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预防骨关节炎的方法和化合物

阅读：236发布：2020-05-26

专利汇可以提供预防骨关节炎的方法和化合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本申请涉及利用抑制AMPA和KA谷氨酸受体(GluR)中的一种或两种的化合物预防早期或晚期的创伤后骨关节炎的治疗剂和药物组合物，其用途以及方法。，下面是预防骨关节炎的方法和化合物专利的具体信息内容。

权利要求

1.AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其被配制以施用于由创伤受损的关节，其用于在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。
2.如权利要求1所述的用于预防或治疗创伤后骨关节炎(OA)的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其特征在于，所述疾病为早期(退变性关节病)或晚期(晚期OA)的创伤后OA。
3.如权利要求1或2所述的用于预防或治疗创伤后骨关节炎(OA)的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其特征在于，所述关节未患有骨关节炎(OA)或类风湿性关节炎(RA)。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其特征在于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、6,7-二硝基喹喔啉-2,3-二酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸)、4-(8-甲基-9H-1,3-二氧杂环戊并[4,5-h][2,3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)、1-萘基乙酰基精胺(1-NAS)、以及1-(4'-氨基苯基)-3,5-二氢-7,8-二甲氧基-4H-2,3-苯并二氮杂卓-4-酮(CFM-2)。
5.如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA拮抗剂，其特征在于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、6,7-二硝基喹喔啉-2,3-二酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸)、4-(8-甲基-9H-1,
3-二氧杂环戊并[4,5-h][2,3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)、1-萘基乙基精胺(1-NAS)、以及1-(4'-氨基苯基)-3,5-二氢-7,8-二甲氧基-4H-2,3-苯并二氮杂卓-4-酮(CFM-2)。
6.如权利要求1-3中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的KA GluR拮抗剂，其特征在于，所述拮抗剂选自：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、6,7-二硝基喹喔啉-2,3-二酮(DNQX)、NS102、犬尿喹啉酸、替占帕奈、2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)、γ-谷氨酰基乙胺、5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸)、以及4-(8-甲基-
9H-1,3-二氧杂环戊并[4,5-h][2,3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其中所述拮抗剂以1-100mM的浓度施用。
8.如权利要求7所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其中所述浓度为2.5-25mM。
9.如权利要求8所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其中所述浓度选自：2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、12.5mM、15mM 17.5mM、20mM、22.5mM或25mM。
10.如权利要求1-9中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其中所述AMPA和/或KA GluR拮抗剂为可注射的液体或局部制剂的形式。
11.如权利要求1-10中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其中所述AMPA和/或KA GluR拮抗剂为溶液或悬液形式。
12.如权利要求1-11中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其中所述损伤选自：关节软骨表面损伤、骨折、韧带松弛或缺陷、韧带和/或半月板和/或肌腱破裂、关节囊和滑膜损伤、髌骨功能障碍、以及关节软骨的压迫和/或剪切损伤。
13.包含权利要求1-12中任一项所述的AMPA和/或KA GluR拮抗剂的药物组合物，其中所述药理活性拮抗剂在溶液中，所述组合物被配制以施用于关节，并包含溶剂和/或稳定剂。
14.包含权利要求1-12中任一项所述的AMPA和/或KA GluR拮抗剂的药物组合物，其中所述药物组合物为乳霜、软膏、胶状物或粉末形式。
15.如权利要求13或14所述的药物组合物，其中所述组合物被配制以施用于哺乳动物。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物被配制以施用于人、马、猪、犬、猫科动物、有蹄类动物、灵长类动物或任何承重肢体型哺乳动物。
17.如权利要求1-12中任一项所述的用于预防或治疗创伤后OA的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，或者如权利要求13-16中任一项所述的药物组合物，其中所述受损的关节选自：脚趾、踝关节、膝关节、后膝关节、臀部、手指、腕关节、肘关节或肩部、脊柱关节以及肋骨。
18.包含AMPA和/或KA GluR拮抗剂以及至少一种其它治疗剂的组合治疗剂，其被配制以施用于由创伤受损的关节，其用于预防所述受损的关节的创伤后骨关节炎。
19.如权利要求18所述的组合治疗剂，其中所述组合治疗剂包含权利要求1-12中任一项所述的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，以及可用于预防或治疗创伤后OA的至少一种其它治疗剂。
20.预防受损的关节的创伤后骨关节炎的方法，其包括在所述关节受损时或大约受损的时候，向个体施用被配制以施用于所述关节的AMPA和/或KA GluR拮抗剂。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述AMPA和/或KA GluR拮抗剂如权利要求1-12中任一项所述。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述疾病为早期(退变性关节病)或晚期(晚期OA)的创伤后骨关节炎(OA)。
23.如权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述AMPA和/或KA GluR拮抗剂为权利要求18或19所述的组合治疗剂的形式。
24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述拮抗剂在人中以下述剂量施用：
0.03mg/kg或约0.03mg/kg。
25.基本如本文所述的权利要求1-12和17所述的用途，权利要求13-16所述的药物组合物，权利要求18-19所述的组合治疗剂，或者权利要求20-24所述的方法。
26.AMPA和/或KA GluR拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于向由创伤受损的关节施用以在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。

说明书全文

预防骨关节炎的方法和化合物

[0001] 本发明涉及利用抑制(α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸)(AMPA)和红藻氨酸(KA)谷氨酸受体(GluRs)中的一种或两种的化合物，预防早期或晚期的创伤后骨关节炎的治疗剂和药物组合物，其用途以及方法。

[0002] 骨关节炎(OA)为涉及关节软骨和骨，特别是软骨下骨的机械异常的退变性关节病，如关节退变。骨改变通常在软骨丧失之前。它可以由多种因素引起，包括遗传、发育、代谢和力学。在后面的情况下，急性创伤如在个体生命的某一阶段的关节或肢体的损伤可促成后期的病况，在一些情况下相当迟，即5-15年后。的确，在NHS每年为矫正半月板撕裂实施的95,000例前交叉韧带重建(ACL)手术和38,000例关节镜检查中，受治疗的患者有50％在5-15年后发展为早期OA。这些患者中的一部分继续需要全关节置换治疗，这是极其常见且昂贵的方案，经受膝关节置换手术的患者有高达20％未成功。类似地，膝关节半月板撕裂和任何关节中的肌腱/韧带/关节盘损伤易于关节退变，在多年之后最终导致骨关节炎。

[0003] OA的症状可以包括关节疼痛，导致活动丧失、压痛、僵硬、锁闭、以及有时积液。患者还可能经受肌肉痉挛和肌腱收缩。偶尔地，关节还可能充满液体。由于活动减弱，邻近的肌肉可能萎缩，并且韧带可能变得更加松弛。

[0004] 尽管体内的任何关节都可能被影响，但是OA通常受累手、脚、脊柱和较大的负重关节，如髋和膝关节。随着OA的发展，受累关节形状改变、僵硬且疼痛，并且通常在轻微使用时感觉稍好，但是过度或长期使用时感觉更差，因而将该疾病与类风湿性关节炎区分开。此外，并且更深远地，基于RA是自身免疫性的全身性疾病，而OA不涉及全身性的免疫应答且是局部性的，OA可以与RA区分开来。

[0005] 在较小的关节(如手指)中，可能形成被称为希伯登氏结节(远端指间关节处)和/或布夏尔氏结节(近端指间关节处)的硬骨肿大，并且尽管它们不一定疼痛，但是明显限制了手指的活动。位于脚趾的OA导致拇囊炎的形成，使其变红或肿胀。一些人在其经受任何疼痛之前，注意到了这些身体变化。

