人类人工染色体载体
阅读：890发布：2020-05-18
专利汇可以提供人类人工染色体载体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种人类人工 染色 体载体，其包含编码人类 抗体 重链的基因、编码人类抗体轻链的基因和编码非人类动物来源的IgM重链恒定区的基因。，下面是人类人工染色体载体专利的具体信息内容。
1.一种人类人工染色体载体，其包含：
(a)编码人类抗体重链的基因，其中所述编码人类抗体重链的基因至少编码人类IgG(γ)重链、人类IgA(α)重链或者人类IgG和IgA重链两者，
(b)编码人类抗体轻链的基因，和
(c)编码嵌合IgM重链恒定区的基因，其中人类人工染色体载体上编码人类IgM重链恒定区的一部分DNA被编码有蹄类动物的IgM重链恒定区的DNA替换，以致：
(i)编码人类IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA分别被编码有蹄类动物的IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换；或者(ii)编码人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA分别被编码有蹄类动物的IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换。
2.权利要求1的人类人工染色体载体，其中编码人类IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA分别被编码有蹄类动物的IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换。
3.权利要求2的人类人工染色体载体，其中编码人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA分别被编码有蹄类动物的IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换。
4.权利要求1至3任一项的人类人工染色体载体，其中编码人类抗体重链的基因包含IgA(α)、IgD(δ)、IgE(ε)、IgG(γ)和IgM(μ)人类抗体重链，并且编码人类抗体轻链的基因包含κ人类抗体轻链或λ人类抗体轻链或者κ和λ人类抗体轻链两者。
5.用于构建有蹄类动物的方法，其包括将权利要求1-4任一项的人类人工染色体载体导入到有蹄类动物的细胞中。
6.用于构建有蹄类动物的方法，其包括将权利要求1-4任一项的人类人工染色体载体导入到有蹄类动物的细胞中，其中所述细胞是卵母细胞，并且有蹄类动物是IGHM-/-且IGHML1-/-的有蹄类动物。
7.一种用于生产人类抗体的方法，其包括：将靶抗原施用到权利要求5的方法所构建的有蹄类动物中以在有蹄类动物血清中产生并积累针对所述抗原的特异性人类抗体，以及从血清回收针对所述抗原的特异性人类抗体。
8.一种用于生产人类抗体的方法，所述方法包括：将靶抗原施用到权利要求6的方法所构建的有蹄类动物中以在有蹄类动物血清中产生并积累针对所述抗原的特异性人类抗体，以及从血清回收针对所述抗原的特异性人类抗体，其中所述有蹄类动物产生至少1,000μg/mL人类IgG的血清浓度。
人类人工染色体载体
技术领域
背景技术
[0003] 随后，提出了构建所需人类人工染色体（在后文中缩写为HAC）载体以生产非人类动物的方法，通过该方法已建立了包含广泛的各种人类抗体基因座的HAC。
[0004] 首先，作为对将要引入到非人类动物中的染色体片段进行修饰的方法，已经开发了通过基因打靶将端粒序列插入到保持在鸡DT40细胞中的人类染色体上的目标序列中，以有效制备缺失染色体的技术（专利文献2）。
[0005] 此外，在保持了人类染色体的小鼠细胞的维持过程中，已发现可以获得包含来源于人类14号染色体的抗体重链基因座的片段SC20，并且所述片段稳定地保持在胚胎干（ES）细胞和小鼠个体中，并具有向后代传递的效率高（专利文献2）。
[0006] 因此，使用例如SC20作为载体的基本骨架，通过Cre/loxP位点特异性重组系统对包含人类22号染色体上的抗体λ型轻链基因座的片段进行易位，构建了包含人类抗体重链和人类抗体λ链的λHAC（非专利文献2和专利文献3）。
[0007] λHAC具有与SC20几乎等同的稳定性和向后代传递的效率，并且通过将该λHAC导入小鼠ES细胞产生了稳定保持λHAC的嵌合小鼠（非专利文献2和专利文献3）。通过这种方法，现在能够构建包含具有特定的兆碱基（Mb）尺寸的人类染色体区的HAC载体。
[0008] 此外，出于移除对染色体导入动物的产生具有不利影响的染色体区的目的，根据人类22号染色体的结构信息（非专利文献3）制备了具有优化尺寸并包含抗体λ型轻链（λ链）基因区的染色体片段ΔHAC和ΔΔHAC（专利文献4）。
[0009] 已证实，ΔHAC和ΔΔHAC分别包括具有2.5Mb和1.5Mb大小的区域，这些区域比λHAC上抗体λ型轻链基因区周边10Mb短，提供了比λHAC更高的后代传递效率（专利文献4）。
[0010] 同时，从获自多个人类供体的血清合并物制备了目前用于治疗和预防各种疾病的人类多克隆抗体。因此，人类多克隆抗体的性能很大程度上取决于作为供应源的人类供体血清，因此在制备中需要选择具有所需抗原反应性或滴度的供体的过程。
[0011] 此外，由于多克隆抗体制备中的多种因素例如抗原种类、暴露于免疫原的次数以及可以收集的供体血清的量，其应用的发展受到限制。因此，已制备了具有人类抗体基因座的转基因动物作为用于生产人类多克隆抗体的工具。
[0012] 由于体型，有蹄类动物可用作大量人类多克隆抗体的供应源。到目前为止，为了生产人类多克隆抗体，其中导入了上述HAC、特别是ΔHAC和ΔΔHAC以生产人类多克隆抗体的牛，是已知的（非专利文献4和专利文献5）。
[0013] 在导入了这些HAC的牛的新生仔血清中，产生了13至258ng/mL的人类免疫球蛋白（Ig）G（非专利文献4）。
[0014] 随后，为了消除在牛活体中产生的牛抗体，在编码牛内源抗体重链基因中的功能性IgM基因的IGHM和IGHML1上执行了基因打靶，作为结果，其中抗体重链被敲除的牛是已知的（非专利文献5和专利文献6和7）。
[0015] 当将ΔΔHAC导入获得的抗体重链双敲除牛（IgHM-/-/IgHML1-/-牛）中时，发现在14日龄小牛的血清中产生了7.1μg/mL人类IgG（专利文献7）。
[0016] 此外，产生了其中导入κHAC的牛，所述κHAC是具有人类抗体重链基因座和人类抗体κ型轻链（κ链）基因座的HAC载体（非专利文献6和专利文献8）。κHAC是通过将包含人类2号染色体上的抗体κ链基因座的片段易位到SC20上而构建的载体。在图1中显示了κHAC的示意图。
[0017] 在导入了κHAC的IgHM-/-/IgHML1-/-牛中，克隆468是抗体生产最高的个体，从出生后84天起，在血清中恒定地产生1g/L以上的人类IgG，并且在出生后210天显示出超过2g/L的滴度。
[0018] 然而，稳定地产生表现出如上所述的高滴度的个体的技术还是未知的，因此对于以更高效率生产人类抗体的动物或能够稳定地产生这些动物的技术，存在着需求。
[0019] 现有技术文献
[0020] 专利文献
[0021] 专利文献1：WO97/07671
[0022] 专利文献2：WO98/37757
[0023] 专利文献3：WO00/10383
[0024] 专利文献4：WO02/92812
[0025] 专利文献5：WO2002/70648
[0026] 专利文献6：WO03/97812
[0027] 专利文献7：WO05/104835
[0028] 专利文献9：WO09/111086
[0029] 非专利文献
[0030] 非专利文献1：Tomizuka等，Nature Genetics,16,133-143,1997
[0031] 非专利文献2：Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000
[0032] 非专利文献3：Dunham等，Nature,402,489-495,1999
[0033] 非专利文献4：Kuroiwa等，Nature Biotechnology,20,889-894,2002
[0034] 非专利文献5：Kuroiwa等，Nature Genetics,36,775-780,2004
[0035] 非专利文献6：Kuroiwa等，Nature Biotechnology,27,173-181,2009
[0036] 发明概述
[0037] 技术难题
[0038] 本发明的目的是提供用于有效生产人类抗体的动物、用于稳定供应所述动物的方法以及用于高效生产人类抗体的方法。
[0039] 问题的解决方法
[0040] 考虑到上述目的，为了实现与常规HAC相比高的人类IgG生产量并稳定地产生具有高滴度的牛个体，本发明人改进了HAC载体。
[0041] 也就是说，本发明涉及下列（1）至（8）：
[0042] （1）一种人类人工染色体载体，其包含编码人类抗体重链的基因、编码人类抗体轻链的基因和编码非人类动物来源的IgM重链恒定区的基因。
[0043] （2）（1）中描述的人类人工染色体载体，其包含编码人类抗体替代轻链的基因。
[0044] （3）（2）中描述的人类人工染色体载体，其中编码人类抗体替代轻链的基因是VpreB基因和λ5基因。
[0045] （4）（1）至（3）任一项中描述的人类人工染色体载体，其中编码非人类动物来源的IgM重链恒定区的基因是牛来源的IGHM。
[0046] （5）一种动物，其具有（1）至（3）任一项中描述的人类人工染色体载体。
[0047] （6）一种牛，其具有（4）中描述的人类人工染色体载体。
[0048] （7）一种用于生产人类抗体的方法，所述方法包含：将靶抗原施用到（5）中描述的动物中以在动物血清中产生并积累针对该抗原的特异性人类抗体，以及从血清回收针对该抗原的特异性人类抗体。
[0049] （8）一种用于生产人类抗体的方法，所述方法包含：将靶抗原施用到（6）中描述的牛中以在牛血清中产生并积累针对该抗原的特异性人类抗体，以及从血清回收针对该抗原的特异性人类抗体。
[0050] 本发明的有利效果
[0051] 通过将本发明的包含编码人类抗体重链的基因、编码人类抗体轻链的基因和编码非人类动物来源的IgM重链恒定区的基因的人类人工染色体载体导入动物中，与通过常规HAC技术产生的载体相比，可以高效率生产人类抗体。此外，通过将本发明的人类人工染色体载体导入动物，可以稳定地产生能够高效生产人类抗体的动物。
[0052] 此外，作为优选实施方案，当将除了编码人类抗体重链的基因、编码人类抗体轻链的基因和编码非人类动物来源的IgM重链恒定区的基因之外还包含人类抗体替代轻链基因的人类人工染色体载体导入动物时，可以更高效率地生产人类抗体，并且可以稳定地产生能够以这种高效率生产人类抗体的动物。
[0054] 图1（a）显示了κHAC的示意图。图1（b）显示了当将κHAC导入动物时将在B细胞膜上形成的IgM的示意图。在图1（b）中，虚线表示人类来源的IgM部分，实线表示牛来源的IgM部分。
[0055] 图2（a）显示了KcHAC的示意图。图2（b）显示了当将KcHAC导入动物时将在B细胞膜上形成的IgM的示意图。在图2（b）中，虚线表示人类来源的IgM部分，实线表示牛来源的IgM部分。
[0056] 图3（a）显示了cKSL-HACΔ的示意图。图3（b）显示了当将cKSL-HACΔ导入动物时将在B细胞膜上形成的IgM的示意图。在图3（b）中，虚线表示人类来源的IgM部分，实线表示牛来源的IgM部分。
[0057] 图4显示了打靶载体pTEL’hisDpurolox2272F9R9的示意图。
[0058] 图5显示了打靶载体pTELCAGzeoSLF2R2的示意图。
[0059] 图6显示了打靶载体p553CAGlox2272BsrDT的示意图。
[0060] 图7显示了打靶载体pSC355CAGlox511hisDDT的示意图。
[0061] 图8显示了打靶载体p14CEN(FR)hygpurolox511DT的示意图。
[0062] 图9显示了打靶载体pRNR2loxPbsrDT的示意图。
[0063] 图10显示了打靶载体pCH1CAGzeoDT的示意图。
[0064] 图11显示了打靶载体pCH2CAGzeoDT的示意图。
[0065] 图12显示了用于在鸡DT40细胞中修饰人类2号染色体的方法的概要。
[0066] 图13显示了用于在鸡DT40细胞中修饰人类22号染色体的方法的概要。
[0067] 图14显示了用于在DT40杂交细胞中构建SLKH片段的方法的概要。
[0068] 图15显示了用于在DT40细胞中构建CH2D片段的方法的概要。
[0069] 图16显示了用于在DT40细胞中修饰人类14号染色体的方法的概要。
[0070] 图17显示了用于在DT40杂交细胞中构建cKSL-HACΔ的方法的概要。
[0072] 图19显示了在6月龄HAC牛的各血清中人类IgG的总量。
[0073] 图20显示了CEM细胞特异性ELISA测定法的结果。
[0074] 执行本发明的实施方案
