800g-5000g下进行20s-10min。在本发明进一步优选的实施方式中，所述石油醚与所述冷却后的待测样品的试剂B混合物以1:(1-20)的体积比混合。

[0094] 在本发明的一个优选实施方式中，在上述步骤(5)中，所述吸光度采用吸光度检测仪器进行测定。例如，吸光度检测仪器可为可见光分光光度计、紫外-可见光分光光度计或具有可见光检测器的设备(例如酶标仪)。

[0095] 在本发明的另一实施方式中，本发明涉及蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂A和试剂B，其中，所述试剂A为45-100mM直链烷基硫酸钠和150-300mM氢氧化钠的水溶液；所述试剂B为5-10mM硫酸铜或水合硫酸铜、15-30mM酒石酸钠和150-750mM氢氧化钠的水溶液。

[0096] 在本发明的一个优选实施方式中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为10、11、12、13、14、15和16的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。在本发明进一步优选的实施方式中，所述直链烷基硫酸钠选自碳原子数为11、12和13的直链烷基硫酸钠中的一种或多种。在本发明特别优选的实施方式中，所述直链烷基硫酸钠例如为选自如下物质中的一种或多种：
正癸基硫酸钠、正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠、正十四烷基硫酸钠、正十五烷基硫酸钠、正十六烷基硫酸钠。在本发明尤其优选的实施方式中，所述直链烷基硫酸钠为选自于由正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠所组成的组中的一种或多种。

[0097] 在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂A中的直链烷基硫酸钠的摩尔浓度为55mM-80mM。在本发明的另一优选实施方式中，所述试剂A中的氢氧化钠的摩尔浓度为
180mM-220mM。

[0098] 在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂B中的硫酸铜的摩尔浓度为5.5mM-8.0mM。在本发明的另一优选实施方式中，所述试剂B中的酒石酸钠的摩尔浓度为19mM-
25mM。在本发明的又一优选实施方式中，所述试剂B中的氢氧化钠的摩尔浓度为180mM-
300mM。

[0099] 在本发明的一个优选实施方式中，本发明的试剂盒由试剂A和试剂B组成。

[0100] 在采用本发明所述的方法测定蛋白质含量时，通过多次重复试验(N≥3)，基于所得到的各组数据的标准偏差和平均值，按照下式求出变异系数从而能够得出本发明所述方法的精确度：

[0101] 变异系数＝(标准偏差/平均值)×100％。

[0102] 本发明人通过研究发现，本发明所述的蛋白检测方法具有整体准确度高(与凯氏定氮法相比无显著性差异)、线性范围宽(0.1-15mg/mL)、精确度高(变异系数≤4％)等优点。

[0103] 在本发明中，除非另有说明，实施例中所采用的各设备均为本领域已知的常规设备。同时，在本发明中，除非另有说明，在制备样品时所采用的水和各种缓冲液中的蛋白含量均为0mg/mL。

[0104] 实施例

[0105] 在本发明的实施例中，除非另有说明，正癸基硫酸钠、正十一烷基硫酸钠、正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠、正十四烷基硫酸钠、正十五烷基硫酸钠、正十六烷基硫酸钠、氢氧化钠、硫酸铜、水合硫酸铜、酒石酸钠、石油醚均为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。牛血清白蛋白购自AMRESCO公司。

[0106] 在本发明实施例中，除非另有说明，玉米黄粉、玉米粉、酒糟蛋白饲料(DDGS)来自中国粮油控股有限公司，玉米朊来自美国Freeman公司，大豆蛋白来自光合生物技术有限公司，牛肉粒为实验室自制。

[0107] 在本发明的实施例中，所采用的高速剪切机为德国IKA公司的T25型产品。万能粉碎机为天津泰斯特仪器有限公司FW100型产品。

[0108] 在本发明的实施例中，所采用的凯氏定氮法根据中国国家标准《GB5009.5-2010食品中蛋白质的测定》中的相关规定进行。

[0109] 实施例1

[0110] (1)制备试剂A和试剂B

[0111] 将正十二烷基硫酸钠、正十三烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为60mM、5mM和200mM，从而获得试剂A。

[0112] 将水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中，使所得到的水溶液中的硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠的摩尔浓度分别为5mM、21mM和300mM，从而获得试剂B。

