一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用
阅读：588发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，包括以下步骤：将木霉菌先进行培养后,在预设间隔时间接入芽孢杆菌,进行混合 发酵 培养,得到 微 生物 共生培养菌剂。还公开了该方法制备的微生物共生培养菌剂，以及该微生物共生培养菌剂在制备防治 植物 病害的制剂、防治植物病害中的应用，可用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物土传病害，植物叶部病害。本发明改变了传统的纯培养单一菌种的发酵工艺，缓解了单一菌种发酵所带来的 能源 消耗高、生产效率低的问题，并且制备的微生物共生培养菌剂缓解目前单一菌剂的 生物防治 和促进植物生长效果差的问题。，下面是一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将木霉菌先进行培养后,在预设间隔时间接入芽孢杆菌,进行混合发酵培养,得到微生物共生培养菌剂。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，所述预设间隔时间为20-90h。
3.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，所述木霉菌为哈茨木霉菌T4，保藏编号为CGMCC No.17197；
所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌或侧孢短芽孢杆菌中至少一种，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌SN16-1，保藏编号为CGMCC No.17212，所述侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌SN19-1，保藏编号为CGMCC No.17435。
4.根据权利要求3所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，所述哈茨木
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霉菌接种量为1×10-1×10cfu/L；
解淀粉芽孢杆菌接种量为1×106-8×109cfu/L，所述侧孢短芽孢杆菌接种量为2×106-
8×109cfu/L。
5.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，混合发酵培养条件为：发酵温度为25-37℃；初始pH为5-9；通气比1:2-2:1，罐压0.03-0.05MPa；发酵总时间96-144h。
6.根据权利要求1所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，其特征在于，用混合发酵培养基进行混合发酵培养，所述混合发酵培养基包括以下质量浓度的组分：可溶性淀粉15-
35g/L，麦麸2-10g/L，豆饼粉3-15g/L，硫酸铵0.5-3.5g/L，KH2PO4 0.3-1.6g/L，NaCl 0.2-
1.8g/L，CaCl20.4-1.6g/L。
7.根据权利要求1-6任一项所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法制备的微生物共生培养菌剂。
8.根据权利要求7所述的微生物共生培养菌剂在制备防治植物病害的制剂中的应用，其特征在于，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物土传病害、植物叶部病害。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述制剂为水剂、粉剂、粒剂、微胶囊剂、悬浮剂中的任意一种。
10.根据权利要求7所述的微生物共生培养菌剂在防治植物病害中的应用，其特征在于，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物土传病害、植物叶部病害。
一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着化学药剂的长期大量使用，病原菌的抗药性日渐突显，给环境安全和人类健康带来严重危害。因此，寻求环境友好、安全有效的病害防治方法受到广泛的关注。而利用微生物及其代谢产物控制病原菌来防治植物病害日益受到人们的关注和重视。目前国内使用的生物制剂微生物菌株单一，针对性不强，持效性和广谱性不理想。大量的研究表明，不同菌株之间可以存在良好的互惠共生关系，这种有益的共生关系可显著提高混合系统中各菌株的生长速率及代谢效率，从而在一定程度上提高某些产物的产量。