[0006] 在美国，OA是关节炎的最常见形式，并且是慢性残疾的主要原因。它在美国影响了近2700万人，在英国影响了约8百万人。膝关节OA是最常见的肌肉骨骼疾病之一，影响了近2亿5千1百万人。在这些人群中，特别值得关注的是超过30％的患有急性前交叉韧带(ACL)或半月板损伤的患者在损伤后5年内发展为放射学(radiographic)膝关节OA。关节创伤可能导致一系列急性损伤，包括骨软骨骨折、韧带或半月板撕裂以及关节软骨损伤。这通常与关节内出血有关，并且引起创伤后关节炎症。尽管解决了急性症状并且可以手术修复一些损伤，但是关节损伤引起了软骨、骨和其它关节组织中的慢性重建过程，这引发了合成代谢和分解代谢过程之间的炎性和代谢失衡，组织重建和生物力学变化。这些生物力学和生物化学变化之间的相互作用将进程引导退变性关节病，这最终导致关节衰退。

[0007] 因此，存在暗示损伤具有发展为关节退变和OA的可能性的有力证据。确实，这导致了被称为创伤后骨关节炎(PTOA)的OA疾病的子集的定义，即多年之后可能导致OA的损伤继发性退变性关节病。在年轻人和活跃个体如参与运动的那些个体中特别普遍，在运动期间会增加持续此类损伤的风险。因此，其可被定义为损伤之前正常关节存在，损伤时结构受损且该关节未受全身性疾病损坏(Pickering,1984)。关节创伤受累全部关节组织，导致可能发展为关节退变并随后发展为OA的生理学、生物力学和生物化学变化。

[0008] 治疗通常包括运动、生活方式改变和镇痛药的组合。如果疼痛使人虚弱，则可能需要关节置换手术以改善生活质量。关节损伤后有时推荐手术干预以矫正异常的关节生物力学，降低继发性损伤的风险，并理想地降低OA的风险。不幸地，手术干预(例如ACL重建、半月板切除术、半月板置换)未恢复正常的关节生物力学或预防膝关节OA。因此，重要的是了解这些患者中的哪些将发展为早发性膝关节OA以及膝关节OA的这种发作是否可以预防或延迟。同时，疼痛管理和手术是当前的选择，目前没有解决创伤后关节炎及其预防的被批准的疗法。对于关节创伤后发展为OA的风险有清晰的认识，因此明显且迫切需要开发并实施预防创伤后软骨退变的方案。

[0009] 氨基酸谷氨酸是脊椎动物神经系统中主要的神经递质。然而，与传入和交感神经终端一样，谷氨酸由滑膜关节中的众多细胞释放，所述细胞包括巨噬细胞、淋巴细胞、滑膜细胞、成骨细胞和软骨细胞。谷氨酸通过与各种GluR结合而发挥其生理作用，所述GluR被分为功能上不同的两类：离子型(iGluR)和促代谢型(mGluR)。

[0010] iGluR担当谷氨酸门控离子通道，基于其药理学被分为三种不同的亚群：N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)以及红藻氨酸(KA)。mGluR是G蛋白偶联的受体，根据其结构和生理活性可分为八种不同的亚型(mGluR1-8)。谷氨酸能信号通路由五种高亲和力的Na+依赖型兴奋性氨基酸转运蛋白(EAAT)调节：EAAT1/GLAST、EAAT2/GLT-1、EAAT3/EAAC1、EAAT4以及EAAT5。在滑膜关节中，功能性GluR和EAAT由滑膜细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、巨噬细胞以及淋巴细胞表达。

[0011] 我们最近的数据显示，人成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)表达调节FLS释放IL-6和proMMP2的功能性GluR(27)。

[0012] 已知IL-6的浓度在来自阳性RA患者的滑膜组织和滑液中显著升高，并与放射学关节破坏相关。IL-6通过诱导血管生成、炎性细胞的浸润和滑膜增生促进滑膜炎，通过诱导破骨细胞形成引起骨吸收，并且通过刺激滑膜细胞和软骨细胞的基质金属蛋白酶(MMP)表达引起软骨退变。RA中升高的IL-6水平主要由FLS产生，其中巨噬细胞和软骨细胞产生显著但更低的水平。IL-6-/-小鼠研究突出了IL-6在RA的病理学中的重要作用，其中关节炎的严重性降低和发作延迟是主要结果。如不能清除细菌感染并进行有效的T细胞记忆应答的IL-6 缺陷小鼠所示，用抗IL-6受体抑制剂托珠单抗治疗RA患者显著改善了滑膜炎和放射学变化，然而，这些显著益处通常伴随着对宿主免疫力的负面影响，如在IL-6缺陷的小鼠中所见，其不能清除细菌感染且增加有效T细胞记忆应答。

[0013] 我们最近公开的数据(Flood等2007)显示，NMDA受体的激活降低了人RA FLS的proMMP-2的释放。非竞争性NMDAR拮抗剂MK801显著增加了RA中的proMMP-2的释放，但在正常的FLS中不能如此。然而，竞争性NMDAR拮抗剂D-AP5以及AMPA/KA受体拮抗剂CFM-2和NBQX不影响FLS中MMP-2的表达。该项工作显示，RA FLS中NMDA GluR的激活依赖于拮抗剂的性质。

[0014] 此外，高谷氨酸浓度通过KA受体的激活增加了RA FLS中的IL-6的释放，并且这受AMPA/KA受体拮抗剂NBQX而不受AMPA受体拮抗剂CFM-2或者不受NMDA受体抑制剂MK801或D-AP5的抑制。这显示对IL-6的作用由红藻氨酸受体而非AMPA或NMDA受体介导。

[0015] 我们意外发现，当没有OA疾病的实证时，通过在损伤时或大约损伤时向关节施用，特别是AMPA和KA(AMPA/KA)GluR抑制剂的子集在创伤后发展为OA的预防性防止中具有治疗益处。在希望不受任何生物学解释限制的情况下，我们认为损伤时与疾病相关的滑液谷氨酸浓度的增加激活了AMPA/KA GluR，反过来导致骨重建、力学响应、炎症、疼痛以及不期望的退变。因此，在损伤时或不久之后，可以治疗性地靶向此类GluR，以预防导致充分发展期或晚期OA的中期至长期退变性关节病的后续发展。

[0016] 在该项工作之前，在关节炎，更具体而言在OA的情况中，GluR拮抗剂已经被全身性独占使用，以通过药物对神经传递的作用减轻患有确确诊或晚期OA疾病的患者的疼痛和/或炎症性疼痛。在退变过程中，与OA相关的疼痛通常很晚才出现，这是为什么OA随着损伤之后症状出现必定很难治疗。事实上，疼痛的存在是关节炎的临床诊断的一部分。这意味着当给予药物治疗以预防OA发作/发展时，不会给予药物治疗以阻止疼痛。事实上，按照定义，处于发展OA风险(例如ACL断裂、半月板撕裂、肩袖损伤等之后)的患者不会患有关节炎(即x射线下关节空间狭窄)。迄今为止的所有工作都集中于对显示疾病的患者的疼痛进行治疗，甚至利用全身给药，因为这些药物的主要效果是通过其对脑和脊髓的作用。例如，Martel-Pelletier(2012)报道了KA受体拮抗剂在伤害性感受中发挥作用，以及对离子型谷氨酸受体iGluR5拮抗剂LY545694治疗膝关节OA的中枢神经系统疼痛进行了测试，但未作为改变疾病的OA药物或在处于发展OA的风险的患者中进行测试。此外，Szekely等(1997)报道了口服施用AMPA/KA受体的非竞争性拮抗剂GYKI 52466在啮齿动物关节炎(通过向右后爪注射0.1ml弗氏佐剂诱导)中对于慢性疾病的第二阶段的右爪的初期水肿或左爪的继发性泛发性炎症诱导的肿胀无作用，但是减弱了痛觉过敏和体重减轻，显示了对慢性疼痛的中心效应用。该研究显示出没有疾病改变作用，且涉及中枢性疼痛机制。