[0075] 本发明涉及（1）包含人类抗体重链基因、人类抗体轻链基因和非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的人类人工染色体载体，（2）具有所述人类人工染色体载体的动物，以及（3）用于生产人类抗体的方法，所述方法包含将靶抗原施用到动物以在动物血清中生产和积累抗原特异性人类抗体，以及从血清回收抗原特异性人类抗体。
[0076] 1.本发明的人类人工染色体载体
[0077] 在本发明中，“人类人工染色体载体”是指包含人类染色体来源的着丝粒序列、端粒序列和复制原点、并且在宿主细胞的核中独立于宿主细胞的染色体存在的载体。
[0078] 具体来说，载体是指通过将人类染色体上的所需区域易位到稳定的人类染色体片段中而制备的人类人工染色体（HAC）载体。
[0079] 用于制备HAC的方法的具体实例包括下述方法，所述方法包含：插入端粒序列和被Cre重组酶识别的loxP序列，使得可以包含人类染色体或染色体片段上的所需区域，并使插入到染色体或染色体片段的端粒序列与loxP序列之间的区域与插入到另一个染色体或染色体片段（优选为在核中稳定并且向后代传递效率高的染色体片段）的端粒序列与loxP序列之间的区域通过易位而结合（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和WO No.00/10383）。
[0080] （人类抗体重链基因）
[0081] 本发明的人类人工染色体载体包含人类抗体重链基因。在本发明中，“人类抗体重链基因”是指在构成人类免疫球蛋白分子的两条同一重链和两条同一轻链中，编码前者的基因。
[0082] 人类抗体重链基因的具体实例包括编码重链可变区的基因和编码决定恒定区结构的γ链、μ链、α链、δ链和ε链的基因。
[0083] 在本发明的人工染色体载体中，“包含人类抗体重链基因”是指包含编码人类抗体重链基因的DNA。可以通过将编码人类抗体重链基因的DNA插入到任何位置中，或插入或连接包含编码人类抗体重链基因的DNA的染色体片段，来制备本发明的人类人工染色体载体。
[0084] 人类抗体重链的可变区基因和恒定区基因形成簇，并位于人类14号染色体的14q32处。因此，本发明的人工染色体载体优选包含人类14号染色体片段，更优选为人类抗体重链的可变区基因和恒定区基因所位于的人类14号染色体片段，更加优选为包含14q32区的人类14号染色体片段。
[0085] （人类抗体轻链基因）
[0086] 本发明的人类人工染色体载体包含人类抗体轻链基因。在本发明中，“人类抗体轻链基因”是指在构成人类免疫球蛋白分子的两条同一重链和两条同一轻链中，编码后者的基因。
[0087] 人类抗体轻链基因的具体实例包括两种类型的基因，即κ链基因和λ链基因。每种链的基因包含编码可变区的基因和编码恒定区的基因。
[0088] 本发明的人类人工染色体载体可以只包含κ链基因或λ链基因、或这两种基因作为人类抗体轻链基因。
[0089] 在本发明的人工染色体载体中，“包含人类抗体轻链基因”是指包含编码人类抗体轻链基因的DNA。可以通过将编码人类抗体轻链基因的DNA插入到任何位置中、或插入或连接包含编码人类抗体轻链基因的DNA的染色体片段，来制备本发明的人类人工染色体载体。
[0090] κ链和λ链的可变区基因和恒定区基因成簇定位于染色体上。κ链基因簇位于人类2号染色体的2p11.2处（Gottfrie等，Genomics,16,512-514,1993），λ链基因簇位于人类22号染色体的22q11.2-12处（Collins等，Nature,377,367-379,1995）。
[0091] 因此，本发明的人工染色体载体优选包含人类2号染色体片段，更优选为λ链基因簇所位于的人类2号染色体片段，更加优选为包含2p11.2-12区的人类2号染色体片段。
[0092] 此外，本发明的人工染色体载体优选包含人类22号染色体片段，更优选为κ链基因簇所位于的人类22号染色体片段，更加优选为包含22q11.2区的人类22号染色体片段。
[0093] （IgM重链恒定区基因）
[0094] 本发明的人类人工染色体载体包含非人类动物来源的IgM重链恒定区基因。对非人类动物没有特别限制，只要动物是能够作为宿主导入本发明的人类人工染色体载体的非人类动物即可，并可以是任何有蹄类动物例如奶牛、马、山羊、绵羊和猪，啮齿类动物例如小鼠、大鼠和兔，家禽例如鸡、家鸭和鹅。
[0096] 在本发明中“IgM重链恒定区基因”是指编码IgM重链恒定区的基因。IgM重链恒定区通过与B细胞膜分子Igα/Igβ相互作用以引起细胞内信号传导，促进B细胞的发生。IgM重链恒定区基因的具体实例包括编码恒定区结构域例如CH1、CH2、CH3和CH4以及B细胞跨膜结构域例如TM1和TM2的基因。
[0097] 对包含在本发明的人类人工染色体载体中的非人类动物来源的IgM重链恒定区基因没有特别限制，只要该区域处于上述IgM重链恒定区中可以充分诱导B细胞发生信号的范围内即可，但优选包含非人类动物来源的TM1和TM2结构域，更优选包含编码非人类动物来源的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的基因。
[0098] 在本发明的人类人工染色体载体中，“包含非人类动物来源的IgM重链恒定区基因”是指包含编码非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的DNA。
[0099] 可以通过将编码非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的DNA插入到任何位置中，或连接包含编码人类IgM重链恒定区基因的DNA的染色体片段，来制备本发明的人类人工染色体载体。
[0100] 具体来说，优选将人类人工染色体上编码人类IgM重链恒定区基因的一些DNA用编码非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的一些DNA替换。
[0101] 具体来说，当将人类人工染色体上编码人类IgM重链恒定区基因的一部分DNA用编码非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的一部分DNA替换时，优选将人类人工染色体上编码人类IgM重链恒定区基因中的TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因中的TM1结构域和TM2结构域的DNA替换；更优选将编码人类IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换；或者将人类人工染色体上编码人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换。
[0102] 非人类动物来源的IgM重链恒定区基因优选为非人类哺乳动物的IgM重链恒定区基因，更优选为有蹄类动物的IgM重链恒定区基因，更加优选为牛的IgM重链恒定区基因。
[0103] 牛的IgM重链恒定区基因优选为包含在牛内源IgM重链基因所位于的IGHM区中（IGHM来源）的牛IgM重链恒定区的编码基因，或者是编码IGHML1区中（IGHML1来源）的牛IgM重链恒定区的基因，更优选为编码包含在IGHM区中的牛IgM重链恒定区的基因。
[0104] （人类抗体替代轻链基因）
[0105] 本发明的人类人工染色体载体包含人类抗体替代轻链基因。在本发明中，“人类抗体替代轻链基因”是指编码假抗体轻链的基因，所述假抗体轻链与在人类前B细胞中通过基因重构产生的抗体重链结合，以构成前B细胞受体（preBCR）。
[0106] 人类抗体替代轻链基因的具体实例包括VpreB基因和λ5基因。本发明的人类人工染色体载体优选包含VpreB基因和λ5基因作为人类抗体替代轻链基因。
[0107] 本发明的VpreB基因优选包含VpreB1基因和VpreB3基因中的任一个或两者，更优选包含VpreB1基因和VpreB3基因两者。
[0108] 在本发明的人类人工染色体载体中，“包含人类抗体替代轻链基因”是指包含编码人类抗体替代轻链基因的DNA。可以通过将编码人类抗体替代轻链基因的DNA插入到任何位置中，或插入或连接包含编码人类抗体替代轻链基因的DNA的染色体片段，来制备本发明的人类人工染色体载体。
[0109] VpreB基因和λ5基因中的任一个都位于人类22号染色体的22q11.2处的人类抗体λ链基因座内。因此，本发明的人类人工染色体载体优选包含人类22号染色体，更优选为包含VpreB基因和λ5基因的人类22号染色体，更加优选为包含22q11.2区的人类22号染色体。
[0110] 2.构建本发明的人类人工染色体载体的方法
[0111] 本发明的包含人类抗体重链基因、人类抗体轻链基因和人类抗体替代轻链基因的人类人工染色体载体，可以使用下述（1）至（3）的方法来构建。
[0112] （1）包含人类抗体重链基因的人类人工染色体片段的构建
[0113] 可以按照WO98/037757中描述的方法，通过从人类正常细胞分离人类14号染色体，以从所述染色体获得包含人类抗体重链基因的染色体片段，来构建包含人类抗体重链基因的人类人工染色体片段。
[0114] 具体来说，尽管在人类14号染色体分离过程或在细胞内保持所述染色体的过程期间偶发产生的染色体片段可以通过WO00/010383中描述的方法来分离，但可以通过对人类14号染色体辐照电离辐射以断裂染色体来获得染色体片段，并且也可以通过将端粒序列插入到人类14号染色体的所需位置中以在该位置处产生缺失，来获得染色体片段。
[0115] 此外，可以通过使用Kuroiwa等的方法（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和WO00/010383），将不包含人类抗体重链基因的人类染色体片段插入或连接到包含人类14号染色体来源的人类抗体重链基因的片段中，来构建由此获得的人类人工染色体载体。
[0116] 包含人类抗体重链基因的人类人工染色体片段的实例包括SC20（Tomizuka等，Proceeding of the National Academy of Sciences,97,722-727,2000和WO98/037757）、λHAC（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和WO00/010383）、κHAC（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,27,173-181,2009和WO09/111086）、ΔHAC和ΔΔHAC（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和WO00/010383）等。
[0117] （2）包含人类抗体轻链基因的人工染色体片段的构建
[0118] 可以按照WO98/037757中描述的方法，通过从人类正常细胞分离人类2号染色体，以从所述染色体获得包含人类抗体κ链基因的染色体片段，来构建包含人类抗体κ链基因的人类人工染色体片段。
[0119] 具体来说，尽管在人类2号染色体分离过程或在细胞内保持所述染色体的过程期间偶发产生的染色体片段可以通过WO00/010383中描述的方法来分离，但可以通过对人类2号染色体辐照电离辐射以断裂染色体来获得染色体片段，并且也可以通过将端粒序列插入到人类2号染色体的所需位置中以在该位置处产生缺失，来获得染色体片段。
[0120] 可以通过使用Kuroiwa等的方法（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,27,173-181,2009和WO09/111086），将包含人类2号染色体来源的人类抗体κ链基因的片段插入或连接到不包含人类2号染色体来源的人类抗体κ链基因的人类染色体片段中，来构建包含人类抗体κ链基因的人类人工染色体片段。
[0121] 由此获得的包含人类抗体κ链基因的人类人工染色体片段的实例，包括κHAC（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,27,173-181,2009和WO09/111086）。
[0122] 可以按照WO98/037757中描述的方法，通过从人类正常细胞分离人类22号染色体，以从所述染色体获得包含人类抗体λ链基因的染色体片段，来构建包含人类抗体λ链基因的人类人工染色体片段。
[0123] 具体来说，尽管在人类22号染色体分离过程或在细胞内保持所述染色体的过程期间偶发产生的染色体片段可以通过WO00/010383中描述的方法来分离，但可以通过对人类22号染色体辐照电离辐射以断裂染色体来获得染色体片段，并且也可以通过将端粒序列插入到人类22号染色体的所需位置中以在该位置处产生缺失，来获得染色体片段。
[0124] 此外，可以通过使用Kuroiwa等的方法（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和WO00/010383），将包含人类22号染色体来源的人类抗体λ链基因的片段插入或连接到不包含人类抗体λ链基因的人类染色体片段中，来构建包含人类抗体λ链基因的人类人工染色体片段。
[0125] 由此获得的包含人类抗体重链基因的人类人工染色体片段的实例，包括λHAC（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和WO00/010383）、ΔHAC和ΔΔHAC（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,20,889-894,2002和WO02/092812）。