[0003] 侧孢短芽孢杆菌在自然界中分布较广，在土壤、火山泥流、淡水、海水、昆虫体内、叶表、槐豆、堆肥、牛奶、奶酪、蜂蜜、淀粉类食物、胶制品工厂废水、动物皮毛和鹌鹑等材料中均已分离到。侧孢短芽孢杆菌是既能抗菌杀虫又有医用价值的微生物资源。侧孢短芽孢杆菌具有多种生物活性，且表现出广谱抗菌活性，尤其是对细菌和真菌。近期的全基因组测序结果表明，侧孢短芽孢杆菌还具有产生聚酮化合物、非核糖体肽和毒素等物质的潜力。它还能够产生氨基肽酶抑制剂、戊二酰基7-ACA酰基转移酶、凝血酶抑制剂、赖氨酸等活性物质，显示了良好的应用前景。侧孢短芽孢杆菌的抗菌性能与其产生的抗菌肽有关。针对侧孢短芽孢杆菌在杀虫活性上，国外研究较多，已有生物杀虫剂成品上市。多种侧孢短芽孢杆菌对不同的无脊椎动物如昆虫、线虫和软体动物都具有致病性。
[0004] 其杀虫活性主要是由于伴孢体中所含蛋白质对多种昆虫具有毒性作用，接触或入侵靶标后，在细胞生长周期不同阶段产生不同物质，从而起到毒性作用。侧孢短芽孢杆菌菌株的芽孢中含有杀线虫化合物，能够抑制线虫的卵孵化和幼虫发育，因此，侧孢短芽孢杆菌已成为寄生性线虫的生物防治药剂。侧孢短芽孢杆菌还具有解磷、解钾等功能。研究表明它适合开发应用于农作物的菌肥，且能在一定程度上提高土壤中有效磷的含量和农作物的产量。研究发现侧孢短芽孢杆菌能够降解水胺硫磷、降解氧化乐果、水胺硫磷等有机磷农药的作用。人们也发现越来越多的物质能被侧孢短芽孢杆菌所降解，最典型的实例是把聚乙烯醇降解为乙酸盐，还能产生多种酶如木质素过氧化酶、漆酶、氨基比林-N-脱甲基酶、NADH-DCIP还原酶和孔雀绿还原酶等。可见，侧孢短芽孢杆菌具备开发成为防治昆虫、线虫、软体动物和植物病原菌的生防菌剂的特性。同时，其解磷、解钾及其对化学农药等物质的生物降解特性，使其具有土壤生物修复的能力。
[0005] 解淀粉芽孢杆菌在1943年首次分离获得，并与枯草芽孢杆菌区分开来，在1987年已经存在单独的物种并且在获批的细菌列表中出现。解淀粉芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌株、好氧并能够产生孢子，常作为研究植物微生物相互作用的模式菌株，在农业上常用作生物肥料和生防菌株。解淀粉芽孢杆菌具有促进植物生长和抑制植物病原菌的潜能，如分泌不同的抗细菌和抗真菌的次级代谢物、促进植物生长和激活宿主防御系统。此外，生防菌和病原菌对营养尤其是铁元素的竞争是植物保护的一个重要因素。解淀粉芽孢杆菌全基因组分析揭示有8.5％的基因组用于产生一些高抗菌活性的生物活性物质，如脂肽类的伊枯草菌素、抗霉素D和丰原素等，聚酮类如大环内酯、溶素、芽孢菌霉素和地非西丁等。解淀粉芽孢杆菌产生的次级代谢物能够杀死同样从土壤中发现的一种病原细菌类鼻疽伯克氏菌。除此之外，还能够杀死类鼻疽伯克氏菌的耐药菌株，并抑制其它病原细菌如金黄色酿脓葡萄球菌，大肠杆菌和鲍氏不动杆菌。解淀粉芽孢杆菌还能通过促进植物自身的生长而间接达到控制植物病害的目的。与其它生防菌株相比，解淀粉芽孢杆菌更容易培养和储存，其菌体可接种在植物种子或者是直接接种在植株体上，通过合成赤霉素(影响植物生长的多个过程，包括种子的萌发、茎干的伸长、开花期和结果期)、吲哚乙酸、胞外植酸酶(能够增强植物对矿质元素的吸收)、几丁质和抗真菌肽类等物质直接促进植物生长。发明人采用HPLC、PCR等技术，发现解淀粉芽孢杆菌能够产生表面活性素、伊枯草菌素和丰原素，并存在合成这三种抗生素的基因。解淀粉芽孢杆菌对多种病原菌具有广谱的拮抗活性，能够促进植物的生长。
[0006] 木霉菌用于防治植物病害的历史已有70多年，其生防效果已得到公认，是全世界应用较为广泛的生防菌。木霉菌属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，粘孢菌类，是一类普遍存在于土壤中的真菌，是土壤微生物的重要群落，其可寄生于植物残体及动物粪便上，从植物根围、叶片及种子、球茎表面也经常可以分离到，木霉菌能够寄生于多种土传植物的病原菌上。八十年代以来，随着分子生物学的快速发展，木霉菌的研究主要集中在如何提高其生物防效方面，如通过加强几丁质酶、葡聚糖酶基因的表达、种间融合等手段。大部分木霉菌对营养的需求并不严格，它们可在各种碳源和氮源下生长，同时可转化和降解一些有害或持久有害的环境污染物；可直接利用各种单糖、单糖的衍生物、有机酸类；有显著的降解各种多糖(纤维素、半纤维素)和相关的多聚糖(几丁质)；还可转化和降解一些农药，如：马拉硫磷、茅草枯、五氯硝基苯等。木霉菌可利用复杂和简单的氮，水解酪蛋白氨基酸混合液、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸均能很好利用，在高氮条件下有利于木霉菌产生一些酶，如纤维素酶、乳糖酶等。木霉菌的拮抗作用范围具有广谱性，相关研究显示，木霉菌至少对18个属 29种病原真菌有拮抗作用。木霉菌能寄生的植物病原菌即拮抗对象包括丝核菌属、小核菌、核盘菌属、长蠕孢属、镰刀菌属、毛盘孢属、轮枝孢属、黑星菌属、内座壳属、腐霉属、疫霉属、间座壳属和黑星孢属等。