[0017] 相反，我们已经确定：当没有关节OA的证据时，iv)在创伤时或之后不久，向iii)受损的关节i)直接或靶向递送ii)GluR拮抗剂的特定子集，显著预防或降低了发展早期OA，即导致晚期OA的退变性关节病的可能性(即拮抗剂的作用是预防性的而非治疗性的)。因此，本发明对于预防作为关节损伤的结果而发生的OA疾病具有极好的潜力。一旦OA疾病被确诊，则本发明与治疗或逆转OA疾病无关。

发明内容

[0018] 在本发明的第一方面，提供了被配制以施用于关节的AMPA和/或KA GluR拮抗剂，其用于在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。

[0019] 在本发明的可选的第一方面，提供了AMPA和/或KA GluR拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于向关节施用以在受损的关节中预防创伤后骨关节炎或降低发展为创伤后骨关节炎的可能性。

[0020] 最优选地，所述关节为由创伤损伤的关节。

[0021] 本文提及的创伤涉及导致改变的关节和组织生物力学或炎症、损害关节承受机械应力的能力的任何事件。例如，这包括但不限于可形成直接的宏观损伤和微观损伤的对关节的强力机械冲击，其可能损害组织如何分散关节负荷并引发组织退变。此外或可选地，包括关节挫伤、脱臼，肌腱和韧带损伤的低能损伤也可能引起类似的生物力学变化并导致病状。

[0022] 通常但不完全，这包括但不限于：关节软骨表面损伤、骨折、韧带和/或肌腱松弛或缺陷、韧带和/或半月板和/或肌腱破裂、关节囊和滑膜损伤、髌骨功能障碍、关节软骨的压迫和/或剪切损伤。

[0023] 在本发明的优选实施方案中，所述疾病为未患有类风湿性关节炎(RA)或OA的个体的早期或晚期的创伤后骨关节炎(OA)。

[0024] 适用于本发明的AMPA和/或KA GluR拮抗剂包括但不限于：6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、6,7-二硝基喹喔啉-2,3-二酮(DNQX)、NS102-选择性红藻氨酸受体而非AMPA受体、犬尿喹啉酸内源性配体和替占帕奈(Tezampanel)；2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)和γ-谷氨酰基乙胺或5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸)。特别优选的拮抗剂包括：2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)、6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)、替占帕奈和2,3-二羟基-6-硝基-7-氨磺酰基-苯并[f]喹喔啉-2,3-二酮(NBQX)和γ-谷氨酰基乙胺或5-N-乙基-谷氨酰胺(L-茶氨酸)、4-(8-甲基-9H-1,3-二氧杂环戊并[4,5-h][2,3]苯并二氮杂卓-5-基)-苯胺(GYKI52466)、1-萘基乙酰基精胺(1-NAS)以及1-(4'-氨基苯基)-3,5-二氢-7,8-二甲氧基-
4H-2,3-苯并二氮杂卓-4-酮(CFM-2)。本领域技术人员已知的其它GluR拮抗剂也可用于本发明。关于AMPA和/或KA受体的前述拮抗剂的活性可以总结如下。

[0025]拮抗剂 AMPA受体拮抗剂红藻氨酸受体拮抗剂
CNQX 是是
DNQX 是是
NS-102 弱是
犬尿喹啉酸* 是是
替占帕奈是是
NBQX 是是
L-茶氨酸* 是是
GYKI52466 是是
1-NAS 是否
CFM-2 是否
ACET 否是

[0026] *同时拮抗NMDA受体

[0027] 在本发明的另一方面，提供了被配制以施用于关节(理想地由创伤损伤的关节)的组合治疗剂，其包含AMPA和/或KA GluR拮抗剂以及至少一种其它治疗剂，其用于预防所述受损的关节的创伤后骨关节炎。

[0028] 更理想地，所述AMPA和/或KA GluR拮抗剂理想地为可注射的液体或局部制剂的形式。

[0029] 以溶液提供的本发明的治疗剂以溶液或悬液滴剂的形式分散药理学活性拮抗剂。药理学活性拮抗剂位于溶液中的药物组合物，除此之外，还包含溶剂和/或稳定剂。

[0030] 为了局部应用于皮肤，可将药理学活性拮抗剂制成乳霜、软膏、胶状物、粉末、溶液或悬液等。可用于所述药物的乳霜或软膏制剂是本领域已知的常规制剂，例如，如药剂学标准教科书(如《英国药典》)中所述。

[0031] 用于关节应用的药物制剂具有确保创伤处的高药物浓度和低全身性药物暴露的优势，因此降低了任何全身性不良事件的风险。此外，已经显示，药物的全身递送在关节处未达到必要的活性，因此关节的谷氨酸浓度未实现期望的技术效果，从而预防关节退变和疾病发作。

[0032] 在本发明的另一优选实施方案中，所述拮抗剂以1-100mM的浓度，更理想地以2.5-25mM的浓度提供，包括其间的各0.1mM浓度。最理想地，所述拮抗剂以选自包含2.5mM、5mM、
7.5mM、10mM、12.5mM、15mM、17.5mM、20mM、22.5mM或25mM的组的浓度提供。

[0033] 在本发明的另一优选实施方案中，提供了预防受损的关节的创伤后骨关节炎的方法，所述方法包括在所述关节受损时或大约受损的时候，向所述关节施用被配制以施用于所述关节的AMPA和/或KA GluR拮抗剂。

[0034] 在本发明的优选实施方案中，所述疾病为未患有类风湿性关节炎(RA)或骨关节炎(OA)的个体的早期或晚期的创伤后OA。

[0035] 更优选地，所述方法包括以下述剂量施用所述拮抗剂：人0.03mg/kg；大鼠10mg/kg；以及小鼠30mg/kg。

[0036] 本文描述的发明用于哺乳动物，特别是用于人，但是本发明也具有兽医应用，因而用于马、猪、犬、猫科动物、有蹄类动物、灵长类动物，或者用于确实能够继续发展为退变性关节病或肢体障碍如OA的任何承重肢体型动物。

[0037] 在本发明的任何前述方面的优选实施方案中，所述受损的关节包括但不限于任何四肢关节，如：脚趾、踝关节、膝关节、后膝关节、臀部、手指、腕关节、肘关节或肩部，或者包括颈和任何肋骨的任何脊柱关节。

[0038] 贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包括”和“包含”以及所述词语的变体，例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”，意为“包括但不限于”，并且不排除其它部分、添加物、组分、整数或步骤。贯穿本说明书的描述和权利要求，单数涵盖复数，除非上下文另有要求。特别地，当使用不定冠词时，本说明书应被理解为预期复数以及单数，除非上下文另有要求。

[0039] 在此将本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请以引用的方式并入。未认可任何参考文献构成现有技术。此外，未认可任何现有技术构成本领域公知常识的一部分。

[0040] 可以结合任何其它方面来描述本发明各方面的优选特征。

[0041] 根据下述实例，本发明的其它特征将是显而易见的。一般而言，本发明延伸至本说明书(包括所附的权利要求和附图)中公开特征的任何创新性特征或任何创新性组合。因此，与本发明的具体方面、实施方案或实施例一同描述的特征、整数、特性、化合物或化学部分应被理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与此不相容。

