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一种口 蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽及其应用

阅读：524发布：2020-05-18

专利汇可以提供一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种口蹄疫 A型结构蛋白VP1 抗原表位多肽及其应用。该一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽。本发明使用化学合成上述VP1抗原肽包被反应板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在感染或免疫后产生的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1 抗体。本发明试剂盒特异性好、敏感、高效，具有良好的市场前景。，下面是一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。
2.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物，其有效成分为为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上任意组合。
3.一种口蹄疫A型病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标二抗；所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示多肽中的一种或几种组成的混合多肽。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽的质量比为:0.5～2.0:1；所述序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示多肽的质量比优选为1:1。
5.根据权利要求2～4中任意一项，其特征在于：所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标二抗为酶标记葡萄球菌A蛋白；所述酶标二抗优选为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白。
6.根据权利要求2～4中任意一项的试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的获得方法是将所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔50ng每肽，在
37℃放置2～4小时，再4-8℃下放置8～12小时使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有0.01g/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有显色液和终止液；
当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含
0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄疫抗体的正常猪或牛血清；所述阳性对照血清为以所述A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为免疫原免疫猪、牛得到的血清；和/或所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.005g/ml酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液；浓缩洗涤液：0.01M，pH 7.4，含有体积百分浓度为0.8％～1.2％的Tween-20和0.0005g/ml叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液。
10.权利要求1所述的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽在制备检测感染或免疫后产生的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体的试剂盒中的应用；其中，动物口蹄疫病毒病为猪或牛口蹄疫A型病毒病；优选的，所述动物口蹄疫病毒为猪、牛口蹄疫A型病毒引起的口蹄疫病毒病。

说明书全文

一种口 蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽及其应用

[0001] 本申请是申请号为“201610751029.2”，发明名称为“一种口蹄疫A型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒”的专利申请的分案申请

技术领域

[0002] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，特别是口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。

背景技术

[0003] 口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的以感染偶蹄动物为主的急性、热性、高度接触传染性和快速远距离传播的动物疫病,以传染性强、传播速度快、危害严重而著称(谢庆阁,2004)。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的多种动物共患传染病之一，我国将其列为一类动物传染病。

[0004] 口蹄疫传染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降。该病传播迅速,可以引起世界性的大流行,不仅对畜牧业造成巨大的经济损失,而且严重影响动物及其产品的国际贸易和声誉。由于FMD的巨大危害性,美国权威著作《家畜传染病》早在1981年版中就声明:FMD不仅是经济性疾病,同时也是政治性疫病。

[0005] 口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科，口蹄疫病毒属。由“假”20面体对称的衣壳和病毒核酸构成，该病毒粒子的整个外形是球形，不是严格的正20面体。完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，衣壳由VP1,VP2，VP3和VP4等4种结构蛋白各60个分子组成。结构蛋白VP1大部分暴露在病毒粒子表面,是决定病毒抗原性的主要成分,也是刺激机体产生中和抗体的主要蛋白。4种结构蛋白中VP1变异性最大,VP2较为保守,VP4最保守。病毒衣壳蛋白的功能有:保护RNA 免遭核酸酶降解；识别特异性细胞受体,决定宿主范围和组织嗜性；决定病毒的抗原性；释放和传递病毒RNA通过细胞膜进入易感细胞内；指导选择和包装病毒RNA。

[0006] 2004年OIE公布的口蹄疫血清学检测方法有3种：病毒中和试验(VNT)、液相阻断ELISA(LPB-ELISA)、固相竞争ELISA(SPC-ELISA)，其中病毒中和试验是3种方法中最为经典的方法，是评价其他方法的黄金标准。1996年，口蹄疫世界参考实验室建立了液相阻断ELISA方法，经过不断完善和健全，已成为各国大规模血清学检测的方法，用于检测动物免疫抗体、评估动物免疫状况、进行血清学调查等，该方法的敏感性、特异性和稳定性一直在国际上得到公认，是目前使用最广的口蹄疫血清学检测方法。2001年，口蹄疫世界参考实验室建立了固相竞争ELISA方法，该方法除了具有液相阻断ELISA方法的传统优势外，其特异性更好，操作更为简单(其操作时间仅为3.5h)，2004年被OIE确立为口蹄疫血清学调查的最新推荐方法。