[0126] （3）包含非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的人类人工染色体片段的构建[0127] 可以通过用非人类动物来源的IgM重链恒定区基因替换通过上述（1）的方法构建的包含人类抗体重链基因的人类人工染色体片段上的人类IgM重链恒定区基因，将非人类动物来源的IgM重链恒定区基因包含在本发明的人类人工染色体载体中。
[0128] 具体来说，可以通过同源重组，将通过上述（1）的方法构建的包含人类抗体重链基因的人类人工染色体载体上编码人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换，来构建非人类动物来源的IgM重链恒定区基因。
[0129] 因此，可以通过同源重组，将通过上述（1）或（2）的方法构建的包含人类抗体重链基因和人类抗体轻链基因的人类人工染色体载体中包含人类抗体重链基因的人类人工染色体片段上编码人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换，来构建包含人类抗体重链基因、人类抗体轻链基因和非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的人类人工染色体载体。
[0130] 或者，通过同源重组，将通过上述（1）至（3）的方法构建的包含人类抗体重链基因和人类抗体轻链基因的人类人工染色体载体中包含人类抗体重链基因的人类人工染色体片段上编码人类IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换。
[0131] 此外，可以使用上述（1）至（3）的方法，来构建本发明的包含人类抗体重链的编码基因、人类抗体轻链的编码基因和非人类动物来源的IgM重链恒定区的编码基因的人类人工染色体载体。
[0132] 具体来说，可以将通过（1）的方法构建的包含人类抗体重链基因的人类14号染色体片段上的人类IgM重链恒定区基因用非人类动物来源的IgM重链恒定区基因替换，然后连接通过（2）的方法构建的包含人类κ链基因的人类2号染色体片段，来构建本发明的载体。
[0133] 更具体来说，本发明的包含非人类动物来源的IgM重链恒定区基因的人类人工染色体载体可以用下述方式构建。通过同源重组，将κHAC（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,27,173-181,2009和WO09/111086）上编码人类IgM重链恒定区基因中的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因的CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换。
[0134] 以这种方式构建的本发明的人类人工染色体载体的实例包括KcHAC。在图2中显示了KcHAC的示意图。在图2中显示了KcHAC的示意图。如图2中所示，与κHAC的结构（图1）相比，由于KcHAC包含非人类动物（牛）来源的IgM重链恒定区基因的编码基因，因此当它被导入动物中时，能够以更高效率产生人类抗体，并且KcHAC可以稳定地产生能够以这种高效率生产人类抗体的动物。
[0135] （4）包含人类抗体替代轻链基因的人类人工染色体片段的构建
[0136] 可以按照WO98/037757中描述的方法，通过从人类正常细胞分离人类22号染色体，以从所述染色体获得包含人类抗体替代轻链基因的染色体片段，来构建包含人类抗体替代轻链基因的人类人工染色体片段。
[0137] 具体来说，尽管在人类22号染色体分离过程或在细胞内保持所述染色体的过程期间偶发产生的染色体片段可以通过WO00/010383中描述的方法来分离，但可以通过到人类22号染色体辐照电离辐射以断裂染色体来获得染色体片段，并且也可以通过将端粒序列插入到人类22号染色体的所需位置中以在该位置处产生缺失，来获得染色体片段。
[0138] 此外，可以通过使用Kuroiwa等的方法（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和WO00/010383），将包含人类抗体替代轻链基因的片段插入或连接到不包含人类抗体替代轻链基因的人类染色体片段中，来构建包含人类抗体替代轻链基因的人类人工染色体片段。
[0139] 可以使用上述（1）至（4）的方法，来构建本发明的包含人类抗体重链的编码基因、人类抗体轻链的编码基因和非人类动物来源的IgM恒定区的编码基因、并且还包含人类抗体替代轻链的编码基因的人类人工染色体载体。
[0140] 具体来说，可以将通过（1）的方法构建的包含人类抗体重链基因的人类14号染色体片段上的人类IgM重链恒定区基因，通过（3）的方法用非人类动物来源的IgM重链恒定区基因替换，然后连接通过（2）的方法构建的包含人类κ链基因的人类2号染色体片段，以及通过（2）和（4）的方法构建的包含人类λ链基因和人类抗体替代轻链基因的人类22号染色体片段，来构建本发明的载体。
[0141] 更具体来说，包含本发明的人类抗体重链基因、人类抗体轻链基因和人类抗体替代轻链基因、并且还包含非人类动物来源的IgM恒定区的人类人工染色体载体，可以用下述方式构建。
[0142] 首先，通过同源重组，将人类14号染色体片段上编码人类IgM重链恒定区基因中的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA，分别用编码非人类IgM重链恒定区基因的CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、TM1结构域和TM2结构域的DNA替换。然后，通过同源重组将loxP序列插入到人类14号染色体片段上的RNR2基因座内（Worton等，Science,239,64-68,1988）。
[0143] 同时，将作为Cre重组酶的识别序列的loxP序列和lox2272序列，通过同源重组分别插入到位于人类2号染色体片段上人类κ链基因簇区的极性着丝粒一侧上的cos138位点（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,27,173-181,2009）和位于极性端粒一侧的AC104134位点（基因登记号）中。
[0144] 此外，在通过同源重组将端粒序列插入到人类22号染色体片段上包含人类λ链基因和人类抗体替代轻链基因的簇区域的极性端粒一侧上的AP000350位点（基因登记号）中并然后切开染色体之后，通过同源重组将lox2272序列插入到极性着丝粒一侧上的AP000553位点（基因登记号）中。
[0145] 通过Cre/loxP重组，通过将人类22号染色体片段上的AP000553位点易位到人类2号染色体片段上的AC104134位点中，将两条染色体连接。此外，通过Cre/loxP重组，通过将人类14号染色体片段上的RNR2基因座易位到上面的连接体的人类2号染色体片段上的cos138位点中，将三条染色体连接。
[0146] 将以这种方式构建的本发明的人类人工染色体载体的实例包括cKSL-HACΔ。在图3中显示了cKSL-HACΔ的示意图。在图3中显示了cKSL-HACΔ的示意图。如图3中所示，与κHAC的结构（图1）相比，由于cKSL-HACΔ还包含非人类动物（牛）来源的IgM重链恒定区的编码基因和人类抗体替代轻链的编码基因，因此当它被导入动物中时，能够以更高效率产生人类抗体，并且也可以稳定地产生能够以这种高效率生产人类抗体的动物。
[0147] 3.具有本发明的人类人工染色体载体的动物
[0148] 具有本发明的人类人工染色体载体的动物是指其中导入了本发明的人类人工染色体载体的动物。
[0149] 对具有本发明的人类人工染色体的动物没有特别限制，只要动物是可以在其细胞内导入人类人工染色体片段的动物即可，并且可以使用任何非人类动物，例如有蹄类动物如奶牛、马、山羊、绵羊和猪，啮齿类动物例如小鼠、大鼠和兔，家禽例如鸡、家鸭和鹅等。
[0150] 非人类动物优选为非人类哺乳动物，更优选为有蹄类动物，更加优选为牛。
[0151] 可以将通过上述（2）的方法构建的本发明的人类人工染色体载体导入到宿主动物的卵母细胞中，来构建具有本发明的人类人工染色体载体的动物。
[0152] 具体来说，使用WO2005/104835中描述的方法和Kuroiwa等的方法（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,20,889-894），将通过上述（2）的方法构建的本发明的人类人工染色体载体，通过微细胞融合方法导入到宿主动物来源的体细胞中。然后，可以通过将细胞的核或染色质凝聚物移植到卵母细胞中，并将卵母细胞或从卵母细胞形成的胚胎移植到宿主动物的子宫中使其生产，来构建具有人类人工染色体载体的动物。
[0153] 通过Kuroiwa等的方法（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000和Kuroiwa等，Nature Biotechnology,20,889-894），可以确认通过上述方法构建的动物是否具有本发明的人类人工染色体载体。
[0154] 4.生产本发明的人类抗体的方法
[0155] 可以通过用所需抗原免疫接种在上述（3）中构建的具有本发明的人类人工染色体载体的动物以在动物血清中产生抗原特异性人类抗体，并从血清回收抗原特异性人类抗体，来生产抗原特异性人类抗体。
[0156] 对用于免疫接种具有本发明的人类人工染色体载体的动物的抗原没有特别限制，其实例包括肿瘤相关抗原、与过敏或炎症相关的抗原、与心血管疾病相关的抗原、与自体免疫疾病相关的抗原、与神经变性疾病相关的抗原和与病毒或细菌性感染相关的抗原。
[0157] 肿瘤相关抗原的实例包括CD 1a、CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD9、CD10、CD13、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD30、CD32、CD33、CD38、CD40、CD40配体（CD40L）、CD44、CD45、CD46、CD47、CD52、CD54、CD55、CD55、CD59、CD63、CD64、CD66b、CD69、CD70、CD74、CD80、CD89、CD95、CD98、CD105、CD134、CD137、CD138、CD147、CD158、CD160、CD162、CD164、CD200、CD227、肾上腺髓质素、血管生成素相关蛋白4（ARP4）、aurora、B7-H1、B7-DC、整合蛋白、骨髓基质抗原2（BST2）、CA125、CA19.9、碳酸酐酶9（CA9）、钙粘着蛋白、cc-趋化因子受体（CCR）4、CCR7、癌胚抗原（CEA）、富含半胱氨酸的成纤维细胞生长因子受体-1（CFR-1）、c-Met、c-Myc、胶原蛋白、CTA、结缔组织生长因子（CTGF）、CTLA-4、细胞角蛋白-18、DF3、E-catherin、表皮生长因子受体（EGFR）、EGFRvIII、EGFR2（HER2）、EGFR3（HER3）、EGFR4（HER4）、内皮糖蛋白、表皮细胞粘附分子（EpCAM）、内皮蛋白C受体（EPCR）、肝配蛋白、肝配蛋白受体（Eph）、EphA2、endotheliase-2（ET2）、FAM3D、成纤维细胞活化蛋白（FAP）、Fc受体同系物1（FcRH1）、铁蛋白、成纤维细胞生长因子-8（FGF-8）、FGF8受体、碱性FGF（bFGF）、bFGF受体、FGF受体（FGFR）3、FGFR4、FLT1、FLT3、叶酸盐受体、卷曲蛋白同源物10（FZD10）、卷曲蛋白受体4（FZD-4）、G250、G-CSF受体、神经节苷脂（GD2、GD3、GM2、GM3等）、globo H、gp75、gp88、GPR-9-6、乙酰肝素酶I、肝细胞生长因子（HGF）、HGF受体、HLA抗原（HLA-DR等）、HM1.24、人乳脂肪球（HMFG）、hRS7、热休克蛋白90（hsp90）、独特型表位、胰岛素样生长因子（IGF）、IGF受体（IGFR）、白介素（IL-6、IL-15等）、白介素受体（IL-6R、IL-15R等）、整合蛋白、免疫受体易位相关蛋白-4（IRTA-4）、激肽释放酶1、KDR、KIR2DL1、KIR2DL2/3、KS1/4、lamp-1、lamp-2、层粘连蛋白-5、Lewis y、唾液酰Lewis x、淋巴毒素-β受体（LTBR）、LUNX、黑素瘤相关的硫酸软骨素蛋白多糖（MCSP）、间皮素、MICA、苗勒管（Mullerian）抑制物质II型受体（MISIIR）、粘蛋白、神经细胞粘附分子（NCAM）、Necl-5、Notch1、骨桥蛋白、血小板衍生生长因子（PDGF）、PDGF受体、血小板因子-4（PF-4）、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异抗原（PSA）、前列腺干细胞抗原（PSCA）、前列腺特异性膜抗原（PSMA）、甲状旁腺激素相关蛋白/肽（PTHrP）、NF-κB配体的受体活化因子（RANKL）、透明质酸介导的细胞游走受体（RHAMM）、ROBO1、SART3、脑信号蛋白4B（SEMA4B）、分泌型白细胞蛋白酶抑制剂（SLPI）、SM5-1、神经鞘氨醇-1-磷酸、肿瘤相关糖蛋白-72（TAG-
