一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用
阅读：133发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用，其中所述抗菌基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述多肽的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述重组蛋白含有抗菌VpBDef-2基因，且表达抗菌VpBDef-2多肽。本发明的有益效果在于：所述抗菌基因、多肽、重组蛋白可应用于生产蔬菜、畜禽及 水 产类抗菌药物、 疫苗 或 饲料 添加剂，具有广阔的应用前景；且所述基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用可为进一步研究菲律宾蛤仔免疫防御机制提供 基础 ，并为菲律宾蛤仔的病害防治、遗传选育和饲料添加剂研究奠定基础。，下面是一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种靶向抗菌基因，其特征在于，所述抗菌基因为靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2基因，且所述抗菌基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的一种靶向抗菌基因，其特征在于，所述抗菌基因的cDNA全长核苷酸序列为643bp，且所述基因的开放阅读框为396bp，编码131个氨基酸，5’非编码区长
62bp，3’非编码区长185bp，有多聚腺苷酸尾巴。
3.根据权利要求2所述的一种靶向抗菌基因，其特征在于，所述抗菌基因的cDNA全长核苷酸序列的制备方法包括以下步骤：
cDNA合成：提取菲律宾蛤仔总RNA，经纯化和反转录得cDNA；
生成所述抗菌基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出VpBDef-2 EST基因；采用巢式PCR策略生成所述抗菌基因的全长cDNA。
4.一种靶向抗菌多肽，其特征在于，所述抗菌的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
5.一种靶向抗菌重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白含有如权利要求1所述的靶向抗菌基因，且表达了如权利要求4所述的靶向抗菌多肽。
6.根据权利要求5所述的一种靶向抗菌重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（6.1）重组表达载体的获得：将所述一种靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2基因连接到原核表达载体，获得重组表达载体；
（6.2）蛋白粗品的获得：将所述重组表达载体转化至宿主菌中获得阳性菌株，以0.1mM的IPTG浓度诱导蛋白表达，获得原核体外重组表达蛋白粗品；
（6.3）蛋白纯化及复性：将原核体外重组表达蛋白粗品经镍柱亲和层析纯化、透析复性，获得所述靶向抗菌重组蛋白，称为靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的一种靶向抗菌重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（6.1）中所述原核表达载体为pET30a(+)，步骤（6.2）中所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3) plysS。
8.根据权利要求1所述的一种靶向抗菌基因的应用，其特征在于，所述抗菌基因应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
9.根据权利要求4所述的一种靶向抗菌多肽的应用，其特征在于，所述抗菌多肽应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
10.根据权利要求5所述的一种靶向抗菌重组蛋白的应用，其特征在于，所述抗菌重组蛋白应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一类内源性小分子肽类活性物质，直接参与杀死和清除感染的病原微生物，是无脊椎动物先天免疫的重要效应分子，因其可作为传统抗生素的替代物而越来越受到关注。因其是内源性的小分子多肽，AMPs具有无污染、无抗原性、针对性强、热稳定、广谱抗菌等一系列优点，在抗病饲料添加剂研发方面具有重要的应用前景，因而对AMPs的研究已成为最为活跃的领域之一。