[0007] 在长期的试验和生产实践当中，人类对微生物的发酵经历了纯种发酵和混合发酵两个阶段，发现纯种发酵使用单一的微生物，参与生化反应的酶系不多，很多重要的生化过程是单株微生物不能完成或者只能微弱进行。而混合发酵过程中不同的微生物有不同的代谢途径和代谢产物，多种微生物协同作用能优势互补、相辅相成，提高某些代谢产物的产量，节约能源，降低成本。这是单一菌株发酵无法达到的效果。而如何将多种类型的菌种进行共生培养一直是研发人员亟需解决的重要课题。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法，以解决上述现有技术存在的问题，改变了传统的纯培养单一菌种的发酵工艺，缓解了单一菌种发酵所带来的能源消耗高、生产效率低的问题。
[0009] 本发明的目的是还提供一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法制备的微生物共生培养菌剂，缓解目前单一菌剂的生物防治和促进植物生长效果差的问题。
[0010] 本发明的目的是还提供一种微生物共生培养菌剂在制备防治植物病害的制剂中的应用，可以制备成多种类型的制剂用于防治植物病害。
[0011] 本发明的目的是还提供一种微生物共生培养菌剂在防治植物病害中的应用，可以用于防治多种植物病害。
[0012] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
[0013] 本发明提供一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，包括以下步骤：
[0014] 将木霉菌先进行培养后,在预设间隔时间接入芽孢杆菌,进行混合发酵培养,得到微生物共生培养菌剂。
[0015] 优选的是，所述预设间隔时间为20-90h。
[0016] 优选的是，所述木霉菌为哈茨木霉菌T4，分类名哈茨木霉Trichoderma harzianum，保藏编号：CGMCC No.17197,保藏时间：2019年03月25日，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0017] 所述芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌或侧孢短芽孢杆菌中至少一种，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌SN16-1，分类名：解淀粉芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号：CGMCC No.17212，保藏时间： 2019年01月18日，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌SN19-1，分类名：侧孢短芽孢杆菌Brevibacillus laterosporus，保藏编号：CGMCC No.17435，保藏时间：2019年03月25日，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0018] 优选的是，所述哈茨木霉菌接种量为1×106-1×109cfu/L；
[0019] 解淀粉芽孢杆菌接种量为1×106-8×109cfu/L，所述侧孢短芽孢杆菌接种量为2×106-8×109cfu/L。
[0021] 优选的是，用混合发酵培养基进行混合发酵培养，，所述混合发酵培养基包括以下质量浓度的组分：可溶性淀粉15-35g/L，麦麸2-10g/L，豆饼粉3-15g/L，硫酸铵0.5-3.5g/L，KH2PO4 0.3-1.6g/L，NaCl 0.2-1.8g/L， CaCl2 0.4-1.6g/L。
[0022] 本发明还提供所述的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法制备的微生物共生培养菌剂。
[0023] 本发明还提供所述的微生物共生培养菌剂在制备防治植物病害的制剂中的应用，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物枯萎病和十字花科根肿病等土传病害，稻瘟病、植物白粉病、植物灰霉病等叶部病害。