72）、转铁蛋白受体（TfR）、TGF-β、Thy-1、Tie-1、Tie2受体、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域1（TIM-1）、人组织因子（hTF）、Tn抗原、肿瘤坏死因子（TNF）、Thomsen-Friedenreich抗原（TF抗原）、TNF受体、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）、TRAIL受体（DR4、DR5等）、系统ASC氨基酸转运蛋白2（ASCT2）、trkC、TROP-2、TWEAK受体Fn14、IV型胶原酶、尿激酶受体、血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3等）、波形蛋白、VLA-4等。
72）、转铁蛋白受体（TfR）、TGF-β、Thy-1、Tie-1、Tie2受体、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域1（TIM-1）、人组织因子（hTF）、Tn抗原、肿瘤坏死因子（TNF）、Thomsen-Friedenreich抗原（TF抗原）、TNF受体、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）、TRAIL受体（DR4、DR5等）、系统ASC氨基酸转运蛋白2（ASCT2）、trkC、TROP-2、TWEAK受体Fn14、IV型胶原酶、尿激酶受体、血管内皮生长因子（VEGF）、VEGF受体（VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3等）、波形蛋白、VLA-4等。
[0158] 与过敏或发炎相关的抗原的实例包括IL-6、IL-6R、IL-5、IL-5R、IL-4、IL-4R、TNF、TNF受体、CCR4、趋化因子、趋化因子受体等。
[0159] 与心血管疾病相关的抗原的实例包括GPIIb/IIIa、PDGF、PDGF受体、凝血因子、IgE、αVβ3、α4β7等。
[0160] 与病毒或细菌性感染相关的抗原的实例包括gp120、CD4、CCR5、志贺样毒素、炭疽保护性抗原、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（MRSA）抗原、乙型肝炎病毒（HBV）抗原、巨细胞病毒（CMV）抗原、狂犬病抗原、水痘带状疱疹（Varicella zoster）抗原等。
[0161] 它们的其他实例包括T细胞表面膜蛋白混合物、Rh(D)抗原、响尾蛇毒素、地高辛等。
[0164] 当抗原是部分肽时，与载体蛋白例如牛血清白蛋白（BSA）、钥孔嘁血蓝蛋白（KLH）等产生接合物，并将其用作免疫原。
[0165] 在第一次施用后，将抗原每1至4周施用1次至10次。在从每次施用起1至14天后，从动物收集血液以测量血清的抗体效价。
[0166] 用于检测和测量血清中包含的抗原特异性人类抗体的方法的实例，包括通过酶联免疫吸附测定法[《抗体实验指南》（Antibodies-A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]的结合测定法、生物传感器Biacore等。
[0167] 具体来说，可以通过将包含人类抗体的血清与抗原表达细胞温育，然后使用特异性识别人类抗体的抗体来测量血清中人类抗体的结合量。
[0168] 此外，除了这些方法之外，可以通过按照本技术领域已知的方法（The Prostate,67,1163,2007）鉴定抗体的靶抗原，来选择抗体。
[0169] 用于从血清回收人类抗体的方法的实例，包括通过将人类抗体吸附在蛋白A载体、蛋白G载体或承载有人类免疫球蛋白特异性抗体的载体上以进行纯化的方法。
[0171] 通过上述方法生产的人类抗体可以是多克隆或单克隆抗体，优选为多克隆抗体。实施例
[0172] 实施例1
[0173] 打靶载体的构建
[0174] （1）打靶载体pTEL’hisDpurolox2272F9R9的构建
[0175] 基本上使用在出版物（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.18:1086-1090,2000，Kuroiwa等，Nat Biotechnol.20:889-894,2002和Kuroiwa等，Nat Biotechnol.27:173-181,2009）中描述的方法来构建打靶载体。
[0176] 具 体 来 说 ，使 用 两 个 引 物 D N A k D - F 9（ 5 ’-tcgaggatccgccagggagacagatgccaagtacggtttag-3’）（SEQ ID NO：1）和kD-R9（5’-tcgaggatccaggatctttgggggactgaatggggtgtgct-3’）（SEQ ID NO：2），并使用具有人类2号染色体的鸡DT40细胞株KTL1（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.27:173-181,2009）的基因组DNA作为模板，通过由40个循环的98℃10秒和68℃9分钟构成的PCR，扩增了用作同源臂的基因组DNA片段Dk-F9R9。
[0177] 随后，以下列次序构建质粒pTEL’hisDpurolox2272。
[0178] 首先，通过将包含修饰型lox2272序列的两个寡DNA片段[由核苷酸序列5’-agcttggatccataacttcgtataggatactttatacgaagttata-3’（SEQ ID NO：3）构成的DNA片段和由核苷酸序列5’-agcttataacttcgtataaagtatcctatacgaagttatggatcca-3’（SEQ ID NO：4）构成的DNA片段]退火，然后克隆到质粒pPUR（BD Bioscience Clontech）的HindIII位点中，构建了质粒pPURlox2272。
[0179] 同时，通过将质粒pTELpuro（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.18:1086-1090,2000，Kuroiwa等，Nat Biotechnol.20:889-894,2002和Kuroiwa等，Nat Biotechnol.27:173-181,2009）的嘌呤霉素抗性基因（在后文中称为puror）用hisD基因替换，将EcoRI位点用SrfI位点替换，并将SpeI位点用PmeI位点替换，构建了质粒pTEL’hisDPm。
[0180] 在产生了pPURlox2272的BamHI消化并平端化的片段后，将获得的片段克隆到pTEL’hisDPm的PmeI位点中，由此获得的质粒被命名为pTEL’hisDpurolox2272。
[0181] 通过将上述PCR扩增的Dk-F9R9亚克隆到pTEL’hisDpurolox2272的BamHI位点中，构建了质粒pTEL’hisDpurolox2272F9R9（图4）。
[0182] （2）打靶载体pTELCAGzeoSLF2R2的构建
[0183] 采用与（1）中相同的方式，通过将质粒pTELpuro的EcoRI位点用SrfI位点替换，然后将SrfI位点用PmeI位点替换，并进一步将puro基因用CAGzeo基因替换，构建了pTELCAGzeo(Sr)Pm。
[0184] 同时，通过使用SL-F2（5’-tcgaggatccggcctcccaaaggattatagacgtgagccactgt-3’）（SEQ ID NO：5）和SL-R2（5’-tcgaggatccaaagaaggggcccgcctctgcctctaaatcctgac-3’）（SEQ ID NO：6）作为PCR引物组，并使用具有人类22号染色体的鸡DT40细胞株52-18（Kuroiwa等，Nucleic Acids Res 26:3447-3448,1998）的染色体DNA作为模板，通过重复40个循环的98℃10秒和68℃9分钟，扩增了用作同源臂的基因组DNA片段。
[0185] 通过将获得的PCR产物亚克隆到质粒pTELCAGzeo(Sr)Pm的BamHI位点中，构建了pTELCAGzeoSLF2R2（图5）。
[0186] （3）打靶载体p553CAGlox2272BsrDT的构建
[0187] 构建了结构中将打靶载体pHCF2loxPHyg（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.18:1086-1090,2000）用通过PCR在其中扩增了HCF2基因的同源臂序列的AP000553位点（GenBank登记号）序列替换的载体，并用作打靶载体p553loxPHyg(F)。
[0188] 此时，使用553-F3（5’-tgtagctgactttagccacccacaagtac-3’）（SEQ ID NO：7）和553-R3（5’-cttgctgattatacctcatctccttccctc-3’）（SEQ ID NO：8）作为引物组，鸡DT40细胞52-18的基因组DNA作为模板，通过由40个循环的98℃10秒和68℃15分钟构成的PCR，进行了AP000553位点片段的扩增。
[0189] 在将获得的质粒p553loxPHyg(F)用NotI消化后，执行自身连接，然后将白喉毒素A片段（在后文中称为DT-A）克隆到Srf位点中。
[0190] 同时，如下所述对pDRIVE-CAG（InvivoGen）进行修改。将各自包含loxP序列的寡DNA[5’-gtacaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatagatctg-3’（SEQ ID NO：9）和5’-aattcagatctataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatt-3’（SEQ ID NO：10）]退火，并替换pDRIVE-CAG的lacZ片段。通过将SdaI和SwaI消化的片段克隆到PstI和SmaI消化的pBluescript SK-（Stratagene）中，构建了pCAGloxP。
[0191] 随后 ，将pCAGlo xP的lo xP序列 用包 含通过两个寡 DNA[ 5 ’-gatctataacttcgtataggatactttatacgaagttatg-3’（SEQ ID NO：11）和5’-
ctagcataacttcgtataaagtatcctatacgaagttata-3’（SEQ ID NO：12）]的退火产生的lox2272的序列替换。此外，通过将灭瘟素抗性基因（bsr基因）插入到SpeI位点中，构建了pCAGloxP2272bsr。
ctagcataacttcgtataaagtatcctatacgaagttata-3’（SEQ ID NO：12）]的退火产生的lox2272的序列替换。此外，通过将灭瘟素抗性基因（bsr基因）插入到SpeI位点中，构建了pCAGloxP2272bsr。
[0192] 最后，通过将NotI-KpnI片段（CAG-lox2272-polyA-bsr）克隆到NotI位点中，完成lox2272了p553CAG BsrDT（图6）。
[0193] （4）打靶载体pSC355CAGlox511hisDDT的构建
[0194] 使用SC355-F3（5’-gtacaatcttggatcactacaacctctgcctacca-3’）（SEQ ID NO：13）和SC355-R3（5’-tgctgtgtctaatcaggtgttgaacccatctacta-3’）（SEQ ID NO：14）作为引物组，并使用包含人类14号染色体的鸡DT40细胞的基因组DNA作为模板，通过由40个循环的98℃10秒和68℃15分钟构成的PCR扩增了用作同源臂的基因组DNA。
[0195] 将质粒pBluescript的KpnI位点用SrfI位点替换，并将上述扩增的DNA片段亚克隆到SpeI位点中。获得的质粒被用作pSC355F3R3。
[0196] 随后，将pCAGloxP的loxP序列用包含通过两个寡DNA[由序列5’-gatctataacttcgtatagtatacattatacgaagttatg-3’（SEQ ID NO：15）构成的DNA片段和由核苷酸序列5’-ctagcataacttcgtataatgtatactatacgaagttata-3’（SEQ ID NO：16）构成的DNA片段]退火产生的lox511的序列进行替换，并用作pCAGlox51。
[0197] 通过将hisD基因插入到pCAGlox511的SpeI位点中，构建了pCAGlox511hisD。将用NotI和KpnI消化的片段（CAG-lox511-polyA-hisD）克隆到pSC355F3R3的EcoRV位点中。最后，通lox511过将DT-A片段亚克隆到NotI位点中获得的质粒，作为pSC355CAG hisDDT使用（图7）。
[0198] （5）打靶载体p14CEN(FR)hygpurolox511DT的构建