[0003] 研究学者已从原核生物和真核生物中分离得到多种AMPs编码基因，它们在结构和大小上均有较大差异。在不同物种中，不同结构的AMPs构成一个AMP库来共同对抗病原体。海洋无脊椎动物中已报道了多种AMPs的结构和功能，如已从贻贝两个物种Mytilus galloprovincialis和Mytilus edulis中成功分离出4类阳离子半胱氨酸AMPs，它们分别是类防御素多肽MGD-1和MGD-2、myticins、mytilins（含有8个半胱氨酸残基）以及mytimycin。
[0004] 目前在贝类中，已发现的抗菌效应分子主要包括大防御素、防御素、富含脯氨酸蛋白以及杀菌/增加通透性（BPI）蛋白等几类。其中，大防御素近年来已在文蛤、长牡蛎、海湾扇贝等软体动物相继发现，并证实其在机体免疫应答中发挥重要作用。在长牡蛎中，先后发现了3种大防御素Cg-bigdef1、Cg-bigdef2和Cg-bigdef3，且仅在循环系统和浸润的血细胞中表达。对海湾扇贝大防御素抗菌活性的研究发现，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均具有明显的杀菌效果，同时具有较强的LPS结合活性。在前期的研究中，发现大防御素有多态性和功能分化现象，到目前为止，尚缺乏对功能分化的大防御素的免疫作用和杀菌机制研究。
[0005] 菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）是我国单种产量最高的养殖贝类之一，其作为软体动物门双壳纲最为常见的物种之一，一直是进化、发育、生态毒理等多领域研究的重要研究对象。菲律宾蛤仔以滤食为生，所处生存环境复杂，近年来，菲律宾蛤仔养殖大量死亡情况频现，这主要是病原体入侵和环境恶化等因素综合作用的结果。由于贝类缺乏类似于脊椎动物的获得性免疫系统，先天性免疫系统中的免疫效应分子在免疫防御过程中的作用尤为重要。近年来在针对对菲律宾蛤仔的研究中发现了不少具有重要意义的免疫基因，对相关免疫分子进行鉴定和开发有可能极大地促进蛤蜊养殖产业中疾病控制和健康管理等方面的进步。
[0006] 因此，本发明以菲律宾蛤仔为研究对象，提供了一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用，为解决当前水产养殖病害严重、抗生素滥用引起的生态破坏和水产食品药物残留等问题提供了一种全新的方法。
发明内容
[0007] 为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用，为解决当前水产养殖病害严重、抗生素滥用引起的生态破坏和水产食品药物残留等问题提供了一种全新的方法。
[0008] 本发明提供了一种靶向抗菌基因，所述靶向抗菌基因是一种靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2基因，且所述抗菌基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 进一步，所述靶向抗菌基因的cDNA全长核苷酸序列为643bp，且所述基因的开放阅读框为396bp，编码131个氨基酸，5’非编码区长62bp，3’非编码区长185bp，有多聚腺苷酸尾巴。
[0010] 进一步，所述抗菌基因的cDNA全长核苷酸序列的制备方法包括以下步骤：（1.1） cDNA合成：提取菲律宾蛤仔总RNA，mRNA经纯化和反转录得cDNA；
（1.2） 生成所述抗菌基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出VpBDef-2 EST基因；采用巢式PCR策略生成所述抗菌基因的全长cDNA。
（1.2） 生成所述抗菌基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出VpBDef-2 EST基因；采用巢式PCR策略生成所述抗菌基因的全长cDNA。
[0011] 本发明还提供了一种靶向抗菌多肽，且所述抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0012] 本发明还提供了一种靶向抗菌重组蛋白，且所述重组蛋白含有所述靶向抗菌基因，并表达了所述靶向抗菌多肽。
[0013] 本发明还提供了一种靶向抗菌重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：（2.1） 重组表达载体的获得：将所述靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2基因连接到原核表达载体，获得重组表达载体；
（2.2） 蛋白粗品的获得：将所述重组表达载体转化至宿主菌中获得阳性菌株，以0.1mM的IPTG浓度诱导蛋白表达，获得原核体外重组表达蛋白粗品；
（2.3） 蛋白纯化及复性：将原核体外重组表达蛋白粗品经镍柱亲和层析纯化、透析复性，获得所述靶向抗菌重组蛋白。
（2.2） 蛋白粗品的获得：将所述重组表达载体转化至宿主菌中获得阳性菌株，以0.1mM的IPTG浓度诱导蛋白表达，获得原核体外重组表达蛋白粗品；