[0042] 此外，除非另有说明，本文公开的任何特征均可被用于相同或相似目的的可选特征替代。

[0043] 现在将参考下述实施例和附图更详细地描述本发明，其中：

[0044] 图1a和b.初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的膝关节的肿胀、滑膜炎症和IL-6mRNA表达。(A)与AIA大鼠相比，在21天内，在NBQX处理的大鼠中发现显著更小的膝关节肿胀(***P<0.001)。(B)与AIA大鼠相比，在NBQX处理大鼠的右侧发炎膝关节中发现显著更少的IL-6mRNA表达(*P<0.05)。(C和D)第21天解剖的大鼠膝关节中的滑膜炎症的组织病理学分析。(C)与AIA大鼠相比，NBQX处理的大鼠具有显著更低的炎症评分(***P<0.001)。(D)来自初始动物的正常滑膜衬里层(SL)为2-4层细胞厚，在其正下方具有脂肪组织(Ad)，并且正常关节面(AS)由软骨下骨(Bo)之上的一层光滑软骨(Ca)组成。AIA大鼠中出现的滑膜增生(血管翳形成(P))、渗出物(E)、浸润(I)和关节面退变，在NBQX处理的大鼠中没那么严重。
MTP，内侧胫骨平台；LTP，外侧胫骨平台；MFC，内侧股骨髁；LFC，外侧股骨髁；M，半月板。较大关节图片上的框显示下方图片的拍摄位置。比例尺：(C-E)1mm，(F、H和J)50μm，(G、I和K)100μm。

[0045] 图2a和b.初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的足迹分析。(A)在第一天，来自三个实验组的后肢足迹轨迹。AIA大鼠通常缺少右侧足印(圈出的)，而AIA+NBQX处理的大鼠显示出与初始动物类似的步态模式。上方图显示了足旋转程度、跨步长和站立宽度的测量。(B-D)右侧发炎肢体的足旋转(B)、站立宽度(C)和跨步长(D)分析。数据以组平均值+/-SEM示出。(B)与初始大鼠相比，AIA和AIA+NBQX处理的大鼠右侧肢体具有显著更大的足旋转程度。在第1天和第2天，AIA大鼠不能承重，因此在图上缺少数据点。与初始相比，AIA和AIA+NBQX处理的大鼠的站立宽度增加(C)而跨步长减小(D)。与初始相比的AIA+NBQX，*P<0.05，**P<
0.001；与初始相比的AIA，#P<0.05，##P<0.001。

[0046] 图3a和b.在第21天解剖的初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的关节退变和重建。(A)来自各处理组的代表性大鼠的外侧股骨髁的甲苯胺蓝染色。(A和B)与AIA大鼠相比，AIA+NBQX大鼠显示出不太严重的软骨和骨病理学评分(P<0.001)。(C)当分为关节隔室时，与AIA大鼠的股骨髁相比，AIA+NBQX大鼠显示出显著更低的关节严重性评分(P<0.001)。通过甲苯胺蓝染色(A)显示，AIA大鼠中的大量骨重建在AIA+NBQX大鼠中显著降低(P<0.001)(A和D(BC参数))。(D)与AIA大鼠相比，AIA+NBQX大鼠中软骨细胞外形、蛋白聚糖损失和潮标完整性评分也更低(P<0.01)。MTP，内侧胫骨平台；LTP，外侧胫骨平台；MFC，内侧股骨髁；LFC，外侧股骨髁；CSI，软骨表面完整性；CA，软骨细胞外形；PL，蛋白聚糖损失；TI，潮标完整性；
BC，骨变化。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

[0047] 图4a和b.AIA和AIA+NBQX发炎的大鼠以及对侧对照大鼠膝关节中的宏观关节病状和骨表型mRNA表达。(A)X-射线分析显示AIA大鼠的胫骨平台和股骨髁严重糜烂(箭头)。AIA+NBQX大鼠显示出更光滑的关节表面，与对侧对照膝关节中所见的相似。(B)MRI分析验证了X-射线中所见的糜烂(箭头)，同时显示了AIA大鼠中存在严重的滑膜炎症(星号)。AIA+NBQX膝关节中的滑膜炎症大幅减少，关节糜烂也大幅减少。FC，股骨髁；TP，胫骨平台。(C-G)与AIA和AIA+NBQX的对侧对照膝关节相比，AIA发炎的膝关节中的组织蛋白酶K、胶原I、RANKL和RANKL/OPG比例mRNA表达水平显著增加。(C和D)与AIA+NBQX的对侧对照相比，发炎的AIA+NBQX膝关节中的组织蛋白酶K和胶原I mRNA表达也显著增加。(C)与AIA发炎的膝关节相比，在AIA+NBQX发炎的膝关节中发现组织蛋白酶K mRNA表达显著减少。(F)OPG的表达没有差异。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

[0048] 图5a-c.来自初始大鼠、AIA大鼠和AIA+NBQX大鼠的外侧股骨髁的KA1(A)和AMPAR2(B)的免疫组织化学。AIA和AIA+NBQX中出现更多的表达KA1和AMPAR2(黑色箭头)的初始大鼠的软骨细胞。在初始大鼠中，这两种蛋白都未定位于骨细胞或单核骨细胞(黑色三角形，初始×40图片)中，然而，在AIA和AIA+NBQX大鼠中，AMPAR2在骨细胞，主要在骨重建区域中表达(空心三角形，AIA×40图片)。在AIA大鼠中，单核骨细胞和骨重建区域的KA1和AMPAR2染色很强(AIA×40图片)。AIA+NBQX处理的大鼠显示更少的骨重建，以及随后两种蛋白的着色更浅(交叉线三角形，AIA+NBQX×40图片)。与初始大鼠和AIA+NBQX大鼠中所见的少量染色相比，在AIA大鼠中发现了大量的TRAP染色，显示存在更多破骨细胞(C)。连续切片显示了AIA大鼠的TRAP阳性破骨细胞中KA1和AMPAR2的表达(空心箭头)。在所有动物中，滑膜衬里层细胞都表达KA1和AMPAR2(数据未显示)。用×40物镜显示了较小图片中的黑框。相应的阴性对照(没有第一抗体)和兔IgG对照对于KA1和AMPAR2是阴性的(数据未显示)。比例尺：大图，100μm；小图，50μm。

[0049] 图6a和b.HTO手术之后，穿过关节的负荷变化后GluR和EAAT mRNA的表达。(A)在来自OA患者的内侧(暗线)和外侧(亮线)软骨下骨骨核检测到红藻氨酸GluR mRNA的表达。(B)在取自另一OA患者HTO手术时或术后6个月的骨核中，红藻氨酸GluR和EAAT1ex9skip mRNA的表达改变，与人骨中谷氨酸信号通路的力学调节一致。

[0050] 图7.定位于人OA样本(患者MS1)的内侧胫骨平台(MTP)中部的软骨中的GluR和转运蛋白代表性免疫组织化学。(A)AMPAR2的阳性染色出现在细胞中，并且从纤维化软骨表面直到中部/深部区域界面观察到染色，然而在潮标附近未观察到染色。在软骨的中上部区域染色最强。(B)从表面直到中部/深部区域界面观察到KA1阳性染色，而在潮标附近的深部区域未观察到染色。表面软骨细胞的染色出现于细胞中。(C)EAAT1未定位于该患者的软骨，然而在位于另一患者的纤维化软骨表面的软骨细胞克隆中观察到了微弱的染色(图8)。(D)EAAT3的阳性染色出现在细胞中，并且从纤维化软骨表面直到深部区域观察到染色，然而在潮标旁边未观察到染色。在表面附近染色最强。箭头指示潮标的位置。框指示更高倍放大图片的拍摄位置。比例尺：×5图，500μm；×20图，100μm。

[0051] 图8.来自OA患者(不同于图7的患者(JS2))MTP中部的纤维化软骨表面附近的EAAT1表达。在软骨细胞克隆的周围观察到该阳性染色。染色出现于细胞周围。箭头指示潮标的位置。框指示更高放大倍数的图片的拍摄位置。比例尺：×5图，500μm；×10图，200μm；×20图，100μm。