[0199] 使用14CEN-F（5’-tcgaggatccttcgccaccccaaagatgattacagattac-3’）（SEQ ID NO：17）和14CEN-R（5’-tcgaggatcctacactagaagcacaaaccccaccattacacat-3’）（SEQ ID NO：18）作为引物组，并使用包含人类14号染色体的鸡DT40细胞的基因组DNA作为模板，通过由
40个循环的98℃10秒和68℃15分钟构成的PCR扩增了用作同源臂的基因组DNA。
40个循环的98℃10秒和68℃15分钟构成的PCR扩增了用作同源臂的基因组DNA。
[0200] 通过将PCR产物克隆到其中KpnI位点被PmeI位点替换的pBluescript的BamHI位点中，构建了p14CEN(FR)。
[0201] 将 包 含 l o x 5 1 1 序 列 的 寡 D N A [ 由 核 苷 酸 序 列 5 ’-agcttggatccataacttcgtatagtatacattatacgaagttata-3’（SEQ ID NO：19）构成的DNA片段和由核苷酸序列5’-agcttataacttcgtataatgtatactatacgaagttatggatcca-3’（SEQ ID NO：20）构成的DNA片段]退火。通过将获得的片段克隆到质粒pPUR（BD Bioscience Clontech）的HindIII位点中，构建了质粒pPURlox511。
[0202] 通过分别将BamHI消化的pPURlox511片段克隆到pBluescript的BamHI位点中，将潮霉素抗性基因（hyg基因）克隆到EcoRV位点中，构建了pHygPurolox511。
[0203] 将NotI和KpnI消化的片段（puro-lox511-hyg）克隆到p14CEN(FR)的HpaI位点中。最后，通过将DT-A片段亚克隆到PmeI位点中，完成了p 14CEN(FR)hygpurolox511DT（图8）。
[0204] （6）打靶载体pRNR2loxPbsrDT的构建
[0205] 通过将DT-A片段插入到载体pRNR2loxPbsr（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.18:1086-1090,2000）中，构建了打靶载体pRNR2loxPbsrDT（图9）。
[0206] （7）打靶载体pCH1CAGzeoDT的构建
[0207] 使用载体λFIX II，由定制文库构建服务机构（Lofstrand社）从包含κHAC（WO2009/111086）的CHO细胞构建了κHAC的λ噬菌体基因组文库。
[0208] 使用由5’-cagtccccggcagattcaggtgtcc-3’（SEQ ID NO：21）和5’-gaaagtggcattggggtggctctcg-3’（SEQ ID NO：22）的核苷酸序列构成的DNA作为引物，并使用从包含κHAC的CHO細胞（WO2009/111086）提取的DNA作为模板，通过由40个循环的98℃10秒、64℃30秒和72℃1分钟构成的PCR进行扩增，使用所述PCR的产物作为探针，从构建的基因组文库筛选包含人类IgM恒定区的克隆。结果，分离到1号、4号和7号克隆。
[0209] 将4号克隆（PmlI片段，1.7kb）亚克隆到pBluescript的SmaI位点中，并将其命名为pCH1S(F)。在质粒pBCμAY37-95中，将SalI-牛IGHM染色体片段克隆到了pBluescript中，将来自所述质粒的SacI-PmlI片段（1kb）亚克隆到pCH1S(F)的PstI位点中，构建了pCH1SSP(F)。
[0210] 通过将源自于1号克隆的SmaI-EcoRI片段（7.4kb）克隆到用EcoRV/EcoRI消化的pCH1SSP(F)中，构建了pCH1SL。
[0211] 同时，从pBCμAY37-95，将SacI消化的片段（3.5kb）pCH2S(F)亚克隆到pBluescript中。通过将其中导入了loxP序列的CAGzeo的XhoI消化片段（通过将CAGzeo片段插入到pBS246（Gibco）的EcoRV位点中并用XhoI消化而构建的片段）克隆到获得的质粒的Van91I位点中，构建了pmAYSazeo(F)。
[0212] 此外，通过将pmAYSazeo(F)的SacI片段亚克隆到平端化的pCH1SL的EcoRI位点中，构建了pCH1zeo(F)。最后，通过将DT-A片段亚克隆到pCH1zeo(F)的NotI位点中，完成了pCH1CAGzeoDT（图10）。
[0213] （8）打靶载体pCH2CAGzeoDT的构建
[0214] 将通过由核苷酸序列5’-ggaccaggtggagactgtgcagtcctcacccataactttcagggcctacagcatgctg-3’（SEQ ID NO ：23）和5’-cagcatgctgtaggccctgaaagttatgggtgaggactgcacagtctccacctggtcc-3’（SEQ ID NO：24）构成的寡DNA退火产生的SeSp片段，克隆到平端化的pBluscript的PstI位点中。
[0215] 通过将从质粒pBCμAY37-95用SphI和BamHI消化的片段（约2kb）亚克隆到上面获得的质粒的SphI-BamHI位点中，构建了pmAYSpB。
[0216] 同样地，通过将pBCμAY37-95用BamHI和PmlI消化的片段（约2kb）亚克隆到pmAYSpB的BamHI-PmlI位点（其替换了原始的SpeI位点）中，构建了pmAYSpBPml。
[0217] 通过将实施例1（7）中的1号克隆的EcoRI-SexAI片段（约0.6kb）亚克隆到pmAYSpBPml的EcoRI-SexA1位点中，构建了pRISe。
[0218] 随后，通过将其中导入了loxP序列的CAGzeo亚克隆到pRISe的Van91I位点中，构建了pRISeCAGzeo(R)。此外，通过将pRISeCAGzeo(R)的NotI位点用EcoRI位点替换，构建了pRISeCAGzeoE。
[0219] 同时，通过将实施例1（7）中4号克隆的PmlI片段（约1.7kb）亚克隆到其中EcoRV位点被MluI位点替换的pBluescript的SmaI位点中，构建了pCH2S(F)。
[0220] 通过将实施例1（7）中1号克隆的MluI和EcoRI消化的片段（约6.6kb）克隆到pCH2S(F)的MluI-EcoRI位点中，构建了pCH2LS。
[0221] 随后，通过将pRISeCAGzeoE的EcoRI片段亚克隆到pCH2LS的EcoRI位点中，构建了pCH2CAGzeo(F)。最后，通过将DT-A片段亚克隆到pCH2CAGzeo(F)的NotI位点中，完成了pCH2CAGzeoDT（图11）。
[0222] 实施例2
[0223] KSL-HAC的构建
[0224] （1）鸡DT40细胞中人类2号染色体的修饰
[0225] 为了在人类2号染色体的AP104134位点处产生缺失并插入lox2272序列和无启动子的puror盒，将打靶载体pTEL’hisDpurolox2272F9R9用SrfI（Stratagene）线性化，并导入到KTL1（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.27:173-181,2009）中，所述KTL1是通过电穿孔（550V、25μF）在CD8A基因座处具有消化的人类2号染色体片段的鸡DT40细胞株。DT40细胞的电穿孔通过出版物（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.18:1086-1090,2000）中描述的方法来执行。
[0226] 通过组胺醇（0.5mg/ml，Sigma）对集落进行2周的选择，并测量对嘌呤霉素（1μg/ml，Sigma）的敏感性作为CD8A基因座上缺失puror盒的指标。使用Gentra Puregene细胞试剂盒（QIAGEN），从具有嘌呤霉素敏感性的集落提取染色体DNA，并使用FABP1-F（5’-tatcaagggggtgtcggaaatcgtg-3’）（SEQ ID NO：25）和FABP1-R（5’-actgggcctgggagaacctgagact-3’）（SEQ ID NO：26）作为引物进行PCR筛选。
[0227] 通过重复30个循环的98℃10秒、60℃30秒和72℃1分钟，在扩增存在于KTL1中但不存在于靶克隆中的FABP1基因座的条件下执行PCR。结果，将克隆K53鉴定为其中发生了所需缺失的克隆。图12显示了用于在鸡DT40细胞中修饰人类2号染色体的方法的概要。
[0228] （2）鸡DT40细胞中的人类22号染色体的修饰
[0229] 为了在位于距人类22号染色体的AP000344位点（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.20:889-894,2002）约450Mb端粒一侧上的AP000350位点处产生缺失，将打靶载体
pTELCAGzeoSLFR用PmeI（New England Biolabs）线性化并通过电穿孔（550V、25μF）导入到作为具有人类22号染色体的鸡DT40细胞株的52-18（Kuroiw等，Nucleic Acids Res 26:
3447-3448,1998）中。
pTELCAGzeoSLFR用PmeI（New England Biolabs）线性化并通过电穿孔（550V、25μF）导入到作为具有人类22号染色体的鸡DT40细胞株的52-18（Kuroiw等，Nucleic Acids Res 26:
3447-3448,1998）中。
[0230] 通过博来霉素（1mg/ml，Invitrogen）对集落进行2周选择。使用350T-F（5’-gaggtgggctgaggggcaagtgtg-3’）（SEQ ID NO：27）和350T-R（5’-tacgaggaggggaggcagtgagagg-3’）（SEQ ID NO：28）作为引物，对从由此获得的集落提取的基因组DNA进行PCR筛选。
[0231] 在存在于52-18中但是不存在于发生了打靶的克隆中的AP000350位点被扩增的条件下执行PCR（重复30个循环的98℃10秒、63℃30秒和72℃1分钟）。结果，发现在克隆ST13中产生了正确消化。
[0232] 为了将lox2272序列和CAG启动子整合到AP000553位点中，通过电穿孔（550V，25μF），将用PmeI（New England Biolabs）线性化的打靶载体p553CAGlox2272bsrDT导入ST13中。
[0233] 通过灭瘟素S（15μg/ml，Invitrogen）对集落进行2周选择。从由此获得的集落提取基因组DNA，并使用553KO-F（5’-gtcagccaggcgggccatttaccgtaagttatgta-3’）（SEQ ID NO：29）和553KO-R（5’-agggctgggttagatggcaccaaatgaaaggagaa-3’）（SEQ ID NO：30）作为引物对其进行PCR筛选。
[0234] 通过重复40个循环的98℃10秒和68℃6分钟来执行PCR。结果，将克隆STL54鉴定为其中发生了打靶的克隆。图13显示了在鸡DT40细胞中修饰人类22号染色体的方法的概要。
[0235] （3）在DT40杂交细胞中构建SLKH片段
[0236] 按照出版物的方法（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.27:173-181,2009），在鸡DT40杂交细胞中构建SLKH片段。
[0237] 将包含在实施例2（1）中制备的包含源自于具有hygr盒的人类2号染色体的片段的K53（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.27:173-181,2009），与包含在实施例2（2）中制备的源自于具有bsr盒的人类22号染色体的片段的STL54，使用PEG1500（Roche）进行融合，以制备DT40杂交细胞。
[0238] 将集落在潮霉素B（1.5mg/ml，Invitrogen）和灭瘟素S（20μg/ml，Invitrogen）存在下维持3周，以选择保持了两个人类染色体片段的细胞。从所述集落提取基因组DNA并进行PCR。
[0239] 使用表1中显示的引物组合，执行PCR，分别在使用cos138KO-F和cos138KO-R时重复40个由98℃10秒和65℃8分钟构成的循环，在其他情况下重复40个由98℃10秒、60℃30秒和72℃1分钟构成的循环，验证了人类2号染色体是否保持。
[0240]
[0241] 通过下述的反应循环执行PCR，验证了人类22号染色体片段是否保持，对于每种情况使用了下面表2中显示的引物组合。
[0242] 对于每个PCR反应来说，PCR1和7以40个循环的98℃10秒、60℃30秒和72℃1分钟执行，PCR2和3以40个循环的98℃10秒、63℃30秒和72℃1分钟执行，PCR4和5以40个循环的98℃10秒、56℃30秒和72℃1分钟执行，PCR6以40个循环的98℃10分钟、65℃30秒和72℃1分钟执行，PCR8以40个循环的98℃10秒和68℃6分钟执行。
[0243]
[0244] 此外，按照出版物中的方法（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.18:1086-1090,2000），使用人类Cot-1DNA（Invitrogen）作为探针执行了荧光原位杂交（FISH），并证实了两个人类染色体片段具有适合的尺寸（人类2号染色体约为154Mb，人类22号染色体约为24Mb）。结果，克隆SLK2被鉴定为阳性克隆。