（2.3） 蛋白纯化及复性：将原核体外重组表达蛋白粗品经镍柱亲和层析纯化、透析复性，获得所述靶向抗菌重组蛋白。
[0014] 优选的，所述靶向抗菌重组蛋白的制备方法中步骤（2.1）中所述原核表达载体为pET30a(+)，步骤（2.2）中所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3) plysS。
[0015] 本发明还提供了一种靶向抗菌基因的应用，即所述抗菌基因应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
[0016] 本发明还提供了一种靶向抗菌多肽的应用，即所述抗菌多肽应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
[0017] 本发明还提供了一种靶向抗菌重组蛋白的应用，即所述抗菌重组蛋白应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
[0018] 本发明提供的一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用具有以下优势：①本发明提供了一种可应用于贝类饲料添加剂、抗病药物、疫苗开发的靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法；
②本发明所述的一种靶向抗菌基因的cDNA全长为643 bp，开放阅读框为396bp，编码
131个氨基酸，推测蛋白分子量大小为10.2kDa，理论等电点为9.5；以此构建的原核重组表达载体pET30a(+)-VpBDef-2，转化到大肠杆菌表达菌株DE3中可以获得稳定表达VpBDef-2重组蛋白的菌株，经表达、纯化、复性后获得了具有生物活性的重组蛋白，并在体外验证了其生物学功能，鉴定所述重组蛋白具有良好的靶向细菌核酸的抗菌活性，可以与细菌核酸结合，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有一定的抑制作用。
②本发明所述的一种靶向抗菌基因的cDNA全长为643 bp，开放阅读框为396bp，编码
131个氨基酸，推测蛋白分子量大小为10.2kDa，理论等电点为9.5；以此构建的原核重组表达载体pET30a(+)-VpBDef-2，转化到大肠杆菌表达菌株DE3中可以获得稳定表达VpBDef-2重组蛋白的菌株，经表达、纯化、复性后获得了具有生物活性的重组蛋白，并在体外验证了其生物学功能，鉴定所述重组蛋白具有良好的靶向细菌核酸的抗菌活性，可以与细菌核酸结合，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌均有一定的抑制作用。
[0019] ③本发明提供的一种靶向抗菌基因、多肽、重组蛋白可应用于生产畜禽及水产类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂，具有广阔的应用前景。
[0021] 图1为本发明的实施例1中一种靶向抗菌基因由CDS区翻译获得氨基酸和其它物种BDef蛋白的序列比对结果图；图2为本发明的实施例2中一种靶向抗菌重组蛋白诱导表达、纯化、Western Blot检测结果图；其中Line1和Line2代表IPTG诱导表达的重组蛋白，Line3代表纯化后的重组蛋白，Line4代表重组蛋白的Western Blot检测结果；
图3为本发明的实施例4中一种靶向抗菌重组蛋白在s-BLMs包覆金电极的阻抗复平面图；
图4为本发明的实施例5中一种靶向抗菌重组蛋白与核酸结合作用结果图。
图3为本发明的实施例4中一种靶向抗菌重组蛋白在s-BLMs包覆金电极的阻抗复平面图；
图4为本发明的实施例5中一种靶向抗菌重组蛋白与核酸结合作用结果图。
具体实施方式
[0022] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023] 实施例1一种靶向抗菌基因（靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2基因）cDNA全长核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：
（1） cDNA合成
①提取菲律宾蛤仔总RNA：采用Trizol试剂法(Invitrogen公司)提取菲律宾蛤仔血细胞总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳确定总RNA完整性，Nanodrop2000检测总RNA浓度；
②RNA纯化：总RNA经RQ1 DNA酶(Promega，USA)处理以去除DNA污染，完成mRNA纯化；
③反转录获得cDNA：25 μL反转录反应体系包含2 μg总RNA、200 UM-MLV以及0.5 μM oligo dT引物，在42℃下反应1 h逆转录合成cDNA，随后95 ℃下5 min使酶失活。