[0052] 图9.定位于人OA样本(患者MS1)MTP中部的骨中的GluR和转运蛋白代表性免疫组织化学。A、C、D、E和F都是来自MTP相同位置的图片。(A)番红-O染色以显示骨和软骨的结构。该区域已经被重建，并且潮标(TM)几乎完全消失。还观察到了潮标破坏(TMB)。这可能是血管侵入，但是需要CD34免疫组织化学对其进行验证。如密集表面和细胞构成所示，骨也经历了重建(BR)。(C)AMPAR2定位于重建区域，特别是TMB区域(箭头)。该染色出现于细胞周围。
在来自骨正常区域的骨衬里层细胞(B中的小箭头)中未观察到染色。偶尔观察到骨细胞AMPAR2染色，但是仅在小区域内(B中的大箭头)。(D)KA1定位于重建的骨中(箭头)，并且出现于细胞内。在正常骨的骨衬里层细胞或骨细胞中未观察到KA1染色。(E)EAAT1染色位于血管周围，并且在重建的骨(大箭头)和TMB区域(小箭头)被观察到。在正常的骨中未观察到阳性染色。(F)EAAT3定位于正常的骨(数据未显示)、重建的骨(大箭头)和TMB区域(小箭头)的骨衬里层细胞中。染色在细胞中以及细胞周围。观察到一些骨细胞染色(数据未显示)。比例尺：A、C、D、E和F，200μm；B，100μm。

[0053] 图10.定位于人OA样本(患者MS1)的滑膜中的GluR和转运蛋白代表性免疫组织化学。所有图片都来自滑膜组织中的相同位置。(A)苏木精和伊红染色以显示滑膜组织的结构。小箭头指示滑膜衬里层细胞，星号指示血管。大箭头突出了血管周围存在淋巴样聚集。该淋巴样聚集结合增厚的滑膜衬里层指示了滑膜组织的炎症。(B、C、D和E)AMPAR2、KA1、EAAT1和EAAT3都定位于滑膜衬里层的滑膜细胞和血管中。比例尺：200μm。

[0054] 图11.在MNX大鼠中NBQX处理之后的膝关节肿胀。按照右侧膝关节测量值减去左侧膝关节测量值来计算平均膝关节肿胀。在第8天，与初始大鼠(P<0.01)和用25mM NBQX处理的MNX大鼠(P<0.05)相比，用媒介物对照处理的MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。在第14天，与初始大鼠(P<0.05)、用12.5mM(P<0.05)和2.5mM(P<0.01)NBQX处理的大鼠相比，媒介物对照MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。MNX大鼠对比初始大鼠，ΔΔP≤0.01，ΔP≤
0.05；MNX+2.5mM NBQX对比初始大鼠，#P≤0.05；MNX+12.5mM NBQX，**P≤0.01，*P≤0.05；
MNX+25mM NBQX，●P≤0.05。MNX对比MNX+25mM NBQX，◇P≤0.05；MNX对比MNX+12.5mM NBQX，□P≤0.05；MNX对比2.5mM NBQX，○○P≤0.01。单因素ANOVA和费舍尔事后检验。

[0055] 图12.在MNX大鼠中，NBQX处理之后进行双足平衡测试。NBQX处理之后MNX大鼠的左后腿和右后腿之间的承重差异。在第8天，与初始大鼠(P<0.001)，12.5mM(P<0.05)、2.5mM(P<0.01)和25mM(P<0.01)NBQX处理大鼠相比，紧接着在第二次NBQX注射之后，媒介物对照处理的MNX大鼠的左腿和右腿之间的承重具有显著更大的差异。MNX大鼠对比初始大鼠，ΔΔΔP≤0.001，ΔΔP≤0.01，ΔP≤0.05；MNX+2.5mM NBQX对比初始大鼠，##P≤0.01，#P≤0.05；MNX+12.5mM NBQX对比初始大鼠，**P≤0.01，*P≤0.05；MNX+25mM NBQX对比初始大鼠，●●P≤0.01，●P≤0.05。MNX对比MNX+25mM NBQX，◇◇nP≤0.01，◇nP≤0.05；MNX对比MNX+12.5mM NBQX，□P≤0.05；MNX对2.5mM NBQX，○○P≤0.01，○P≤0.05。单因素ANOVA和费舍尔事后检验。

[0056] 图13.在韧带破裂的鼠中NBQX处理之后的膝关节肿胀。在第7天(P<0.05)和第21天(P<0.001)，与媒介物对照相比，在NBQX处理的鼠中发现了显著更小的膝关节肿胀。与第0天的测量值相比，从第2天开始，NBQX处理的鼠的膝关节肿胀未显示出显著差异。与第0天相比，媒介物处理的鼠在各时间点具有显著更大的膝关节肿胀。*对比第0天NBQX，**对比第0天对照，***对第0天对照，+NBQX对比对照，+++NBQX对比对照。

[0057] 图14.拍摄的左膝关节(未负荷)和右膝关节(负荷)的EAAC1免疫组织化学图片。1.1L1R0＝鼠ID。在关节内侧，以10×放大率(100μM比例尺)拍摄图片A和B，以40×放大率(100μM比例尺)拍摄图片C和D，以及以40×放大率(50μM比例尺)拍摄图片E、F、G、H，(空心三角形＝未染色的细胞，空心箭头＝染色的细胞)。(MTP＝内侧胫骨平台，MFC＝内侧股骨髁，M＝半月板，S＝滑膜)。在左腿和右腿上的骨衬里层细胞中(黑色三角形C和D)都存在明显染色。在整个软骨的软骨细胞和骨细胞的骨基质之间也存在染色(空心箭头)。尽管EAAC1是强抗体，仍存在一些未染色的软骨细胞和骨细胞(空心三角形)。然而，与左腿相比，右腿滑膜中存在大量染色。

[0058] 图15.拍摄的左膝关节(未负荷)和右膝关节(负荷)的红藻氨酸1免疫组织化学图片。1.3LOR1＝鼠ID。在关节内侧，以10×放大率(100μM比例尺)拍摄图片A和B，以40×放大率(100μM比例尺)拍摄图片C和D，以及以40×放大率(50μM比例尺)拍摄图片E、F、G、H(空心三角形＝未染色的细胞，空心箭头＝染色的细胞)。(MTP＝内侧胫骨平台，MFC＝内侧股骨髁，M＝半月板，S＝滑膜)。KA抗体在整个软骨的软骨细胞中具有强染色(空心箭头(F和H))。在未负荷的膝关节中存在一些染色的骨衬里层细胞(黑色三角形C)，在负荷的膝关节中具有更强染色(黑色三角形D)。骨细胞中几乎不存在染色。与未负荷的对照相比，负荷膝关节的滑膜中的更多细胞被阳性染色(A和B)。

[0059] 图16.拍摄的左膝关节(未负荷)和右膝关节(负荷)的GluR2免疫组织化学图片。1.1L1R0＝鼠ID。在关节内侧，以10×放大率(100μM比例尺)拍摄图片A和B，以40×放大率(100μM比例尺)拍摄图片C和D，以及以40×放大率(50μM比例尺)拍摄图片E、F、G、H，(空心三角形＝未染色的细胞，空心箭头＝染色的细胞)。(MTP＝内侧胫骨平台，MFC＝内侧股骨髁，M＝半月板，S＝滑膜)。GluR2抗体在整个软骨范围内的软骨细胞中具有强染色。与未负的对照(E和G)相比，在负荷膝关节的骨衬里层细胞中的染色更强(黑色三角形D)。如(E)和(G)中所示，存在更多的骨细胞染色，但是负荷和未负荷的腿之间存在较小差异。与未负荷的膝关节(A)相比，负荷的膝关节(B)中也可以观察到滑膜染色。

[0060] 材料和方法

[0061] 动物.