[0245] 为了在两个lox2272位点：人类2号染色体片段上的AC 104134位点与人类22号染色体片段上的AP000553位点之间引起位点特异性重组，通过电穿孔（550V，25μF）将Cre表达质粒导入到SLK2中。
[0246] 通过使用由在易位位置处形成的CAG启动子-lox2272-puror盒所提供的嘌呤霉素抗性，在嘌呤霉素（1至5μg/ml，Invitrogen）存在下对重组体进行10天的选择。
[0247] 此外，使用CAGpuro-F3（5’-gcggcgccggcaggaaggaaatg-3’）（SEQIDNO：57）和CAGpuro-R3（5’-cgaggcgcaccgtgggcttgta-3’）SEQ ID NO：58）作为引物进行PCR（40个循环的98℃10秒和68℃1.5分钟）并对PCR产物进行测序分析，证实了重组的发生。
[0248] 结果，SLKH6被鉴定为其中发生了所需易位以保持SLKH片段的克隆。图14显示了用于在DT40杂交细胞中构建SLKH片段的方法的概要。
[0249] 实施例3
[0250] CH2D的构建
[0251] （1）在DT40细胞中人类14号染色体的修饰1
[0252] 为了将lox511序列和CAG启动子整合到位于距IgH基因座约300kb的着丝粒侧上的AL512355位点上，通过电穿孔（550V，25μF）将用SrfI（Stratagene）线性化的打靶载体lox511pSC355CAG hisDDT导入到保持了用pSTneo（Katoh等，Cell Structure and Function,
12,575-580,1987；日本研究生物物质保藏库（Japanese Collection of Research Biologicals（JCRB）Bank），保藏号VE039）标记的完整人类14号染色体的DT40细胞中。电穿孔到DT40细胞中的方法描述在出版物（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.18:1086-1090,2000）中。
12,575-580,1987；日本研究生物物质保藏库（Japanese Collection of Research Biologicals（JCRB）Bank），保藏号VE039）标记的完整人类14号染色体的DT40细胞中。电穿孔到DT40细胞中的方法描述在出版物（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.18:1086-1090,2000）中。
[0253] 通过组胺醇（0.5mg/ml，Sigma）对集落进行2周的选择，并对从抗性集落提取的基因组DNA进行PCR筛选。
[0254] 使 用用于扩 增发生 了打靶的 克隆的 引物 SC35 5KO -F2（5 ’-acggcgtgaggaccaaggagcgaaacc-3’）（SEQ ID NO：59）和SC355KO-R2（5’-
tgagcgacgaattaaaacaggcgatgac-3’）（SEQ ID NO：60），利用40个循环的98℃10秒和68℃6分钟来执行PCR，并且也使用用于扩增其中随机整合了载体片段的克隆的引物355N-F（5’-gggcaacatagcaagacaccattc-3’）（SEQ ID NO：61）和355N-R（5’-
tcctctcacctcagcctccatagta-3’）（SEQ ID NO：62），执行40个循环的98℃10秒、60℃30秒和
72℃1分钟。
tgagcgacgaattaaaacaggcgatgac-3’）（SEQ ID NO：60），利用40个循环的98℃10秒和68℃6分钟来执行PCR，并且也使用用于扩增其中随机整合了载体片段的克隆的引物355N-F（5’-gggcaacatagcaagacaccattc-3’）（SEQ ID NO：61）和355N-R（5’-
tcctctcacctcagcctccatagta-3’）（SEQ ID NO：62），执行40个循环的98℃10秒、60℃30秒和
72℃1分钟。
[0255] 结果，克隆I355-2被鉴定为发生所述打靶的克隆。
[0256] 随后，为了将lox511序列和无启动子的puror盒插入到距AL512355位点着丝粒侧85Mb的AL391156区域中，通过电穿孔（550V，25μF）将用NotI（Roche）线性化的打靶载体p14CEN(FR)hygpurolox511DT导入到I355-2中。
[0257] 用潮霉素（1.5mg/ml，Invitrogen）对集落进行2周的选择，并进而对从抗性集落提取 的 基 因 组 D N A 进 行 P C R 筛 选 。使 用 引 物 1 4 C E N K O - F 3（ 5 ’-actgaaatattttaaatgtttgcccttcccactcc-3’）（SEQ ID NO：63）和14CENKO-R3（5’-agacctccgcgccccgcaacctccccttctac-3’）（SEQ ID NO：64），在40个循环的98℃10秒和68℃5分钟的条件下通过PCR来确定发生了打靶的集落。
[0258] 此外，使用引物14CEN(N)-F2（5’-aacagttgaatttatggggagtc-3’）（SEQ ID NO：65）和14CEN(N)-R2（5’-tcaggctttaaacacagtatcacag-3’）（SEQ ID NO：66），在30个循环的98℃10秒、60℃30秒和72℃1分钟的条件下通过PCR来确定随机插入。
[0259] 结果，克隆I156-10被鉴定为其中发生了所述打靶的克隆。
[0260] 为了通过在各自配置在AL512355位点和AL391156位点上的两个lox51位点之间产生位点特异性重组来缺失来自于人类14号染色体的约85Mb的序列，以实现从约106Mb缩减到21Mb，通过电穿孔（550V，25μF）将Cre表达质粒导入到I156-10中。
[0261] 由于嘌呤霉素抗性由在重组位点处形成的CAG启动子-lox511-puror盒提供，因此将集落培养4天，并通过嘌呤霉素（5μg/ml，Sigma）进行选择。通过使用在实施例2（3）中描述的引物CAGpuro-F3和CAGpuro-R3执行PCR来分析PCR产物的序列，并由此证实了盒的存在。
[0262] 此外，为了证实由于缺失了85Mb而失去了hisD和hygr盒两者，分析了对组胺醇（0.5mg/ml，Sigma）和潮霉素（1.5mg/ml，Invitrogen）的敏感性。此外，使用人类Cot-1DNA（Invitrogen）作为探针，通过FISH证实了人类14号染色体被缩短。
[0263] 在上述实验中，将克隆D8鉴定为获得了所需缺失的克隆。
[0264] 为了将loxP序列整合到人类14号染色体的RNR2基因座（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.27:173-181,2009）上的GFP编码序列中，通过电穿孔（550V，25μF）将用SwaI（Roche）线性化的打靶载体pRNR2loxPbsrDT导入到克隆D8中。通过灭瘟素S（20μg/ml，Invitrogen）对集落进行2周的选择。使用引物RNR2-1（5’-tggatgtatcctgtcaagagacc-3’）（SEQ ID NO：87）和STOP-3（5’-cagacactctatgcctgtgtgg-3’）（SEQ ID NO：88），以40个循环的98℃10秒和65℃5分钟，对抗性集落的基因组DNA进行PCR筛选。
[0265] 结果，将克隆14D1和14D3鉴定为保持了14D片段的阳性克隆。
[0266] 为了通过将人类免疫球蛋白μ重链恒定区的CH2结构域至TM2结构域用牛来源的序列替换以构建嵌合IgM，通过电穿孔（550V，25μF）将用SalI（Roche）线性化的打靶载体pCH2CAGzeoDT(F)导入到克隆14D1中。
[0267] 用1mg/ml博来霉素对集落进行2周的选择，并对抗性集落的基因组DNA进行PCR筛选。使用引物cHAC-F（5’-acgcctgctcgcctgcccgctcgcttct-3’）（SEQ ID NO：67）和cHAC-R（5’-ttgccagggccacagttaacggatacg-3’）（SEQ ID NO：68），在40个循环的98℃10秒和68℃5分钟的条件下执行PCR。
[0268] 通过使用引物CH25’-F（5’-cagcaccccaacggcaacaaagaaa-3’）（SEQ ID NO：69）和CH25’-R（5’-ccccagggctgcactcaccaacat-3’）（SEQ ID NO：70）在40个循环的98℃10秒、64℃30秒和72℃1分钟的条件下，以及使用cHAC-F3（5’-tgcaggtgaagtgacggccagccaagaaca-3’）（SEQ ID NO：71）和cHAC-R3（5’-tggcagcagggtgacagggaaggcagggaaaag-3’）（SEQ ID NO：72）作为引物在40个循环的98℃10秒和68℃8分钟的条件下，执行PCR以分析PCR产物的序列，验证了位于牛序列和人序列的5’和3’处的连接的部分。
[0269] 在上述中，克隆CH2D-4被鉴定为保持了CH2D片段的阳性克隆。图15和16显示了用于在DT40细胞中修饰人类14号染色体的方法的概要。
[0270] 实施例4
[0271] cKSL-HACΔ的构建
[0272] （1）在DT40杂交细胞中构建cKSL-HACΔ
[0273] 按照出版物（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.27:173-181,2009）中描述的方法，在DT40杂交细胞中构建了cKSL-HACΔ。
[0274] 将实施例2（3）中包含hygr盒的SLKH6与实施例3（1）中包含bsr盒的CH2D-4，使用PEG1500（Roche）进行融合，以构建DT40杂交细胞。
[0275] 将集落在潮霉素B（1.5mg/ml，Invitrogen）和灭瘟素S（20μg/ml，Invitrogen）存在下维持3周，以选择保持了SLKH片段和CH2D片段两者的细胞。从抗性集落提取基因组DNA并进行PCR。
[0276] 使用下列引物通过PCR验证了SLKH片段是否保持。即，使用了IGKC-F与IGKC-R的组合、IGKV-F与IGKV-R的组合、RPIA-F与RPIA-R的组合、EIF2AK3-F与EIF2AK3-R的组合、cos138KO-F与cos 138KO-R的组合、CAGpuro-F3与CAGpuro-R3的组合、553P-F与553P-R的组合、hVpreB1-F与hVpreB1-R的组合、hVpreB3-F与hVpreB3-R的组合、IgL-F与IgL-R的组合、344-F与344-R的组合、hL5-F与hL5-R的组合、350P-F与350P-R的组合以及553KO-F与553KO的组合（全都描述在实施例2中）。
[0277] 使用下列引物通过PCR验证了CH2D片段是否保持。即，使用了CAGpuro-F3与CAGpuro-R3[描述在实施例2（3）中]的组合、RNR2-1与STOP-3的组合[描述在实施例3（1）中]、VH3-F（5’-agtgagataagcagtggatg-3’）（SEQ ID NO：73）与VH3-R（5’-cttgtgctactcccatcact-3’）（SEQ ID NO：74）的组合、g1(g2)-F（5’-accccaaaggccaaactctccactc-3’）（SEQ ID NO：75）与g1(g2)-R（5’-
cacttgtactccttgccattcagc-3’）（SEQ ID NO：76）的组合、14CENKO-F3（5’-actgaaatattttaaatgtttgcccttcccactcc-3’）（SEQ ID NO：89）与14CENKO-R3（5’-agacctccgcgccccgcaacctccccttctac-3’）（SEQ ID NO：90）的组合、CH25’-F（5’-cagcaccccaacggcaacaaagaaa-3’）（SEQ ID NO：91）与CH25’-R（5’-
ccccagggctgcactcaccaacat-3’）（SEQ ID NO：92）的组合、cHAC-F3（5’-
tgcaggtgaagtgacggccagccaagaaca-3’）（SEQ ID NO：93）与cHAC-R3（5’-
tggcagcagggtgacagggaaggcagggaaaag-3’）（SEQ ID NO：94）的组合以及SC355F3R3KO-F2（5’-gccattgtcgagcaggtagt-3’）（SEQ ID NO：95）与SC355F3R3KO-R2（5’-tccctcatcagccatcctaa-3’）（SEQ ID NO：96）的组合。
cacttgtactccttgccattcagc-3’）（SEQ ID NO：76）的组合、14CENKO-F3（5’-actgaaatattttaaatgtttgcccttcccactcc-3’）（SEQ ID NO：89）与14CENKO-R3（5’-agacctccgcgccccgcaacctccccttctac-3’）（SEQ ID NO：90）的组合、CH25’-F（5’-cagcaccccaacggcaacaaagaaa-3’）（SEQ ID NO：91）与CH25’-R（5’-