[0113] (2)制备样品

[0114] 采用蛋白含量为0mg/mL的水作为空白样品。

[0115] 将牛血清白蛋白溶于蛋白含量为0mg/mL的水中，得到蛋白含量为30mg/mL的水溶液，随后以该水溶液进一步稀释得到蛋白含量为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.2mg/mL的一系列溶液，作为标准蛋白样品。

[0116] 将1g玉米黄粉样品分散于70mL蛋白含量为0mg/mL的水中，利用高速剪切机在10,000rpm下处理15秒，作为待测样品。

[0117] (3)将步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品和待测样品分别取出1mL，并分别与1mL步骤(1)中制备的试剂A混合，得到相应的试剂A混合物，将各试剂A混合物在100℃的水浴中加热15min后，取出冷却至室温。

[0118] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别取出0.5mL，并分别与2.5mL步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，将各试剂B混合物在60℃的水浴中加热30min进行显色后，取出冷却至室温。

[0119] (5)利用0.45μm的滤膜，对步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤，以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度。

[0120] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用本发明所述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过本发明所述的方程式(ii)计算得出该实施例所述待测样品中的蛋白含量。

[0121] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表1。

[0122] 实施例2

[0123] (1)制备试剂A和试剂B

[0124] 将正十二烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为55mM和220mM，从而获得试剂A。

[0125] 将硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中，使所得到的水溶液中的硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠的摩尔浓度分别为6mM、15mM和190mM，从而获得试剂B。

[0126] (2)制备待测样品

[0127] 采用PB缓冲液(20mM，pH 8.0)作为空白样品。

[0128] 将牛血清白蛋白溶于PB缓冲液(20mM，pH 8.0)中，得到蛋白含量为30mg/mL的溶液，随后将该溶液进一步稀释得到蛋白含量为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.2mg/mL的一系列溶液，作为标准蛋白样品。

[0129] 将酒糟蛋白饲料(DDGS)作为待测原料，先用万能粉碎机将DDGS粉碎，然后取3g粉碎后的DDGS样品分散于150mL的PB缓冲液(20mM，pH 8.0)中，利用高速剪切机在5000rpm下处理30秒，作为待测样品。

[0130] (3)将步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品和待测样品分别取出1mL，并分别与1mL步骤(1)中制备的试剂A混合，得到相应的试剂A混合物，将各试剂A混合物在98℃的水浴中加热20min后，冷却至室温。

[0131] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别取出0.5mL，并分别与2.5mL步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，将各试剂B混合物在65℃的水浴中加热18min进行显色后，取出冷却至室温。

[0132] (5)将0.6mL石油醚以1:5的体积比与步骤(4)中冷却后的待测样品的试剂B混合物进行混合和震荡，并在3000g下离心5min，得到脱脂待测样品。然后，利用0.45μm滤膜，对上述脱脂待测样品以及步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物和标准蛋白样品的试剂B混合物进行过滤。以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度。

[0133] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用本发明所述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过本发明所述的方程式(ii)计算得出该实施例所述待测样品中的蛋白含量。

[0134] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表1。

[0135] 实施例3

[0136] (1)制备试剂A和试剂B

[0137] 将正十二烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为80mM和180mM，从而获得试剂A。

[0138] 将水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中，使所得到的水溶液中的硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠的摩尔浓度分别为8mM、21mM和150mM，从而获得试剂B。

[0139] (2)制备样品

[0140] 采用蛋白含量为0mg/mL的水作为空白样品。

[0141] 将牛血清白蛋白溶于蛋白含量为0mg/mL的水中，得到蛋白含量为30mg/mL的水溶液，随后将该水溶液进一步稀释得到蛋白含量为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.2mg/mL的一系列溶液，作为标准蛋白样品。

[0142] 将4g玉米粉样品分散于80mL蛋白含量为0mg/mL的水中，利用高速剪切机在7,000rpm下处理30秒，作为待测样品。

[0143] (3)将步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品和待测样品分别取出1mL，并分别与1mL步骤(1)中制备的试剂A混合，得到相应的试剂A混合物，将各试剂A混合物在90℃的水浴中加热10min后，取出冷却至室温。

[0144] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别取出0.5mL，并分别与2.5mL步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，将各试剂B混合物在70℃的水浴中加热15min进行显色后，取出冷却至室温。

[0145] (5)将0.6mL石油醚以1:10的体积比与步骤(4)中冷却后的待测样品的试剂B混合物进行混合和震荡，并在5000g下离心20s，得到脱脂待测样品。然后，利用0.45μm滤膜，对上述脱脂待测样品以及步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物和标准蛋白样品的试剂B混合物进行过滤。以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的的试剂B混合物吸光度。