（1） cDNA合成
①提取菲律宾蛤仔总RNA：采用Trizol试剂法(Invitrogen公司)提取菲律宾蛤仔血细胞总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳确定总RNA完整性，Nanodrop2000检测总RNA浓度；
②RNA纯化：总RNA经RQ1 DNA酶(Promega，USA)处理以去除DNA污染，完成mRNA纯化；
③反转录获得cDNA：25 μL反转录反应体系包含2 μg总RNA、200 UM-MLV以及0.5 μM oligo dT引物，在42℃下反应1 h逆转录合成cDNA，随后95 ℃下5 min使酶失活。
[0024] （2） 生成抗菌VpBDef-2基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出VpBDef-2 EST基因；采用巢式PCR策略生成全长cDNA，具体步骤如下：
①第一轮PCR：首先在94 ℃下预变性5 min，随后进行35个循环，每个循环经历94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1分钟，最后72 ℃后延伸10 min；
②第二轮PCR：以1 μL第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，以P2和dT为引物，反应程序与第一轮PCR一致；
③PCR扩增产物回收：使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像系统照相并观察结果并按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物回收；
④连接：将回收的PCR扩增产物连接到PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态DH5α，选取单克隆进行测序；
⑤序列分析：在NCBI网站经Blast分析后确定所获得的序列即为VpBDef-2基因cDNA序列全长，由CDS区翻译获得氨基酸序列并进行生物信息学分析，多序列比对结果如图1所示。
①第一轮PCR：首先在94 ℃下预变性5 min，随后进行35个循环，每个循环经历94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1分钟，最后72 ℃后延伸10 min；
②第二轮PCR：以1 μL第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，以P2和dT为引物，反应程序与第一轮PCR一致；
③PCR扩增产物回收：使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像系统照相并观察结果并按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物回收；
④连接：将回收的PCR扩增产物连接到PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态DH5α，选取单克隆进行测序；
⑤序列分析：在NCBI网站经Blast分析后确定所获得的序列即为VpBDef-2基因cDNA序列全长，由CDS区翻译获得氨基酸序列并进行生物信息学分析，多序列比对结果如图1所示。
[0025] 实施例2一种靶向抗菌重组蛋白（靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2重组蛋白）的制备方法，包括以下步骤：
（1） 重组表达载体的获得
①连接T载体：在靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2基因cDNA序列中编码成熟肽段的序列片段两端设计引物，并在上游引物添加BamHI酶切位点、下游引物添加HindШ酶切位点，之后进行PCR扩增，获得PCR产物2，将PCR产物2经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，连接进入PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态DH5α后选取单克隆进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性；
其中上游序列为5’-CTTGGATCCAGTGTTAAACTCGCCAGGC-3’，下游引物序列为5’-CGCAAGCTTTTAACCAAGATTCCCTGGCCTGC-3’；