ccccagggctgcactcaccaacat-3’）（SEQ ID NO：92）的组合、cHAC-F3（5’-
tgcaggtgaagtgacggccagccaagaaca-3’）（SEQ ID NO：93）与cHAC-R3（5’-
tggcagcagggtgacagggaaggcagggaaaag-3’）（SEQ ID NO：94）的组合以及SC355F3R3KO-F2（5’-gccattgtcgagcaggtagt-3’）（SEQ ID NO：95）与SC355F3R3KO-R2（5’-tccctcatcagccatcctaa-3’）（SEQ ID NO：96）的组合。
[0278] 对于PCR条件来说，每个PCR反应在下述条件下执行：使用CAGpuro-F3与CAGpuro-R3的组合时以40个循环的98℃10秒和68℃1.5分钟；使用RNR2-1与STOP-3的组合时以40个循环的98℃10秒和65℃5分钟；使用VH3-F与VH3-R的组合时以40个循环的98℃10秒、56℃30秒和72℃1分钟；使用g1(g2)-F与g1(g2)-R的组合时以40个循环的98℃10秒、60℃30秒和72℃1分钟；使用14CENKO-F3与14CENKO-R3的组合时以40个循环的98℃10秒和68℃5分钟；使用CH25’-F与CH25’-R的组合时以40个循环的98℃10秒、64℃30秒和72℃1分钟，使用cHAC-F3与cHAC-R3的组合时以40个循环的98℃10秒和68℃8分钟；使用SC355F3R3KO-F2与SC355F3R3KO-R2的组合时以40个循环的98℃10秒、60℃30秒和72℃1分钟。
[0279] 此外，使用人类Cot-1DNA（Invitrogen）作为探针，通过FISH证实了两个人类染色体片段具有适合的尺寸（SLKH片段约为156Mb，CH2D片段约为21Mb）。
[0280] 在上述中，克隆cKSLD2和cKSLD22被鉴定为阳性克隆。
[0281] 为了在分别排列在SLKH片段[实施例2（3）]的cos138位点和CH2D片段[实施例3（1）]的RNR2基因座上的两个loxP位点之间诱导位点特异性重组，以缺失在嵌合Igμ基因座上的loxP序列之间插入的CAG启动子-zeor盒[实施例3（1）]，通过电穿孔（550V，25μF）将Cre表达载体导入到cKSLD2和cKSLD22中。
[0282] 由于GFP表达能力由在易位位点处构建的PGK启动子-loxP-GFP盒提供，因此，按照出版物中描述的方法（Kuroiwa等，Nat.Biotechnol.18:1086-1090,2000），通过使用FACSAria分拣GFP阳性细胞，对重组体进行浓缩。
[0283] 将分拣执行两次，以获得具有两种不同GFP表达水平的GFP阳性细胞组。
[0284] 使用PCR引物PGK2（5’-tgttctcctcttcctcatctcc-3’）（SEQ ID NO：79）与GFP2（5’-tgaaggtagtgaccagtgttgg-3’）（SEQ ID NO：80）以及PCR引物CreCAGzeo-F3（5’-gccctcaccttgcagaccacctccatcat-3’）（SEQ ID NO：77）与CreCAGZeo-R3（5’-cctctcctgctcagtccccttccttccatc-3’）（SEQ ID NO：78），通过40个循环的98℃10秒和68℃4分钟的PCR，证实了嵌合Igμ基因座上CAG启动子-zeor盒的缺失，因此表明具有低GFP表达水平的组保持了发生所需易位的cKSL-HACΔ。
[0285] 证实了cKSLD2来源的cKSLDH2(2L)和cKSLD22来源的cKSLDH22(2L)被鉴定为由保持了cKSL-HACΔ并表现出低GFP表达水平的细胞组构成的DT40杂交细胞株。图17显示了用于在DT40杂交细胞中构建cKSL-HACΔ的方法的概要。
[0286] （2）通过MMCT方法将cKSL-HACΔ从DT40杂交细胞转移到CHO细胞
[0287] 采取下述方式，通过MMCT方法将实施例4（1）中描述的cKSL-HACΔ从DT40杂交细胞株cKSLDH2(2L)或cKSLDH22(2L)转移到中华仓鼠卵巢（CHO）细胞。
[0288] 使用PEG1500（Roche），将源自于cKSLDH2(2L)或cKSLDH22(2L)的纯化的微核与2×7 -5
10个CHO细胞融合，并通过博来霉素（800μg/ml，Invitrogen）和哇巴因（10 M，Sigma）执行3周的选择。
10个CHO细胞融合，并通过博来霉素（800μg/ml，Invitrogen）和哇巴因（10 M，Sigma）执行3周的选择。
[0289] 在收获博来霉素抗性集落后，提取基因组DNA并对其进行PCR筛选。使用下列PCR引物证实了cKSL-HACΔ是否保持。即，使用了IGKC-F与IGKC-R的组合、IGKV-F与IGKV-R的组合、RPIA-F与RPIA-R的组合、EIF2AK3-F与EIF2AK3-R的组合、cos138KO-F与cos138KO-R的组合、CAGpuro-F3与CAGpuro-R3的组合、553P-F与553P-R的组合、hVpreB1-F与hVpreB1-R的组合、hVpreB3-F与hVpreB3-R的组合、IgL-F与IgL-R的组合、344-F与344-R的组合、hL5-F与hL5-R的组合、350P-F与350P-R的组合、553KO-F与553KO-R的组合[都描述在实施例2（3）中]、VH3-F与VH3-R的组合、g1(g2)-F与g1(g2)-R的组合、PGK2与GFP2的组合、14CENKO-F3与14CENKO-R3的组合、CH25’-F与CH25’-R的组合、cHAC-F3与cHAC-R3的组合[都描述在实施例
3（1）中]、SC355F3R3KO-F2与SC355F3R3KO-R2的组合[实施例3（2）]以及CreCAGzeo-F3与CreCAGzeo-R3的组合[实施例4（1）]。
3（1）中]、SC355F3R3KO-F2与SC355F3R3KO-R2的组合[实施例3（2）]以及CreCAGzeo-F3与CreCAGzeo-R3的组合[实施例4（1）]。
[0290] 此外，使用人类Cot-1DNA（Invitrogen）作为探针通过FISH验证了cKSL-HACΔ是否保持。此外，使用来自于Roswell Park癌症研究所人类男性BAC文库（Roswell Park Cancer Institute Human Male BAC Library）（RPCI-11）的BAC克隆RP 11-417P24、RP11-316G9和RP11-22M5（Advanced GenoTechs Co.）作为探针，通过3色FISH证实了cKSL-HACΔ上人类免疫球蛋白重链（IgH）、免疫球蛋白κ链（Igκ）和免疫球蛋白λ链（Igλ）基因座的存在。
[0291] 用Roche NimbleGen，通过使用覆盖人类IgH、Igκ和Igλ的基因座的约72000个探针的定制阵列，执行了比较基因组杂交（CGH）分析。结果，揭示了通过MMCT方法从cKSLD2(2L)获得的克隆cKSLDC6和通过MMCT方法从cKSLDH22(2L)获得的克隆cKSLDC15和cKSLDC23，具有同源结构。
[0292] 实施例5
[0293] KcHAC的构建
[0294] （1）在牛成纤维细胞中KcHAC的构建
[0295] 按照出版物中描述的方法（Kuroiwa等，Nat Genet.36:775-780,2004）转染牛成纤维细胞株C537（κHAC/IGHM-/-IGHML1-/-），区别在于使用打靶载体pCH1CAGzeoDT进行400μg/ml博来霉素选择。
[0296] 使用cHAC-F3R3（5’-tgcaggtgaagtgacggccagccaagaaca-3’）（SEQ ID NO：81）和5’-tggcagcagggtgacagggaaggcagggaaaag-3’（SEQ ID NO：82）作为引物组，通过40个循环的98℃10秒和68℃8分钟进行基因组PCR来鉴定重组体。
[0297] 使用30号集落进行克隆，以建立保持了KcHAC的40天的胎牛和细胞株C815。图18显示了用于在成纤维细胞中构建KcHAC的方法的概要。
[0298] （2）CAGzeo盒的缺失
[0299] 为了从KcHAC缺失CAGzeo盒，将Cre表达质粒与pBShisD/XmnI（线状）一起导入到细胞株C815中。
[0300] 通过hisD（1mg/ml）对集落进行2周的选择。通过使用zeo-F和zeo-R[分别由核苷酸序列5’-acgtcgccggagcggtcgagttctg-3’（SEQ ID NO：83）和5’-tcggccacgaagtgcacgcagttgc-3’（SEQ ID NO：84）构成]以及Cre-F和Cre-R[分别由核苷酸序列5’-aaaacaggctctagcgttcg-3’（SEQ IDNO：85）和5’-ttcggatcatcagctacacc-3’（SEQ ID NO：86）构成]作为引物组，通过40个循环的98℃10秒、65℃或58℃30秒以及72℃30秒进行基因组PCR，以证实未包含CAGzeo盒与Cre序列，来鉴定其中CAGzeo盒被缺失的克隆。
[0301] 将15号集落用于克隆，以产生保持了CAGzeo被缺失的KcHAC的40天胎牛和细胞株M112。
[0302] （3）通过WCF方法将KcHAC从牛成纤维细胞转移到CHO细胞
[0303] 将细胞株M112与CHO-K1细胞进行WCF。使用PEG1500（Roche），将2×106个每种细胞融合，并在G418（600μg/ml，Invitrogen）和哇巴因（1×10-5mol/L，Sigma）存在下进行2至3周的药物选择。
[0304] 使用CH3-F3与CH4-R2的组合、VH3-F3R3的组合、IGKV-FR与IGKC-FR的组合以及PGK2与GFP2的组合作为引物组，通过一组基因组PCR对CHO样细胞集落进行筛选。
[0305] 克隆CKF4被鉴定为作为将KcHAC转移到牛成纤维细胞的供体。
[0306] 实施例6
[0307] 将HAC转移到牛细胞株中以产生用于生产人IgG的HAC牛
[0308] 使用MMCT方法（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.18:1086-1090,2000），将cKSL-HACΔ从杂交细胞转移到CHO细胞。
[0309] 将包含KcHAC的CHO克隆在增补有10%FBS（Invitrogen）和G418（0.6mg/ml）的F12培养基（Invitrogen）中，在37℃和5%CO2条件下进行培养。此外，将包含cKSL-HACΔ的CHO克隆在增补有10%FBS（Gibco）和博来霉素（0.8mg/ml）的F12培养基（Invitrogen）中，在37℃和5%CO2条件下进行培养。
[0310] 将含有HAC的克隆在12个T25培养瓶中进行扩大培养。在细胞密度达到80至90%后，向培养基加入秋水仙胺（Sigma）至终浓度为0.1μg/ml。
[0311] 3天后，将培养基用增补有10μg/ml松胞菌素B（Sigma）的DMEM培养基（Invitrogen）更换。通过将培养瓶以8000rpm离心60分钟，来回收微核。将微核通过8、5、3-μm滤器（Costar）进行纯化，然后重悬浮在DMEM培养基中。如下所述将微核用于与牛成纤维细胞进行融合。
[0312] 将胎牛成纤维细胞（IGHM-/-IGHML1-/-，Kuroiwa等，Nat Biotechnol.27:173-181,2009）在增补有15%FBS（Hyclone）的α-MEM（Invitrogen）培养基中，在38.5℃和6.5%CO2条件下进行培养。将成纤维细胞在T175培养瓶中扩大培养。当细胞密度达到70至80%时，使用
0.05%胰蛋白酶将细胞与细胞分离开。将分离的成纤维细胞用DMEM培养基清洗两次，然后覆盖在微核悬液上。
0.05%胰蛋白酶将细胞与细胞分离开。将分离的成纤维细胞用DMEM培养基清洗两次，然后覆盖在微核悬液上。
[0313] 在将微核-成纤维细胞悬液以1,500rpm离心5分钟后，按照随附的方案向沉淀团加入PEG1500（Roche），以允许微核与牛成纤维细胞融合。
[0314] 随后，将融合的细胞铺在10个24孔板中，并在增补有15%FBS的α-MEM培养基中培养24小时。然后，将培养基在KcHAC的情况下用含0.8mg/ml G418的培养基更换，在cKSL-HACΔ的情况下用含0.6mg/ml博来霉素的培养基更换。
[0316] 将选择的包含各种HAC的融合细胞用作染色质供体，进而通过WO2002/051997中描述的染色质转移方法来生产包含各种HAC的牛。
[0317] 实施例7
[0318] HAC牛血清中的人类IgG水平的评估
[0319] 通过出版物中描述的方法（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.27:173-181,2009），测量了构建的各种HAC牛血清中的人类IgG水平。在6月龄HAC牛的各血清中人类IgG的总量显示在下面的图19中。此外，在各6月龄HAC牛血清中人类IgG总量的平均值，显示在下面的表3中。