[0024] 优选的是，所述制剂为水剂、粉剂、粒剂、微胶囊剂、悬浮剂中的任意一种。
[0025] 本发明还提供所述的微生物共生培养菌剂在防治植物病害中的应用，应用于防治植物立枯病，茄果类青枯病，植物枯萎病和十字花科根肿病等土传病害，稻瘟病、植物白粉病、植物灰霉病等叶部病害。
[0026] 本发明公开了以下技术效果：
[0027] 本发明公开的芽孢杆菌和木霉菌联合培养的方法，是通过采用两类完全不同的菌种，经过先培养其中一种菌种，然后再预设间隔时间接入另外一种菌种，进而实现两类菌种混合共生，这种方法克服了单一菌株发酵带来的能源消耗大，以及目前混合菌种制备的流程繁琐、复杂，真菌和细菌不能共生培养得到复合菌剂的技术问题。本发明根据木霉菌与芽孢杆菌不同生长周期对氧和营养成分的需求不同进行分段接种，先将生长周期较长的木霉菌发酵培养至厚垣孢子形成期，在木霉菌对氧和营养需求降低时接种芽孢杆菌共培养得到复合发酵液，即得到微生物共生培养菌剂，该方法具备操作简单，易于实现，对发酵设备要求不高等优势。
[0028] 本发明所制备的微生物共生培养菌剂，稳定性好，适应性强，不会出现菌群失衡和单一化的现象，并且相对目前混合菌种培养方法大大简化了发酵步骤，降低了生产成本，可以通过发酵实现大量的生产，便于产业化和推广，还可以灵活应用于不同行业的实际生产中。附图说明
[0029] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0030] 图1为解淀粉芽孢杆菌的16S rRNA的鉴定结果；
[0031] 图2为解淀粉芽孢杆菌基于16S rRNA检测结果进行系统发育树分析结果；
[0032] 图3为侧孢短芽孢杆菌基于16S rDNA检测结果进行系统发育树分析结果；
[0033] 图4为哈茨木霉菌基于16S rDNA检测结果进行系统发育树分析结果；
[0034] 图5为实施例2的抑菌活性部分结果；
[0035] 图6为实施例3中促进植物生长的结果。
具体实施方式
[0036] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0037] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0038] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
[0039] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
[0040] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0041] 本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。
[0042] 木霉菌为哈茨木霉菌T4(保藏编号为CGMCC No.17197)；解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌SN16-1(保藏编号为CGMCC No.17212)；侧孢短芽孢杆菌为侧孢短芽孢杆菌SN19-1(保藏编号为CGMCC No.17435)，均保藏于华东理工大学。
[0043] 发明人在进行芽孢杆菌和哈茨木霉共培养之前，先对于其共生的发酵培养基成分进行了筛选，具体如下。
[0044] 1、芽孢杆菌和木霉菌联合培养发酵培养基成分的筛选
[0045] 1.1碳源、氮源、无机盐的种类
[0048] 无机盐：KH2PO4、K2HPO4、NaCl、Na2HPO4、MgSO4、CaCl2；
[0049] 1.2各组分筛选过程
[0050] (1)目标菌株的活化及鉴定：将三种菌株解淀粉芽孢杆菌SN16-1、侧孢短芽孢杆菌SN19-1分别接种至LB固体培养基，于33℃的恒温培养箱中培养24h；哈茨木霉T4，接种于PDA固体培养基中，于30℃的恒温培养箱中培养72h，培养结束后刮取菌体提取DNA鉴定。
[0051] (2)液体培养：挑取芽孢杆菌和木霉菌的单个菌落分别接种在LB液体培养基和PDA液体培养基中，所述的两种培养基要求在30℃恒温摇床分别培养24h和72h，获取足量菌液。
[0052] (3)获取种子液：按各接种量(芽孢杆菌1％，木霉菌1％)分别接种两种菌株于250mL含有LB液体培养基和PDA液体培养基的容量培养瓶中，于30℃恒温摇床分别培养24h和72h，获取足量菌液。
[0053] (4)摇瓶混合发酵：单因素试验筛选最佳碳源、氮源和无机盐，以初始发酵培养基(葡萄糖，蛋白胨，MgSO4，KH2PO4，NaCl)为基本培养基，分别选用工业上常用且价格低廉的7种碳源或7种氮源或6种无机盐作为替代，一共构成7组，作为不同替代的培养基。以无原始成分的培养基做对照，每个处理3个重复，共培养5d后取样测定生物量及OD值。