[0007] 口蹄疫是关系到国家经济安全的重大动物疫病，目前,大多数发展中国家和地区都通过接种疫苗的方法来控制口蹄疫的流行。我国防控FMD主要采取疫苗免疫和抗体监测为主的综合防控政策,通过接种疫苗提高畜群整体抗体水平来预防口蹄疫的感染和传播。因此口蹄疫感染的快速诊断、猪和牛免疫效果评价、自然感染和疫苗免疫的鉴别诊断成为防控口蹄疫的部分关键技术。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种新的基于酶联免疫吸附试验，用于检测猪、牛血清中是否含有口蹄疫A型病毒结构蛋白抗体的试剂盒。本发明利用VP1结构蛋白,建立一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法,为猪、牛口蹄疫免疫抗体的检测和感染抗体的诊断提供一种简便有效的新方法,为口蹄疫综合防控提供技术支持。

[0009] 为了达到上述目的，本发明首先筛选得到了性能优异的抗原表位多肽，本发明提供的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。

[0010] 更进一步的，本发明提供一种口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽组合物，其有效成分为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2的多肽和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上任意组合。

[0011] 本发明的口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板和酶标二抗；所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽。

[0012] 本发明的口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒中，所述序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽和序列表中序列3所示的多肽的质量比为0.5～2.0:0.5～2.0:1，优选为1:1:1。所涉及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含有口蹄疫病毒结构蛋白VP1的主要抗原位点，可与口蹄疫病毒感染后或免疫后产生的结构蛋白VP1抗体特异结合。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述酶标二抗为酶标记葡萄球菌A蛋白；所述酶标二抗优选为辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白。

[0013] 所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽为化学人工合成得到。

[0014] 所述口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽包被的酶联反应板的板的最佳制备条件是：将所述口蹄疫A型结构蛋白VP1抗原表位多肽溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔每肽50ng抗原，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置过夜，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH＝7.4)，37℃封闭处理2～3h，用洗涤缓冲液(浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液)洗涤后甩干，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。

[0015] 所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液；所述显色液B液为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液,使用时两者以1:1的比例混合；当标记酶为碱性磷酸酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

[0016] 所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄疫抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为以所述口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽为免疫原免疫猪得到的血清；

[0017] 所涉及的阳性对照血清是具体是以上述人工化学合成的包被抗原(口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗原表位多肽)作为免疫原(免疫25～35日龄无特定病源体猪)制备高免血清，过0.2μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。

[0018] 所涉及的阴性对照血清是用无口蹄疫抗体的正常猪血清，过0.22μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。

[0019] 所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液(过0.22μm滤膜)；浓缩洗涤液：0.01M，pH 7.4，含有0.8％～1.2％(ml/ml，优选0.5％ml/ml)Tween-20和0.05％(g/ml)叠氮钠防腐剂的磷酸盐缓冲液(经过0.22μm滤膜除菌)。

[0020] 本发明试剂盒的检测程序为：

[0021] 1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。

[0022] 2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；

[0023] 3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。

[0024] 4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。

[0025] 5、加样：2个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。

[0026] 6、温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。

[0027] 7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液。连续洗板4次后拍干。

[0028] 8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白。

[0029] 9、温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。

[0030] 10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液。连续洗板4次后拍干。

[0031] 11、显色每孔分别加入100μl的底物显色液(其中溶液A和溶液B以体积比为1：1的比例混合)。加盖，37℃恒温箱里反应15min；

[0032] 12、每孔分别加入50μl终止液终止反应，混匀；

[0033] 13、测定每孔的OD450值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450值)。

[0034] 检测结果的判定：

[0035] 1、阴性对照OD450平均值应该≤0.15，否则无效。

[0036] 2、阳性对照每个检测值应该在0.9-2.3之间，否则无效。

[0037] 3、临界值的计算：牛血清临界值＝0.15×阳性对照OD450值平均值

[0038] 猪血清临界值＝0.18×阳性对照OD450值平均值

[0039] 待检血清测定OD450值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450值<临界值者判为阴性。