[0320] [表3]
[0321] 各6月龄HAC牛的牛血清中人类IgG的总量（μg/mL）
[0322] κHAC KcHAC cKSL-HACΔ
433.9 1252 4172
433.9 1252 4172
[0323] 如图19和表3中所示，在具有KcHAC或cKSL-HACΔ的牛中，与具有κHAC的牛相比，血清中的人类IgG生产量显著增加。
[0324] 此外，按照出版物（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.27:173-181,2009），通过流式细胞术对HAC牛外周血和淋巴结中的B细胞分型进行了分析。结果，在KcHAC牛和cKSL-HACΔ牛外周血中，与κHAC牛外周血中相比，表达IgM的B细胞的数量增加。此外，甚至在KSL-HAC牛和cKSL-HACΔ牛淋巴结中表达IgM的B细胞的数量，与κHAC牛淋巴结中的数量相比也增加了。
[0325] 实施例8
[0326] 通过HAC牛生产针对炭疽保护性抗原的人类IgG
[0327] 为了评价HAC牛能够由于人类IgG而引发针对已知单一抗原的抗原特异性体液应答，使用了炭疽保护性抗原（在下文中称为PA）并进行检查。按照出版物中的描述（Kuroiwa等，Nat Biotechnol.27:173-181,2009），用PA对3只KcHAC/IGHM-/-IGHML1-/-牛（No.1710、No.1824和No.1834）进行免疫接种，并测量PA特异性人类IgG的滴度。结果显示在表4中。
[0328] [表4]
[0329] KcHAC牛中PA特异性人类IgG的生产量（U/mg IgG）
[0330]
[0331] 结果，在第二次免疫接种的时间点，KcHAC牛产生约12000至63000U/mg IgG的PA特异性人类IgG，并且在No.1834中，在免疫接种被重复至第五次免疫接种中的任何时间，PA特异性人类IgG的生产量均增加。
[0332] 实施例9
[0333] 通过HAC牛生产对T细胞表面膜蛋白混合物特异的人类IgG
[0334] 为了评价HAC牛能够由于人类IgG而引发针对未知复杂抗原的抗原特异性体液应答，使用了T细胞表面膜蛋白混合物（CEM细胞膜制剂的级份，在下文中称为CEM）作为抗原并进行检查。
[0335] （1）CEM细胞的培养
[0336] 通过使用包含10%胎牛血清（Hyclone）的RPMI1640培养基（ATCC），允许人类T细胞2
株CCRF-CEM（ATCC）在37℃和5%CO2的恒湿恒温培养箱中增殖，直到225cm培养瓶中的细胞合生（2×106个细胞/mL）。
株CCRF-CEM（ATCC）在37℃和5%CO2的恒湿恒温培养箱中增殖，直到225cm培养瓶中的细胞合生（2×106个细胞/mL）。
[0337] 在具有弯曲盖的850cm2转瓶（Corning）中，装入500mL含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，并以2×105个细胞/mL的密度接种细胞。
[0338] 将转瓶置于转瓶培养装置（Thermo Scientific）上，并将细胞培养5天。为了从转瓶回收CEM细胞，将培养物注入2L无菌聚丙烯生物瓶（Nalgen）中。
[0339] 随后，使用Sorvall RC12BP以450×g在2至8℃离心30分钟。将细胞形成沉淀团。将细胞沉淀团重悬浮在无菌冰冷的PBS中，然后进行两次清洗操作。
[0340] 在最后清洗后，将细胞沉淀团以2×108个细胞/mL的密度悬浮在冰冷的包含1mM PMSF（Sigma）、各种蛋白酶抑制剂[1.6μM抑肽酶，40μM亮抑肽酶，2mM AEBSF，0.1mM苯丁抑制素，30μM E-64和20μM胃酶抑素A（CalBioChem）]以及25.6μg/ml DNAseI（Sigma）的裂解缓冲液（20mM Tris-盐酸，10mM NaCl，0.1mM MgCl2）中。然后将细胞立即在液氮中冷冻。将冷冻细胞储存在-80℃下直到进一步使用。
[0341] （2）通过蔗糖密度梯度离心分离CEM细胞膜
[0343] 在用移液器使用冷却的41%（w/w）蔗糖溶液将该破碎材料注入到无菌超透明离心管中裂解缓冲液的底部中之后，使用Beckman超速离心机在4℃下以83,000×g（SW32Ti转头）进行1小时的离心。
[0345] 通过在4℃下以80,000×g（70.1Ti转头）超速离心50分钟，将CEM膜制成沉淀团。在用无菌巴氏吸管仔细地除去上清液后，使用无菌冰冷的PBS通过在4℃下超速离心50分钟，将CEM清洗一次。
[0346] 最后，将CEM细胞膜重悬浮在PBS中。为了破碎膜沉淀团，使用超声处理器在20安培和30秒条件下，将CEM细胞膜在冷却水浴中进行超声处理。将CEM膜破碎材料储存在-80℃下直到进一步使用。
[0347] （3）CEM膜的预免疫接种
[0348] 使用CEM膜制备物，以3mg/次的量对4只KcHAC/IGHM-/-IGHML1-/-牛（No.1863、-/- -/-No.1865、No.1868和No.1735）和2只cKSL-HACΔ/IGHM IGHML1 牛（No.1922、No.1923）执行免疫接种。
[0349] 该CEM膜制备物使用Montanide ISA25佐剂（Seppic）来制备，所述佐剂是具有皂角苷来源的免疫诱导剂Quil A（Accurate Chemicals）的水包油类型的乳液。以4周的时间间隔对牛进行4次免疫接种。将疫苗肌肉内接种至颈部区域（2mL/剂）。
[0350] 为了测量抗体滴度，在免疫接种之前和免疫接种后第10和14日收集血清样品。在使血液在血清分离管中静置至凝集后，通过离心分离血清。此外，将血清以0.5至1mL分配并冷冻和储存，直到进一步测定。抗CEM抗体的滴度通过CEM细胞特异性人类IgG ELISA来测定。
[0351] （4）CEM细胞特异性ELISA测定法
[0352] 使用5%Membrane Block/PBS（GE Healthcare）缓冲液从血清样品制备4个连续稀释液。
[0353] 为了制备标准曲线，使用从CEM免疫动物获得的、已事先测定了最终滴度的高滴度血清作为标准品和5%Membrane Block/PBS，制备了以2.5倍稀释率稀释275倍至67,139倍的7级浓度系列。
[0354] 使用最终浓度的倒数作为滴度单位，并且将标准品情况下测定的最终滴度定义为55,000单位。对于阳性对照血清和阴性对照血清来说，使用5%Membrane Block/PBS制备系列稀释液并用作内标，用于验证测定法的一致性。
[0355] 为了确定CEM特异性人类IgG的滴度，在U型底96孔微量滴定板（Costar）中注入50μL样品（校正用标准血清稀释液、阳性对照血清稀释液、阴性对照血清稀释液和测量样品血清稀释液），制作两份平行样，并向其加入50μL CEM细胞（4×106个细胞/mL）。
[0356] 将板在4℃下静置60分钟后，将板用100至200μL PBS清洗三次以除去未结合的蛋白。在每次清洗操作后，将板以2850×g进行5分钟离心，从每个孔仔细地吸取并除去上清液。
[0357] 在3次清洗操作后，向每个孔加入100μL用5%Membrane Block/PBS缓冲液稀释50,000倍的HRP标记的驴抗人IgG抗体（Jackson Immuno Research），以将细胞沉淀团重悬浮在HRP溶液中。将板在4℃下静置30分钟后，如上所述将板用PBS清洗三次。
[0358] 最后，通过在板中分发100μL/孔的TMB+H2O2基质混合溶液（KPL），并将板也在25℃下静置15分钟，来检测结合的抗CEM抗体。在用100μL/孔的10%磷酸终止产色反应后，使用微孔板读板器（Biotek Instruments）在450nm处测量。
[0360] 结果显示在图20中。此外，在第二次CEM施用后每只HAC牛血清中的CEM特异性人类IgG的滴度，显示在表5中。在第二次CEM施用后，显示出总人类IgG中的CEM特异性人类IgG，在cKSL-HACΔ牛中产生约7000U/mg IgG，在KcHAC牛中产生约1700至4700U/mgIgG。
[0361] [表5]
[0362] CEM特异性人类IgG的产生（U/mg IgG）
[0363]
[0364] [参考例]
[0365] 参考例1
[0366] 保持人类2、14和22号染色体的小鼠A9细胞的建立
[0367] 按照WO1998/037757中描述的方法，将质粒pSTneo[Katoh等，Cell Structure and Function,12,575-580,1987；日本研究生物物质保藏库（Japanese Collection of Research Biologicals（JCRB）Bank），保藏号VE039]导入人类正常成纤维细胞HFL-1（RIKEN日本细胞库（Japan Cell Bank），保藏号RCB0251）中，以获得转化细胞。
[0368] 然后，执行转化细胞与小鼠成纤维细胞A9（Oshimur等，Environmental Health Perspectives,93,57-58,1991；JCRB细胞库，保藏号JCRB0211）的细胞融合，以构建杂交细胞。
[0369] 随后，按照WO1998/037757中描述的方法，将从杂交细胞制备的微核与小鼠A9细胞融合。通过基因组PCR、基因组Southern分析、荧光原位杂交（FISH）等从获得的克隆鉴定每个包含所需人类2、14和22号染色体的克隆。
[0370] 参考例2
[0371] 含有人类2号染色体片段的DT40杂交细胞kTL1的构建
[0372] 通过WO 2008/013067中描述的微核融合方法，将人类2号染色体从参考例1中获得的包含人类2号染色体的A9细胞导入到鸡B细胞DT40（JCRB细胞库，保藏号JCRB2221）中。
[0373] 随后，使用WO 2008/013067中描述的端粒截短方法，通过将打靶载体pTELPuroCD8A（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000）导入到DT40杂交细胞中，将端粒序列插入到人类2号染色体上的CD8A基因座中，并在该插入位点处诱导染色体截短。
[0374] 通过本操作，可以构建包含具有从CD8A基因座至端粒末端区域缺失的人类2号染色体的DT40杂交细胞kTL1。
[0375] 参考例3
[0376] 含有人类22号染色体的DT40杂交细胞52-18的构建
[0377] 通过WO 2008/013067中描述的微核融合方法，将人类22号染色体从参考例1中获得的包含人类22号染色体的A9细胞导入到鸡B细胞DT40（JCRB细胞库，保藏号JCRB2221）中。通过本操作，可以构建包含人类22号染色体的DT40杂交细胞52-18。
[0378] 参考例4
[0379] 含有人类14号染色体片段的DT40杂交细胞R56的构建
[0380] 按照Kuroiwa等报告的描述(Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,2000)，通过将打靶载体pRNR2loxPbsr（Kuroiwa等，Nature Biotechnology,18,1086-1090,
2000）导入到包含人类14号染色体片段SC20的DT40细胞（国立高等工业科学技术研究所（产业技术综合研究所国际专利生物保藏部，保藏号FERM BP-7583）中，将loxP序列插入到人类
14号染色体上的RNR2基因座中。通过本操作可以构建包含在RNR2基因座处具有loxP序列的SC20的DT40杂交细胞R56。
2000）导入到包含人类14号染色体片段SC20的DT40细胞（国立高等工业科学技术研究所（产业技术综合研究所国际专利生物保藏部，保藏号FERM BP-7583）中，将loxP序列插入到人类
14号染色体上的RNR2基因座中。通过本操作可以构建包含在RNR2基因座处具有loxP序列的SC20的DT40杂交细胞R56。
[0381] 参考例5
[0382] 含有人类14号染色体的DT40杂交细胞#14/DT40的构建
[0383] 通过WO 2008/013067中描述的微核融合方法，将人类14号染色体从参考例1中获得的包含人类14号染色体的A9细胞导入到鸡B细胞DT40（JCRB细胞库，保藏号JCRB2221）中。通过本操作，可以构建包含人类14号染色体的DT40杂交细胞#14/DT40。
[0384] 尽管已经详细地并参考特定实施方案对本发明进行了描述，但对于本技术领域的专业人员来说，显然可以在其中进行各种改变和修改而不背离本发明的精神和范围。就此而言，本发明是基于2009年11月17日提交的美国临时申请（美国临时申请号61/261,935），其全部内容在此引为参考。
[0385] 工业实用性
[0386] 本发明提供了包含人类抗体重链编码基因、人类抗体轻链编码基因和非人类动物来源的IgM重链恒定区编码基因的人类人工染色体载体，当所述载体被导入动物时能够以更高效率生产人类抗体。通过用所需抗原来免疫接种使用本发明的人类人工染色体载体产生的动物，可以供应大量人类多克隆抗体。
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