②构建重组表达载体：对测序确定的菌株提取质粒，经BamHI和HindШ双酶切后回收目的片段，以T4连接酶再次连接进入原核表达载体pET30a(+)，获得重组表达载体pET30a(+)-Rpmacin，将其转化大肠杆菌感受态DH5α，挑选单克隆菌进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性。
（1） 重组表达载体的获得
①连接T载体：在靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2基因cDNA序列中编码成熟肽段的序列片段两端设计引物，并在上游引物添加BamHI酶切位点、下游引物添加HindШ酶切位点，之后进行PCR扩增，获得PCR产物2，将PCR产物2经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，连接进入PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态DH5α后选取单克隆进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性；
其中上游序列为5’-CTTGGATCCAGTGTTAAACTCGCCAGGC-3’，下游引物序列为5’-CGCAAGCTTTTAACCAAGATTCCCTGGCCTGC-3’；
②构建重组表达载体：对测序确定的菌株提取质粒，经BamHI和HindШ双酶切后回收目的片段，以T4连接酶再次连接进入原核表达载体pET30a(+)，获得重组表达载体pET30a(+)-Rpmacin，将其转化大肠杆菌感受态DH5α，挑选单克隆菌进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性。
[0026] （2） 蛋白粗品的获得①转化表达菌株：对测序确定的菌株提取重组质粒，重组质粒转化表达菌株BL21（DE3）(购自Invitrogen公司)，过夜培养，挑选阳性单克隆进行菌落PCR验证，筛选得到阳性转化表达菌株，终浓度30%甘油保种于-80 ℃。
[0027] ②诱导表达浓度确定：取3个阳性转化表达菌株，摇菌过夜，第二天按照1%的比例接种含卡那霉素的LB培养基4管，每管10 mL，在37 ℃下，200 rpm培养3 h至OD 600为0.6-0.8，对其中3管分别添加IPTG至终浓度为0.1 mM，0.5 mM和1 mM，另外1管作为未诱导对照。
继续在37℃下以200 rpm摇菌诱导5h，分别吸取1mL菌液8000rpm离心10min弃上清收菌，加灭菌水40 μL重悬后添加10 μL 5 x SDS-PAGE上样缓冲液（+β-巯基乙醇），开水煮样10 min，SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染色液染色20 min后脱色液脱色至背景干净，观察分析是否表达并确定诱导条件。IPTG 诱导浓度为0.1 mM时的诱导结果如图2的Lane 1-2所示，确定诱导浓度为IPTG 诱导浓度为0 .1 mM。
继续在37℃下以200 rpm摇菌诱导5h，分别吸取1mL菌液8000rpm离心10min弃上清收菌，加灭菌水40 μL重悬后添加10 μL 5 x SDS-PAGE上样缓冲液（+β-巯基乙醇），开水煮样10 min，SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染色液染色20 min后脱色液脱色至背景干净，观察分析是否表达并确定诱导条件。IPTG 诱导浓度为0.1 mM时的诱导结果如图2的Lane 1-2所示，确定诱导浓度为IPTG 诱导浓度为0 .1 mM。
[0028] ③诱导表达：取3个阳性转化表达菌株，摇菌过夜，第二天按照1%的比例接种含卡那霉素的LB培养基200 mL，在37℃下，200 rpm培养3 h至OD 600为0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.1 mM，继续在37℃下以200 rpm摇菌诱导5h，8000 rpm离心10 min弃上清收菌，用Buffer Ⅰ冲洗并重悬，转移至50 mL离心管中，体积为20 mL，暂存于4℃。将菌液超声破碎20 min左右直至液体澄清。破碎后的菌液在4℃下以10000 rpm的转速离心10 min收取上清，即为蛋白粗品。
[0029] （3） 蛋白纯化及复性①镍柱亲和层析纯化：采用传统过镍柱的方法进行蛋白纯化。0.2 M硫酸镍挂柱1-2 h，之后分别用50 ml超纯水和50 ml Buffer Ⅰ过柱。含有蛋白粗品的上清液孵育20 min后缓慢过柱，以50 ml BufferⅠ平衡后用杂蛋白洗脱液过柱以去除杂蛋白，之后用洗脱液洗脱His标签蛋白，经SDS-PAGE检测后，含有目的蛋白的洗脱液于4℃暂存。
[0030] ②透析复性：将洗脱液加入透析袋中，分别用含有梯度尿素的复性液透析去除尿素，最后用只含Tris的复性液透析，以液氮速冻复性蛋白后保存于-80 ℃。SDS-PAGE电泳分析并用BCA试剂盒检测纯化蛋白浓度。蛋白纯化结果如图2的Lane 3所示。