[0146] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用本发明所述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过本发明所述的方程式(ii)计算得出该实施例所述待测样品中的蛋白含量。

[0147] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表1。

[0148] 实施例4

[0149] (1)制备试剂A和试剂B

[0150] 将正十二烷基硫酸钠、正十六烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为40mM、5mM和180mM，从而获得试剂A。

[0151] 将硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中，使所得到的水溶液中的硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠的摩尔浓度分别为6mM、30mM和190mM，从而获得试剂B。

[0152] (2)制备样品

[0153] 采用蛋白含量为0mg/mL的MOPS缓冲液(50mM，pH 7.4)作为空白样品。

[0154] 将牛血清白蛋白溶于MOPS缓冲液(50mM，pH 7.4)中，得到蛋白含量为30mg/mL的溶液，随后将该溶液进一步稀释得到蛋白含量为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.2mg/mL的一系列溶液，作为标准蛋白样品。

[0155] 将0.3g玉米朊样品分散于100mL蛋白含量为0mg/mL的MOPS缓冲液(50mM，pH 7.4)中，作为待测样品。

[0156] (3)将步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品和待测样品分别取出1mL，并分别与1mL步骤(1)中制备的试剂A混合，得到相应的试剂A混合物，将各试剂A混合物在100℃的水浴中加热5min后，取出冷却至室温。

[0157] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别取出0.5mL，并分别与2.5mL步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，将各试剂B混合物在60℃的水浴中加热30min进行显色后，取出冷却至室温。

[0158] (5)利用0.45μm的滤膜，对步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤，以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度。

[0159] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用本发明所述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过本发明所述的方程式(ii)计算得出该实施例所述待测样品中的蛋白含量。

[0160] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表1。

[0161] 实施例5

[0162] (1)制备试剂A和试剂B

[0163] 将正十一烷基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为45mM和180mM，从而获得试剂A。

[0164] 将硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中，使所得到的水溶液中的硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠的摩尔浓度分别为5.5mM、25mM和180mM，从而获得试剂B。

[0165] (2)制备样品

[0166] 采用蛋白含量为0mg/mL的100mM HEPES缓冲液(100mM，pH 7.4)作为空白样品。

[0167] 将牛血清白蛋白溶于100mM HEPES缓冲液(100mM，pH 7.4)中，得到蛋白含量为30mg/mL的溶液，随后将该溶液进一步稀释得到蛋白含量为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.2mg/mL的一系列溶液，作为标准蛋白样品。

[0168] 将0.5g大豆蛋白样品分散于100mL的HEPES缓冲液(100mM，pH 7.4)中，作为待测样品。

[0169] (3)将步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品和待测样品分别取出1mL，并分别与1mL步骤(1)中制备的试剂A混合，得到相应的试剂A混合物，将各试剂A混合物在100℃的水浴中加热8min后，取出冷却至室温。

[0170] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别取出0.5mL，并分别与1.8mL步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，将各试剂B混合物在50℃的水浴中加热后22min进行显色后，取出冷却至室温。

[0171] (5)利用0.45μm的滤膜，对步骤(4)中冷却后的各试剂B混合物进行过滤，以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度。

[0172] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用本发明所述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过本发明所述的方程式(ii)计算得出该实施例所述待测样品中的蛋白含量。

[0173] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表1。

[0174] 实施例6

[0175] (1)制备试剂A和试剂B

[0176] 将正十二烷基硫酸钠、正癸基硫酸钠和氢氧化钠溶于水中至摩尔浓度分别为80mM、20mM和300mM，从而获得试剂A。

[0177] 将水合硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠依次溶于水中，使所得到的水溶液中的硫酸铜、酒石酸钠和氢氧化钠的摩尔浓度分别为10mM、19mM和750mM，从而获得试剂B。

[0178] (2)制备样品

[0179] 采用蛋白含量为0mg/mL的PIPES缓冲液(50mM，pH 6.2)作为空白样品。

[0180] 将牛血清白蛋白溶于PIPES缓冲液(50mM，pH 6.2)中，得到蛋白含量为30mg/mL的溶液，随后将该溶液进一步稀释得到蛋白含量为20mg/mL、10mg/mL、5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL和0.2mg/mL的一系列溶液，作为标准蛋白样品。