[0062] 实施的使用动物的所有方案都符合内政部(Home Office)的指南，并且遵循国际疼痛学会的指南。从Harlan(Oxfordshire,UK)获得雄性路易鼠(用于AIA)(～200g)，三只一组在常规笼中饲养。大鼠自由获取食物和水，并保持12小时光/暗循环。

[0063] 关节炎诱导和治疗方案.

[0064] 对于AIA，在7天的定居周期之后，向动物右侧皮下注射用等体积的弗氏完全佐剂(CFA；0.25mg结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)Sigma)乳化的甲基化的牛血清白蛋白(mBSA；0.5mg/ml；Sigma,Poole,UK)。7天之后，向左侧实施第二次皮下注射所述乳剂。第二次注射(第0天)之后14天，向15只大鼠的右膝关节实施关节内注射mBSA(50μl盐水中含有0.5mg)，以用作AIA组。另外15只大鼠的右膝关节接受关节内注射混合有2.5mM NBQX(Tocris,Bristol,UK)的0.5mg mBSA的50μl盐水。这些大鼠用作NBQX治疗组。所使用NBQX的浓度基于调查大鼠角叉菜胶性关节炎的疼痛的研究(1)。6只对照大鼠未接受皮下或关节内注射。

[0065] 膝关节肿胀.

[0066] 利用Mitutoyo(RTM)数显卡尺(RS Components Ltd,Northants,UK)对所有大鼠的发炎(右)和未发炎(左)的膝关节直径进行测量，以定量肿胀。在第0天(紧接着关节炎诱导之前)测量基线读数，以及在第1、2、3、4、7、9、14和21天对AIA大鼠进行测量。每一膝关节取3组读数，发炎的和未发炎的膝关节的平均值之间的差异以膝关节肿胀的毫米值给出。

[0067] IL-6ELISA.

[0068] 对于AIA，在基线处(第0天)和第1、2、3、7、14以及21天，通过尾部采血从各只大鼠收集血清。按照制造商的说明书，利用大鼠IL-6 试剂盒(R&D Systems,Abingdon,UK)定量来自各组的6只大鼠的IL-6水平。

[0069] 组织学疾病评估.

[0070] 在第21天，拣选9只AIA大鼠、9只NBQX大鼠和3只对照大鼠，将它们的膝关节完整解剖，并在10％中性缓冲福尔马林溶液(Sigma)中固定2天。将膝关节于4℃，10％的EDTA(Fisher Scientific,Loughborough,UK)中脱钙，在石蜡中包埋，以冠状平面进行切片(6μm)，并用苏木精和伊红对滑膜炎症进行染色，或者用甲苯胺蓝/番红-O对软骨进行染色，以及进行骨评分或者保存用于免疫组织化学分析。由不知情处理组的两名独立观察者对滑膜炎症和关节退变进行评分。利用已建立的评分系统对滑膜炎症进行评分(3)。简言之，对3个参数进行了评分：滑膜增生(血管翳形成)(0-3)、滑膜浸润(0-5)以及滑液渗出(0-3)，从而给出每一关节的最高评分11。利用改进的Mankin评分(表1)对关节退变进行评分，所述改进的Mankin评分由软骨表面完整性(0-6)、软骨细胞外形(0-2)、蛋白聚糖损失(0-4)、潮标完整性(0-2)和骨变化(0-3)组成，从而给出每一关节象限(quadrant)(内侧和外侧股骨髁(分别为MFC和LFC)以及内侧和外侧胫骨平台(分别为MTP和LTP))的最高评分17，每一膝关节总计最高68分。在每一膝关口中，对相距～500μm的两个代表性切片进行关节退变评分。

[0071] 足迹评分.

[0072] 如前所述，在第0、1、2、3、4、7、9、14和21天，通过足迹分析对后肢步行模式进行评估(4)。将6只AIA、NBQX和对照大鼠的后爪浸入无毒颜料中，然后让其在铺有纸的走道(1m长，10cm宽)自由行走。每个实验日，各大鼠进行三组每边至少两个步进循环(连续的6步)。对三个参数进行测量：肢体旋转(与行走方向平行的穿过脚垫中心的线与穿过第三足趾的线之间的角度)、跨步长(同侧脚之间的距离)和站立宽度(右侧和左侧步进循环的脚之间的距离)。

[0073] 宏观膝关节分析

[0074] 脱钙之前，通过射线照相术和MRI对整个膝关节进行检查。利用柯达FX Pro体内成像系统(Advanced Molecular Vision,Grantham,UK)获得9只AIA大鼠、9只NBQX大鼠和3只对照大鼠的发炎和未发炎的膝关节射线照片，利用柯达分子成像软件第5版，利用下述参数对图片进行分析：35kV下30秒曝光时间、4.96F-stop、71.4mm FOV、9.8mm焦平面。

[0075] 利用MRI实验中心(EMRIC,School of Biosciences,Cardiff University)的高空间分辨率MRI扫描方案对6只AIA大鼠和6只NBQX大鼠的发炎和未发炎的膝关节进行成像。在扫描之前，将每对膝关节包埋进50ml离心管内的1％琼脂糖(Promega)中。利用配备有发送-接收正交线圈的Bruker Biospin Advance 9.4T(400mHz)MRI系统来实施MRI。扫描采集参数如下：回声时间1250msec、重复时间24msec、视场640×280×280mm，矩阵640×280×280，以及翻转角180°。随后在ParaVision 5.1(Bruker)和Analyze 10.0软件(Mayo Biomedical Imaging Resource,Rochester,MN,USA)中观察和分析图片。

[0076] 谷氨酸受体和IL-6信使RNA(mRNA)表达.

[0077] 在第21天，从拣选的6只AIA大鼠和6只NBQX大鼠的发炎和未发炎的膝关节中切出半月板、髌骨、股骨干、股骨髁和胫骨平台。在HTO手术时，从患者中取出人骨核(bone core)，立即在干冰中保存，然后置于-80℃的冰箱中。如前所述，利用TRIzol(Invitrogen,Paisley,UK)提取总RNA(5)，DNA酶处理(DNA-freeTM,Ambion,Warrington,UK)，再纯化并通TM过UV吸收进行定量。利用SuperScript III反转录酶(Invitrogen)和RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega)，将用随机引物(Promega,Southampton,UK)延伸的RNA(300ng)反转录并进行RT-PCR(5)。设计引物(Primer 3)以延伸GluR、EAAT和IL-6基因的内含子，从而将基因组与互补DNA(cDNA)扩增(表2)区分开，并且将PCR产物克隆并测序以确定正确的扩增产物。将大鼠或人的脑和脾脏cDNA分别用作GluR和IL-6mRNA表达的阳性对照。通过具有优化的引物和MgCl2浓度的QRT-PCR(不含MgCl2的 Green JumpStartTM Taq ReadyMixTM)
(Sigma)以及热循环方案(表2)，利用MX3000P PCR系统和软件(Stratagene)对GluR和IL-6表达的变化进行评估。利用Pfaffl相对定量法(6)，将各基因的标准曲线(对于GluR和IL-6表达，分别为大鼠脑和脾脏cDNA)重复至少3次，以确保用于相对定量的引物效率(90-110％效率以及R2≥0.95)。利用NormFinder鉴定看家基因(GAPDH、HPRT1、eEF2和YWHAZ)最稳定的表达组合，以将靶基因标准化(7)。

[0078] 半月板横切(MNX)模型.