[0054] 任取1株或2株芽孢菌与木霉菌种子液按1:1(接种总量为2％)的比例接种于不同培养基中，将培养基初始pH调节至7.5，在29℃、200r/min 条件下震荡培养72h。采用紫外可见分光光度计600nm下测定发酵液的OD 值以及平板计数法计数，确定最佳组分。
[0055] (5)摇瓶混合发酵：在已确定最佳碳源、氮源最优发酵培养基后；选择不同浓度的无机盐种类进行混合发酵试验。采用紫外可见分光光度计 600nm下测定发酵液的OD值以及平板计数法计数，确定最佳浓度。
[0056] (6)摇瓶混合发酵：用优化的最佳培养基进行复合菌株的发酵，改变培养基发酵条件。采用紫外可见分光光度计600nm下测定发酵液的OD值以及平板计数法计数，确定最佳发酵条件。
[0057] (7)取样检测：将芽孢菌与木霉菌按1:1(接种总量为2％)的比例接种量接种于优化得到的最佳培养基中，调节培养基的初始pH为7.5，在29℃、 200r/min摇床发酵，发酵培养72h，采用紫外可见分光光度计600nm下测定发酵液的OD值以及平板计数法计数，得到活菌数分别为109cfu/L。
[0058] 上述筛选过程中，各步骤发酵液进行梯度稀释后通过标准平板涂布方法进行均含量计数，其结果如表1所示。
[0059] 表1实施例1中的不同处理菌含量检测结果
[0060]
[0061]
[0062] 由表1可以得出经过单因素优化基础培养基得到的混合发酵培养基显著提高了混合发酵中三种菌株的活菌含量，明显优于基础培养基。使用该发酵培养基可以保证共培养时混合菌株都能正常生长。最佳成分组成为可溶性淀粉，有机氮源豆饼粉，麦麸，无机氮源硫酸铵，KH2PO4，NaCl，CaCl2。
[0063] 实施例1
[0064] 根据上述筛选的结果，纯培养和共生培养发酵生物量检测结果对比。
[0065] 1、菌株：解淀粉芽孢杆菌SN16-1，侧孢短芽孢杆菌SN19-1，哈茨木霉T4(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。
[0066] 2、培养基：LB种子培养基(需要0.6L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，水1000mL，PH7.0，121℃灭菌20min。
[0067] PDA种子培养基(需要0.6L)：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL， 121℃灭菌25min。
[0068] 混合发酵培养基(30L)：可溶性淀粉23g/L，麦麸5g/L，硫酸铵2g/L， KH2PO4 1g/L，NaCl 1g/L，CaCl2 1g/L。
[0069] 3、发酵步骤：
[0070] (1)将4℃保存的解淀粉芽孢杆菌SN16-1，侧孢短芽孢杆菌SN19-1 和哈茨木霉T4菌株，分别用LB和PDA平板活化，于29℃恒温培养箱中分别培养2d和5d。
[0071] 将SN16-1和SN19-1菌株分别接种到LB液体培养基中，于29℃、200 转/min的恒温震荡培养箱中培养12h，将已长满孢子的T4菌株每平板加 10mL灭菌生理盐水，用涂布器将孢子囊刮下接种到PDB培养基中，于29℃、 200r/min恒温震荡培养箱中培养72h。
[0072] 其中，SN16-1菌量为1×108cfu/mL，T4菌液孢子浓度调至1×106个 /mL。
[0073] (2)摇瓶：向LB培养基接种SN16-1和SN19-1培养时间12h，接种量2％，温度30℃，初始pH7.0，装液量100mL/250mL，转速200r/min。摇瓶：使用PDA培养基，接种T4培养时间72h，接种量2％，装液量100mL，转速180rpm，培养温度28℃，培养时间72h。
[0074] (3)30L放大发酵培养：采用30L三连罐同步发酵，设置一个共培养组编号D，E和三个纯培养组A,B,C。纯培养组A，B和C分别为菌株SN16-1，SN19-1和菌株T4的纯培养发酵，共培养组D为木霉菌和解淀粉芽孢杆菌 SN16-1混合发酵，共培养组E为木霉菌和侧孢短芽孢杆菌SN19-1混合发酵。
[0075] 纯培养组A，B，C发酵条件：接种量2％，装料系数0.667，温度29℃，初始pH7.0，转速200r/min，通气量1.8m3/h，植物油(消泡剂)200mL；发酵总时长分别为3d和5d。
[0076] 共培养组D,E发酵条件：接种量(1:1)2％，菌株T4接种3d后再接种菌株SN16-1；装料系数0.667，温度29℃，初始pH7.0，转速200r/min，通气量1.8m3/h，植物油(消泡剂)200mL；发酵总时长5d。