[0181] 将烘干牛肉粒作为待测原料，先用万能粉碎机将所述烘干牛肉粒粉碎，然后，将1g粉碎后的烘干牛肉粒样品分散于90mL蛋白含量为0mg/mL的PIPES缓冲液(50mM，pH 6.2)中，利用高速剪切机在3000rpm下处理60秒，作为待测样品。

[0182] (3)将步骤(2)中制备的空白样品、标准蛋白样品和待测样品分别取出1mL，并分别与1mL步骤(1)中制备的试剂A混合，得到相应的试剂A混合物，将各试剂A混合物在95℃的水浴中加热10min后，取出冷却至室温。

[0183] (4)将步骤(3)中得到的各试剂A混合物分别取出0.5mL，并分别与3.6mL步骤(1)中制备的试剂B混合，得到相应的试剂B混合物，将各试剂B混合物在55℃的水浴中加热25min进行显色后，取出冷却至室温。

[0184] (5)将0.6mL石油醚以1:10的体积比与步骤(4)中冷却后的待测样品进行混合和震荡，并在800g下离心10min，得到脱脂待测样品。然后，利用0.45μm滤膜，对上述脱脂待测样品以及步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物和标准蛋白样品的试剂B混合物进行过滤。以步骤(4)中冷却后的空白样品的试剂B混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的试剂B混合物和待测样品的试剂B混合物的吸光度。

[0185] (6)根据步骤(3)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用本发明所述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过本发明所述的方程式(ii)计算得出该实施例所述待测样品中的蛋白含量。

[0186] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表1。

[0187] 同时，以凯氏定氮法测定实施例1-6中的各待测样品中的蛋白含量，并将测定结果示于下表1中。

[0188] 表1：实施例1-6中的各待测样品中的蛋白含量测定值

[0189]

[0190] *使用统计学中的Tukey诚实显著检验法(HSD)判定P值，由此判断本发明所述方法与凯氏定氮法所得到的测定值之间的差别是否显著，其中，P>0.05表明两组数据间的差别在统计学上不显著。

[0191] 基于表1中的记载可以看出，本发明所述的蛋白检测方法与凯氏定氮法在蛋白含量测定值方面无显著差异，因此，本发明所述的方法具有良好的检测准确度。

[0192] 实施例7

[0193] 根据实施例1中所示的方法制备试剂A和B，并由二者组成相应的蛋白检测试剂盒。将新配制的上述试剂盒、放置半年后的上述试剂盒以及放置一年后的上述试剂盒分别用于检测实施例1所述的待测样品中的蛋白含量，所述待测样品中的蛋白含量测定结果在下表2中示出。

[0194] 表2：采用放置不同时间的本发明的蛋白检测试剂盒测得的蛋白含量结果[0195]

[0196] *P>0.05表明与采用新配制的试剂盒测得的结果相比，采用放置半年后的试剂盒和放置一年后的试剂盒所测定的结果在统计学上无显著差异。

[0197] 基于表2中的记载可以看出，本发明所述的试剂盒在放置1年后仍然能够准确检测出样品中的蛋白含量，并且测定结果可靠。

[0198] 此外，基于上文所述的Watters C.(Analytical Biochemistry，1978)中记载的改良双缩脲试剂，进行了如下对比试验：

[0199] 对比例1

[0200] (1)制备试剂

[0201] 配制五水合硫酸铜、二水合酒石酸钠和氢氧化钠的质量浓度分别为1.5g/L、4.9g/L和7.5g/L的双缩脲试剂。

[0202] (2)制备样品

[0203] 空白样品：采用蛋白含量为0mg/mL的含有2％(w/v)正十二烷基硫酸钠的水溶液。

[0204] 标准蛋白样品：将牛血清白蛋白溶于蛋白含量为0mg/mL的2％(w/v)正十二烷基硫酸钠水溶液中，得到蛋白含量为8mg/mL的水溶液，随后将该水溶液进一步稀释蛋白含量为5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL和0.1mg/mL的一系列溶液。

[0205] 待测样品：将玉米黄粉、DDGS、玉米粉、玉米朊、大豆蛋白、烘干牛肉粒作为待测原料，经过与实施例1-6相同的原料前处理后分散于蛋白含量为0mg/mL的2％(w/v)正十二烷基硫酸钠水溶液中，并通过调整使得待测样品的蛋白含量在0.2mg/mL-8mg/mL范围内(即，处于该方法的相应线性范围内)。