[0079] 我们已经建立了骨关节炎的半月板横切(MNX)大鼠模型。按照内政部许可实施手术切除，其中切穿并取出部分内侧副韧带，然后实施内侧半月板横切。在麻醉下实施手术。然后使动物从手术中恢复。

[0080] 利用MNX模型，我们对直接向膝关节注射NBQX的效果进行了测试。有如下5组雄性斯普拉格-杜勒大鼠，每组3只动物：

[0081] -MNX+无菌H2O(媒介物对照)

[0082] -MNX+2.5mM NBQX

[0083] -MNX+12.5mM NBQX

[0084] -MNX+25mM NBQX

[0085] -初始大鼠

[0086] NBQX处理的大鼠接受两次关节内注射，第一次紧接在MNX手术之后，第二次在7天之后。同时在皮下给予单次剂量的丁丙诺啡以减轻手术之后的疼痛。丁丙诺啡在长达12小时内有效且不影响炎症。在同一时间，媒介物对照大鼠接受以相同方式递送的无菌H2O注射。在21天内，在第0、1、2、3、7、8、10、14和21天，对重量、膝关节肿胀(数显卡尺)以及双足平衡(incapacitance)(Linton双足平衡测痛仪)进行测量。所述Linton双足平衡测痛仪测量将大鼠固定在透明有机玻璃盒时施加于每一后腿的重量。然后可以计算左腿和右腿之间的承重差异。在第21天，使所有大鼠安乐死，并将膝关节固定于福尔马林中用于组织学研究。

[0087] 创伤后膝关节骨关节炎的无创模型

[0088] 我们已经建立了由韧带破裂导致的创伤后膝关节退变的无创小鼠模型。该模型的无创性质意为大型手术影响疼痛、炎症而不会掩盖关节炎发作的早期变化，并且不需要假手术对照。

[0089] 利用定制的杯子支持弯曲的膝关节，向12周龄C57Bl6小鼠(n＝10)的右膝关节施加负荷(12N，4Hz，正弦波； 3200,BOSE,USA)。在负荷周期期间，施加的压缩力释放之后位移的持续增加显示在1-6个循环之间发生韧带破裂。左膝关节用作未负荷的对照。韧带破裂之后立即向小鼠右膝关节给予关节内注射20mM NBQX，而对照小鼠接受关节内注射无菌H2O(媒介物对照)。同时在皮下给予单次剂量的丁丙诺啡，以减轻负荷之后长达
12小时的疼痛。

[0090] 第一周每天都进行跛行评分，然后在接下来几周每隔几天进行跛行评分，以对动物的幸福和疼痛缓解的潜在需求进行评估。在第0、1、2、3、7、16和21天，利用数显卡尺对膝关节肿胀进行测量。在第21天，使所有的小鼠安乐死，并将膝关节固定于福尔马林中用于组织学研究。

[0091] 免疫组织化学

[0092] 动物操作:

[0093] 利用红藻氨酸抗体(抗KA1，1:400稀释)、AMPA受体-2抗体(抗离子型谷氨酸受体-2，1:100，都来自Abcam,Cambridge,UK)、GLAST抗体(GLAST11-S，1:100)以及EAAC1抗体(EAAC11-A，1:200，都来自Alpha Diagnostic International,Texas,USA)，逐次在石蜡膝关节切片(9个AIA膝关节、9个NBQX膝关节和6个对照膝关节)中对GluR和转运蛋白进行定位。同时在6只MNX大鼠和6只初始大鼠中对AMPAR2进行定位。将处理用于组织学研究的切片脱蜡，并在抗原修复之前，利用1mg/ml胰蛋白酶(Sigma)于37℃复水20分钟。将内源性过氧化物酶活性用0.3％的过氧化氢(Sigma)阻断30分钟，然后在1×TBS/0.1％吐温中洗涤三次，每次15分钟。用10％的正常封闭血清(Sigma)处理切片1小时，用第一抗体在4℃孵育过夜，然后在1×TBS/0.1％吐温中洗三次。按照制造商的说明，利用兔VECTASTAIN ELITE ABC辣根过氧化物酶试剂盒(Vector Laboratories,Peterborough,UK)对免疫染色进行检测。
利用镍增强二氨基联苯胺(DAB)(Vector Laboratories)使切片显色，在Mayer’s苏木精(Fisher Scientific)中复染，用自来水洗涤，脱水，在二甲苯中清洗，并封片。在Leica DMRB 显微镜下观察玻片。除非另外说明，所有的孵育都在室温进行。

[0094] 人体操作:

[0095] 利用与上述动物操作所详述的相同的抗体和技术，对来自三个人骨关节炎内侧胫骨平台样本的连续切片进行KA1、AMPAR2、EAAT1(GLAST)和EAAT3(EAAC1)免疫染色。

[0096] 统计分析.

[0097] 在参数(单因素ANOVA与费舍尔(Fisher’s)事后检验或Tukey-Kramer事后检验)或非参数(克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)与曼-惠特尼(Mann-Whitney)事后检验)统计检验之前，利用Minitab 16软件对数据进行正态分布和方差齐性检验。所有数据都以平均值±平均值的标准误(SEM)示出。

[0098] 结果

[0099] 通过NBQX处理降低了滑膜炎症和IL-6表达

[0100] 在诱导之后的最初几天，对AIA大鼠的膝关节肿胀的评估显示了严重的极性炎症应答(图1A)。在AIA大鼠中，第一天平均肿胀为4.4mm(±0.14mm)，然而在NBQX大鼠中，该水平显著更低，仅为2.95mm(±0.23mm)，表明NBQX处理之后峰值膝关节肿胀降低33％(P<0.001，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼-惠特尼事后检验)。在整个21天实验的各时间点，都观察到了NBQX处理大鼠的膝关节肿胀显著减弱(P<0.001，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼-惠特尼事后检验)。

[0101] AIA大鼠的血清IL-6浓度降至IL-6 试剂盒的最小可检测剂量(21pg/ml)以下，因此使其无法定量。

[0102] 从第21天对AIA大鼠关节组织中IL-6mRNA表达的研究显示，IL-6在股骨髁、股骨干、胫骨平台和髌骨中的表达水平太低不能被定量(尽管可检测到)。与AIA大鼠相比，在NBQX处理大鼠的发炎膝关节的半月板中，IL-6的相对表达水平显著更低(P<0.05，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验)(图1B)。尽管不显著，但是在左侧未发炎的膝关节中也观察到了相同的模式。

[0103] 对在第21天切除的AIA、NBQX和对照小鼠的膝关节滑膜炎症进行的组织学检查显示，与NBQX处理的大鼠相比，AIA大鼠的滑膜炎症评分更严重(P<0.001，单因素ANOVA与费舍尔事后检验)(图1C)。来自对照动物的正常滑膜衬里层为2-4层细胞厚，在其正下方具有脂肪组织，并且正常的关节面由软骨下骨之上的一层光滑的软骨组成(图1D)。在AIA大鼠中存在滑膜增生(血管翳形成)、渗出物、浸润和关节面退变(图1D)。这在NBQX处理的大鼠中明显不那么严重(图1D)。

[0104] NBQX处理恢复承重

[0105] 紧接着诱导关节炎之后的足迹分析显示了AIA与NBQX处理的大鼠之间的显著差异。虽然在第1天和第2天，AIA大鼠没有可测量的足迹(图2A和2B)，但是这些天NBQX大鼠能够承重，展现出可与对照大鼠中所见的那些比较的清晰足迹。来自足迹的步态参数分析显示AIA和NBQX处理的大鼠的行走异常，与对照大鼠相比时，足旋转程度(图2B，P<0.05)和站立宽度(图2C，P<0.05)显著更大，而跨步长(图2D，P<0.05)显著更短(单因素ANOVA和Tukey-Kramer事后检验)。在第14天，AIA和NBQX组的跨步长恢复正常，并且在第21天，所有组的站立宽度都是正常的。