[0031] （4） 抗体制备和Western-blot检测复性蛋白经超纯水透析去除Tris后冷冻干燥用于免疫6周龄小鼠。100μg RpMacin与完全弗氏佐剂混合乳化进行小鼠腹腔注射，两周后100μg RpMacin与不完全弗氏佐剂混合乳化接种小鼠。第三和第四次为尾静脉注射，间隔一周，每次注射量50 μg。最后一次注射后7天牺牲小鼠收集抗血清。
[0032] 蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并切割合适大小，备好大小适宜的滤纸和硝酸纤维素膜，电转液浸湿上述物品后，蛋白转移槽内从负极到正极按顺序摆放：海绵，三层滤纸，蛋白胶，硝酸纤维素膜，三层滤纸，海绵。每放入一层需以镊子赶走气泡。合上胶板放入转膜槽中，加入电转液，转膜槽置于冰盒中，200 mA电流转膜2 h；封闭：将膜置于一洁净小盒中，用5%的脱脂牛奶在摇床上轻摇2 h进行封闭；一抗孵育：TBST洗膜2次，每次5 min，按1：3000加入抗血清，摇床上孵育2 h；二抗孵育（兔抗鼠 IgG-HRP 抗体）：TBST洗膜3次，每次5 min，按
1：5000加入二抗，摇床上孵育2 h；显色：TBST洗膜3次，每次5 min，滴加ECL显色液，于显色仪中显色并保存照片。Western-blot检测结果如图2的Lane 4所示。
1：5000加入二抗，摇床上孵育2 h；显色：TBST洗膜3次，每次5 min，滴加ECL显色液，于显色仪中显色并保存照片。Western-blot检测结果如图2的Lane 4所示。
[0033] 实施例3一种靶向抗菌重组蛋白（靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2重组蛋白）最小抑菌浓度（MIC）测定：
（1）检测菌包括哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）八种革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）两种革兰氏阳性菌。
（1）检测菌包括哈氏弧菌（Vibrio harveyi）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、灿烂弧菌（Vibrio splendidus）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes）八种革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）两种革兰氏阳性菌。
[0034] （2）检测方法：用相应的培养基培养供试菌株至对数生长期，在酶标仪中检测OD600值，用相应培养基将其调整为0.001后加入梯度稀释的重组蛋白进行孵育，30 ℃培养24 h后在酶标仪中测定OD 600值。每孔菌悬液用量为90 μL，重组蛋白用量为10 μL。重组蛋白VpBDef-2梯度稀释后，蛋白浓度分别为28.8 μM、14.4 μM、7.2 μM、3.6 μM、1.8 μM、0.9 μM、0.45μM、0.225 μM、0.1125 μM。具体结果见表1，目的蛋白的最小抑菌浓度用[a]-[b]表示，其中[a]代表待测细菌继续生长的最大浓度，[b]代表细菌完全被杀灭的最低浓度。
[0035] 表1 VpBDef-2重组蛋白最小抑菌浓度（MIC）测定结果微生物名称 MIC（VpBDef-2，μM）
革兰氏阳性菌
Staphyloccocus aureus 1.8-3.6
Micrococcus luteus 0.45-0.9
革兰氏阴性菌
Vibrio harveyi 0.45-0.9
Vibrio anguillarum 0.9-1.8
Vibrio parahaemolyticus 0.9-1.8
Vibrio splendidus 0.45-0.9
Enterobacter cloacae 1.8-3.6
Escherichia coli 0.9-1.8
Proteus mirabilis 0.9-1.8
Enterobacter aerogenes 1.8-3.6
结果表明VpBDef-2重组蛋白对所有供试菌株均表现出杀菌作用。其中，VpBDef-2重组蛋白对哈氏弧菌、灿烂弧菌和藤黄微球菌杀菌作用较强，最小抑菌浓度介于0.45-0.9μM。综上，VpBDef-2具有广谱的杀菌活性，且对弧菌类和藤黄微球菌具有较强的杀灭作用。
革兰氏阳性菌
Staphyloccocus aureus 1.8-3.6
Micrococcus luteus 0.45-0.9
革兰氏阴性菌
Vibrio harveyi 0.45-0.9
Vibrio anguillarum 0.9-1.8
Vibrio parahaemolyticus 0.9-1.8
Vibrio splendidus 0.45-0.9
Enterobacter cloacae 1.8-3.6