[0077] 对A-E不同组获得的发酵液进行梯度稀释后，采用标准平板涂布法进行活菌含量检测，结果如表2所示。
[0078] 表2 A-E组活菌含量
[0079]
[0080] 由表2可以看出，使用本发明公开的发酵培养基，发酵工艺和接种方法可以保证共培养发酵液中的各个菌种的菌含量与纯培养的菌含量相差不大，此方法能够保证共培养时混合菌株都能正常生长。
[0081] 实施例2
[0082] 比对纯培养发酵液与共生培养发酵液对常见植物病原菌的抑制作用
[0083] 1、菌种：
[0084] 拮抗菌株：解淀粉芽孢杆菌SN16-1和哈茨木霉T4。
[0085] 指示病原菌：番茄枯萎病原菌，西瓜炭疽病原菌，葡萄灰霉病原菌，立枯丝核菌，黄单胞菌，青枯劳尔氏菌。
[0086] 2、培养基：
[0087] PDA培养基：土豆200g，去皮，切片，煮沸30min，过滤，在滤液中加入20g蔗糖，定容至1000mL，琼脂20g，pH自然。
[0088] LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g,NaCl 10g，水1000ml，PH7.0，121℃灭菌20min。
[0089] 共培养发酵培养基：可溶性淀粉23g/L，麦麸5g/L，硫酸铵2g/L，KH2PO4 1g/L，NaCl 1g/L，CaCl2 1g/L。
[0090] 3、抑菌活性测定
[0091] 芽孢杆菌在LB培养基中培养48h，木霉菌在PDA培养基培养5d，在共培养发酵培养基中培养5d，抑菌活性的测定采用平板对峙法：在平板底部划垂直交叉十字；在PDA平板距离中心20mm处接种对照组纯培养发酵液和处理组混合培养发酵液；在平板中央接种直径5mm的指示病原菌菌株，在 29℃下培养5-7d，至拮抗菌与各指示菌菌落间产生明显抑菌带时测量拮抗带宽度。以不接种拮抗菌，只接种指示菌做对照。
[0092] 抑制率计算公式如下：
[0093] 纯培养发酵液与共生培养发酵液对常见植物病原菌的抑制作用，如表 3所示，结果显示：复合菌株发酵液对病原菌的抑制能力都远大于单个菌株的纯培养发酵液，抑菌率有明显的提升。
[0094] 表3各个处理对病原菌的抑制率
[0095]
[0096] 实施例3
[0097] 室内盆栽试验检测纯培养和共生培养发酵液的生防和促生长能力测定
[0098] 1、菌株：解淀粉芽孢杆菌SN16-1，侧孢短芽孢杆菌SN19-1，哈茨木霉T4。
[0099] 2、培养基：同实施例2
[0100] 3、试验方法
[0101] 将经表面消毒的番茄种子(2％NaClO处理3min，再使用灭菌水漂洗3 次)播种于pvc花盆(含350g土+10g珍珠岩)中，每盆播种6颗，将摇瓶培养7天的番茄枯萎病菌(FOL)以5×106个孢子/g土加入花盆中，不需加病原菌的处理组浇灌相同体积的水。培养温度设置为25℃，每天光照 16h。待植物长出2片子叶后，浇灌纯培养发酵液和混合共生培养发酵液，浓度均为108cfu/g，同样不需加生防菌的处理组浇灌相同体积的水，盆栽试验总共分为4个处理组，分别为不加发酵液的对照组(CK)、纯培养发酵液、混合培养发酵液和只加病原菌FOL。
每个处理组重复3次，每隔10天对番茄植株进行采样。
每个处理组重复3次，每隔10天对番茄植株进行采样。
[0102] 4、测试指标
[0103] 番茄植株生物量测定：对每次采样的植物鲜重、干重、株长、茎长和根长等相关生物量进行测定；每个处理组重复3次。
[0104] 番茄植株病情指数统计：按照上述相同条件重新进行盆栽试验，用于番茄植株的病情指数统计，每个处理组包含18棵植株，共6个处理组。植株病害程度统计参照的标准：0—没有发病症状；1—小于25％，叶片显示症状；2—26-50％，叶片显示症状；3—51-75％，叶片显示症状；4—，76-100％，叶片显示症状；5—植株死亡。病情指数按照公式进行统计。
[0105] 病情指数＝[∑(各级病株数×相应级数)/(调查总植株数×最高级数)] ×100％[0106] 5、结果
[0107] 对各个组发酵液的促生长和生物防治效果进行统计分析，不同处理组和取样时间对植物生物量的影响，结果如表4所示，结果显示：添加纯培养发酵液和混合培养发酵液的2个处理组中的植物生长最快，与对照组相比，株高、茎长、鲜重、干重的生物量参数均存在显著性差异；并且混合培养发酵液对植物的促生作用优于单个菌株的纯培养发酵液。不同处理的病情指数结果如表5所示，结果显示：混合培养发酵液在防治番茄枯萎病时效果是优于纯培养发酵液的，尤其在番茄生长的后期50d时效果更加明显。
[0108] 表4不同处理组和取样时间对植物生物量的影响
[0109]
[0110]
[0111] 表5不同处理的病情指数
[0112]
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