[0106] 通过NBQX处理降低了膝关节退变

[0107] 与AIA大鼠相比，关节退变的组织学评估显示NBQX处理的大鼠中显著更少的软骨和骨病状(图3)。AIA大鼠显示关节软骨下的软骨损失以及大量的骨变化(图3A)。NBQX处理的大鼠显示与对照动物中所见的相类似的软骨和骨表型，在外边缘具有较少重建(图3A)。与AIA大鼠相比，NBQX处理大鼠的平均关节退变严重性评分显著降低(P<0.001，用克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验，图3B)。将关节分为4个隔室(MTP、LTP、MFC和LFC)，与AIA大鼠相比，NBQX处理大鼠的MFC和LFC中显示出显著更少的关节退变(分别为P<0.01和P<
0.05，克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验)(图3C)。将严重性评分分为5种参数，与AIA相比，显示尽管NBQX处理显著降低了软骨细胞外形(P<0.05)、蛋白聚糖损失(P<0.01)和潮标完整性(P<0.01)的评分，但是在骨变化中观察到了最大差异(P<0.001)(全部都为克鲁斯卡尔-沃利斯检验与曼惠特尼事后检验)(图3D)。

[0108] 在第21天，X射线和MRI显示AIA大鼠的关节糜烂和滑膜炎症(图4)。NBQX处理大鼠的X射线中观察到了较少的关节糜烂，其显示出更圆的光滑关节面，与对照动物的关节面更相似(图4A)。在第21天，AIA大鼠的MRI验证了X射线中所见的严重糜烂，同时显示出大量的滑膜炎症(图4B)。MRI显示，NBQX处理极大地降低了滑膜炎症以及关节糜烂(图4B)。

[0109] 通过NBQX处理改变了GluR的表达

[0110] KA1和AMPAR2蛋白在所有大鼠的软骨细胞和滑膜衬里层细胞中都表达(未显示)，并且在AIA的重建的骨中富集(图5)。在AIA和AIA+NBQX的重建区域中，骨中的骨细胞和其它单核细胞表达AMPAR2(图5B)。NBQX降低了重建的程度，伴随着GluR阳性细胞的明显减少(图5)。在初始动物中，没有AMPAR2和KA1定位于单核骨细胞中(图5)。AIA中富集的TRAP阳性破骨细胞在连续切片中共表达KA1和AMPAR2，并且在初始大鼠和AIA+NBQX大鼠中没那么大量(图5)。

[0111] 响应力学变化的GluR和EAAT表达

[0112] KA1的表达在胫骨平台的内侧和外侧之间有所不同，其中在内侧存在表达，在外侧不存在表达(图6A)。在不同的HTO患者中，HTO手术之后，EAAT1ex9skip的表达丧失，而KA1的表达开启(图6B)。

[0113] GluR和转运蛋白在来自三个人OA样本的内侧胫骨平台(MTP)中部的软骨、骨和滑膜中的定位

[0114] 在人OA软骨中观察到离子型GluR和转运蛋白的阳性染色：从纤维化软骨表面直到中部/深部区域观察到了AMPAR2、EAAT3和KA1。在纤维化的软骨表面附近观察到了EAAT1的表达。此外，AMPAR2、KA1、EAAT1和EAAT3定位于人OA组织的骨重建区域。此外，AMPAR2、KA1、EAAT1和EAAT3都定位于滑膜衬里层的滑膜细胞以及人OA组织的血管中。取自不同物种的组织的关节滑液中Glu浓度的比较示于表3中。

[0115] GluR的拮抗作用减弱了关节创伤之后的膝关节肿胀和病状

[0116] 利用MNX模型，经过手术的大鼠在手术之后立即接受关节内注射不同浓度的NBQX，并在7天之后进行第二次注射。在一些鼠中实施无菌水注射以用作对照。在21天内，在第0、1、2、3、7、8、10、14和21天，对重量、膝关节肿胀(数显卡尺)和双足平衡(Linton双足平衡测痛仪)进行测量。所有大鼠在整个实验中不断增加重量。NBQX对膝关节肿胀的效果令人鼓舞，特别是在第二次NBQX注射之后第8天和第14天(图11)。在第8天，与初始大鼠(P<0.01)和用25mM NBQX处理的MNX大鼠(P<0.05)相比，媒介物对照处理的MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。在第14天，与初始大鼠(P<0.05)，12.5mM(P<0.05)和2.5mM(P<0.01)NBQX处理的大鼠相比，媒介物对照MNX大鼠具有显著更大的膝关节肿胀。该数据支持我们先前在抗原诱导的关节炎(AIA)大鼠模型中的结果，并且表明NBQX对MNX手术之后的膝关节具有抗炎效果。

[0117] 双足平衡测试显示，在第8天，紧接着第二次NBQX注射之后，与初始大鼠(P<0.001)，12.5mM(P<0.05)、2.5mM(P<0.01)和25mM(P<0.01)相比，媒介物对照处理的MNX大鼠的左腿和右腿之间的承重具有显著更大的差异(图12)。该数据支持我们先前的结果：在紧接着注射之后的几天中，NBQX处理提供了疼痛缓解。

[0118] 利用我们的无创韧带破裂模型，在右膝关节给予创伤后的鼠关节内注射20mM NBQX。左膝关节用作未负荷对照。在一些鼠中实施无菌水注射以用作媒介物对照。在第0、1、2、3、7、16和21天，利用数显卡尺对膝关节肿胀进行测量。所有鼠在整个实验中不断增加重量。跛行评分未严重到足以批准疼痛缓解的额外剂量。NBQX对膝关节肿胀的效果令人鼓舞，伴随着在第7天(P<0.05)和第21天(P<0.001)，与媒介物对照相比，NBQX处理的鼠中显著更小的膝关节肿胀(图13)。此外，从第2天起，与第0天的测量值相比，NBQX处理鼠的膝关节肿胀未显示出显著差异。形成强烈对比的是，与第0天相比，媒介物处理的小鼠在每一时间点具有显著更大的膝关节肿胀，表明在没有NBQX的情况下，膝关节直径从未恢复至对照值。

[0119] 关节创伤之后的GluR和EAAT表达.

[0120] 使6只鼠的右膝关节负荷9N的最大负荷0.05秒，持续40个循环，其中各负荷循环之间的基线为2N。负荷循环的起落持续0.025秒。该周计划有3个负荷事件，其中在第二次负荷时ACL破裂(因此不需要第3次负载)。在第二次负荷事件之后两天(ACL破裂之后)拣选鼠，并切除膝关节。将6只小鼠的左关节用作未负荷对照。

[0121] 与未负荷对照相比，EAAC1(EAAT3)(图14)、KA1(图15)和GluR2(AMPAR2)的免疫组织化学在负荷膝关节的滑膜上显示更强的染色(图16)。染色在两个膝关节的整个关节组织中都存在，但是通常在负荷膝关节特别是骨中更强。

[0122] 讨论

[0123] 我们的数据显示，在关节损伤时和/或其后不久，用AMPA和/或KA GluR拮抗剂处理有问题的关节，降低了与创伤后OA的发作或发展相关的退变病状、炎症和疼痛。

[0124] 参考文献

[0125] 前言

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[0147] 表1.关节退变评分系统

[0148]

[0149] 表2.用于QRT-PCR的GluR、EAAT和IL6的引物和循环条件

[0150]

[0151]

[0152] 表3.患病或未患病的不同物种中比较关节谷氨酸的浓度

[0153]

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