[0206] (3)将步骤(2)中得到的各样品分别取出0.5mL，并分别与2.5mL步骤(1)中制备的双缩脲试剂混合，得到相应的双缩脲试剂混合物，将各双缩脲试剂混合物在室温下显色30min后，随后以步骤(2)中的空白样品的双缩脲试剂混合物作为参比进行比色测定，使用分光光度计在540nm下测定本步骤中的标准蛋白样品的双缩脲试剂混合物和待测样品的双缩脲试剂混合物的吸光度。

[0207] (4)根据步骤(2)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用下述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过下述的方程式(iii)计算得出步骤(2)所述待测样品中的蛋白含量。

[0208] (i)标准蛋白样品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；

[0209] (iii)待测样品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×D，其中，K、C为拟合常数，D＝步骤(2)中制备待测样品时的稀释倍数。

[0210] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表3。

[0211] 对比例2

[0212] (1)制备试剂

[0213] 配制五水合硫酸铜、二水合酒石酸钠和氢氧化钠的质量浓度分别为1.5g/L、4.9g/L和7.5g/L的双缩脲试剂。

[0214] (2)制备样品

[0215] 空白样品：采用蛋白含量为0mg/mL的含有2％(w/v)正十二烷基硫酸钠的水溶液。

[0216] 标准蛋白样品：将牛血清白蛋白溶于蛋白含量为0mg/mL的2％(w/v)正十二烷基硫酸钠水溶液中，得到蛋白含量为8mg/mL的水溶液，随后将该水溶液进一步稀释得到蛋白含量为5mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL和0.1mg/mL的一系列溶液。

[0217] 待测样品：将玉米黄粉、DDGS、玉米粉、玉米朊、大豆蛋白、烘干牛肉粒作为待测原料，经过与实施例1-6相同的原料前处理后分散于蛋白含量为0mg/mL的2％(w/v)正十二烷基硫酸钠水溶液中，并通过调整使得待测样品的蛋白含量在0.4-16mg/mL。

[0218] (3)将步骤(2)中得到的各样品在90℃的水浴中加热10min后，取出冷却至室温。

[0219] (4)将步骤(3)中得到的各样品分别取出0.5mL，并分别与2.5mL步骤(1)中制备的双缩脲试剂混合，然后在60℃的水浴中加热25min后，取出冷却至室温，得到相应的冷却后的各样品双缩脲试剂混合物。

[0220] (5)将0.6mL石油醚与步骤(4)中冷却后的待测样品的双缩脲试剂混合物进行混合和震荡，并在4000rpm下离心5min，得到脱脂待测样品。然后，利用0.45μm滤膜，对上述脱脂待测样品以及步骤(4)中冷却后的空白样品的双缩脲试剂混合物和标准蛋白样品的双缩脲试剂混合物进行过滤。以步骤(4)中冷却后的空白样品的双缩脲试剂混合物作为参比，使用分光光度计在540nm下测定步骤(4)中冷却后的标准蛋白样品的双缩脲试剂混合物和待测样品的双缩脲试剂混合物的吸光度。

[0221] (6)根据步骤(2)中的标准蛋白样品的蛋白含量，采用下述的方程式(i)，通过线性拟合得出蛋白含量与吸光度之间的关系，并通过下述的方程式(iii)计算得出步骤(2)所述待测样品中的蛋白含量。

[0222] (i)标准蛋白样品中的蛋白含量＝K×吸光度+C；

[0223] (iii)待测样品中的蛋白含量＝(K×吸光度+C)×D，其中，K、C为拟合常数，D＝步骤(2)中制备待测样品时的稀释倍数。

[0224] 所得到的待测样品中的蛋白含量结果见表3。

[0225] 表3对比例1和2中的各待测样品中的蛋白含量测定值

[0226]

[0227] 注：N/A表示由于溶液浑浊而无法进行比色测定来获得相应数据。

[0228] 从表3中可见，对比例1-2中的方法虽可用于进行样品蛋白含量的比色测定，但是除大豆蛋白样品(可溶蛋白样品)外，其余样品的蛋白含量测定值与凯氏定氮方法的蛋白含量测定值之间具有显著性差异，即，对比例1-2的测定结果不准确。并且，通过本发明实施例1-6以及对比例1-2之间的比较结果可以看出，对比例1-2所采用的双缩脲改良试剂以及采用该试剂的方法难以通过比色法准确地测定样品中的蛋白含量(尤其是对于含有难溶蛋白的样品而言，难以获得相应的澄清样品溶液)。

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