Escherichia coli 0.9-1.8
Proteus mirabilis 0.9-1.8
Enterobacter aerogenes 1.8-3.6
结果表明VpBDef-2重组蛋白对所有供试菌株均表现出杀菌作用。其中，VpBDef-2重组蛋白对哈氏弧菌、灿烂弧菌和藤黄微球菌杀菌作用较强，最小抑菌浓度介于0.45-0.9μM。综上，VpBDef-2具有广谱的杀菌活性，且对弧菌类和藤黄微球菌具有较强的杀灭作用。
[0036] 实施例4采用一种靶向抗菌重组蛋白（靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2重组蛋白），进行模拟生物膜实验，具体包括以下步骤：
（1）金电极表面DPPTE自组装单层膜的构建
金电极经砂纸打磨、氧化铝粉末抛光、超声清洗、浓硫酸处理后，于0.1 M硫酸溶液中，在0-1.6V电位区间内，以100 mV/s的速度扫描20周，蒸馏水清洗用氮气吹干。随后将处理好的金电极浸入2 mM DPPTE的无水乙醇溶液中静置16 h以形成自组装单层膜。将电极浸于无水乙醇中静置2 min以除去表面多余的DPPTE分子, 超纯水冲洗后用氮气吹干。
（1）金电极表面DPPTE自组装单层膜的构建
金电极经砂纸打磨、氧化铝粉末抛光、超声清洗、浓硫酸处理后，于0.1 M硫酸溶液中，在0-1.6V电位区间内，以100 mV/s的速度扫描20周，蒸馏水清洗用氮气吹干。随后将处理好的金电极浸入2 mM DPPTE的无水乙醇溶液中静置16 h以形成自组装单层膜。将电极浸于无水乙醇中静置2 min以除去表面多余的DPPTE分子, 超纯水冲洗后用氮气吹干。
[0037] （2）“涂抹-冷冻”法构建磷脂双分子层以正癸烷溶解DPPC，终浓度20 mg/mL，滴加5μL该溶液于已构建好DPPTE自组装单层膜的金电极上，室温静置5 min后于−20 ℃冰箱继续静置30 min左右，待溶剂挥发，将电极取出，再次于室温下静置20 min，最后将电极浸于0.1 M KCl溶液中使其自发形成磷脂双层膜。
[0038] （3）电化学检测实验采用交流阻抗法，在三电极系统上进行电化学检测，其中，工作电极为双分子层金电极，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂电极。电解液为5 mM铁氰化钾+0.1 M氯化钾+
0.1 M PBS（pH 6.8）。用微量注射器分别将0.25×、0.5×、0.75×以及1.0×MIC的VpBDef-2重组蛋白加入电解液中，磁力搅拌器辅助搅拌均匀后与s-BLMs作用5min再进行检测。检测的频率范围为0.01-100 kHz，信号振幅为1 0mV，所得实验数据用Echem公司ZsimpWin软件进行处理。
0.1 M PBS（pH 6.8）。用微量注射器分别将0.25×、0.5×、0.75×以及1.0×MIC的VpBDef-2重组蛋白加入电解液中，磁力搅拌器辅助搅拌均匀后与s-BLMs作用5min再进行检测。检测的频率范围为0.01-100 kHz，信号振幅为1 0mV，所得实验数据用Echem公司ZsimpWin软件进行处理。
[0039] 实验结果如图3所示，电荷转移电阻随孵育VpBDef-2重组蛋白浓度的增高而逐渐降低，表明VpBDef-2重组蛋白跨过生物膜，且生物膜未被破坏。
[0040] 实施例5：采用一种靶向抗菌重组蛋白（靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2重组蛋白）与核酸进行结合作用实验，具体步骤为：提取大肠杆菌总DNA，紫外分光光度计检测核酸浓度。将DNA溶液分装，分别添加不同浓度的VpBDef-2重组蛋白与之混合，在24℃下孵育，随后进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测条带迁移差异。
[0041] 实验结果如图4所示，随孵育VpBDef-2重组蛋白浓度的增高，DNA位移减少，表明DNA与VpBDef-2重组蛋白有一定的结合，且这种结合具有浓度依赖性。
[0042] 实施例6：采用一种靶向抗菌重组蛋白（靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2重组蛋白）抑制白菜和黄瓜角斑病的实验，具体步骤为：采用0.1×MIC VpBDef-2重组蛋白喷涂于白菜和黄瓜叶片表面，采用丁香假单胞细菌进行攻毒实验，对照组为未喷涂VpBDef-2重组蛋白的蔬菜组，统计实验组和对照组角斑病发病率。
[0043] 研究发现，喷涂VpBDef-2重组蛋白后，可抑制丁香假单胞细菌引起的白菜或黄瓜角斑病，抑制率分别为35%和32%。
[0044] 应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
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