[0040] 本发明的上述试剂盒，可用于检测口蹄疫A型病毒结构蛋白抗体，以判断被检动物是否存在感染或免疫后产生的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体，其中，动物口蹄疫病毒病为猪、牛口蹄疫病毒病，具体可以为猪、牛口蹄疫A型病毒引起的口蹄疫病毒病。

[0041] 在制备检测是否感染动物口蹄疫病毒病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；

[0042] 本发明的积极效果在于：本发明采用生物信息学方法对结构蛋白的抗原表位进行精确分析，从VP1蛋白上的主要抗原表位上筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。

[0043] 同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板以及制备试剂盒中的阳性对照血清。

[0044] 另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提高了检测口蹄疫结构蛋白抗体的效率，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒或接种疫苗。

[0045] 总之，本试剂盒采用化学合成结构蛋白VP1主要抗原位点的抗原肽包被酶联反应板，抗原用量少、灵敏度高、特异性强，可以有效地检测口蹄疫病毒感染或接种灭活疫苗后产生的结构蛋白VP1抗体，以判断被检动物是否感染口蹄疫病毒或接种疫苗，与口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测试剂盒联用，可区分口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。实验结果表明，本发明的试剂盒重复性好，特异性强，灵敏度高。能满足不同层次人员的需要，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

[0046] 本发明所涉及的口蹄疫病毒结构蛋白酶联免疫吸附试验诊断试剂盒用于检测动物是否感染口蹄疫病毒或接种口蹄疫疫苗，有利于减少我国口蹄疫爆发所带来的损失，也有利于我国口蹄疫防控体系的建立。

具体实施方式

[0047] 下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

[0048] 实施例1、口蹄疫A型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒包被抗原的制备[0049] 本试验针对国内口蹄疫流行毒株的不同，采用生物信息学方法对口蹄疫病毒A型VP1结构蛋白多个亚型进行精确分析，筛选出合适的肽段，用全自动多肽合成仪分别合成出根据流行毒株序列设计的3条肽，序列分别为序列表中序列1、序列2和序列3所示，制成纯度约90％的更新更全的包被抗原，能够适应口蹄疫病毒不断突变的特性，提高抗体阳性的检出率。多肽合成方法可为常规方法，本发明使用如下方法合成本发明的三条多肽，作为本发明试剂盒的包被原。

[0050] 本发明的包被抗原可使用Applied Biosystem全自动多肽合成仪(型号433A)制备。运用Merrifield固相合成法，采用的是Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，9-芴甲氧羰基)修饰的氨基酸，使用Rink Amide MBHA树脂作为固相载体。生产过程包括多肽抗原固相合成、多肽裂解和鉴定、抗原纯化、冷冻干燥以及保存五部分。以下分别进行说明：

[0051] 一、包被抗原固相合成

[0052] 1、合成试剂的准备

[0053] 合成包被抗原氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

[0054] 依据包被抗原序列以及合成规模准备合适的Fmoc修饰的氨基酸(购自NOVA公司)，加入至对应的Cartridge中。同样按要求合成规模称树脂5g，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，批号，反应腔的TARE及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制适量的合成试剂包括100％的NMP、3％的AIM(已酰咪唑)、35％的PIP(哌啶)、100％的MeOH(甲醇)等放置到相对应的试剂瓶中。

[0055] 2、合成仪状态的检测

[0056] 检查433A多肽合成仪器是否正常运行，开机后，运行Run Self Test程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常(433A正常表压10.2psi)。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。433A合成仪：发送Flow Rate1-18到合成仪，选择Main Menu—Module Test—按Prer或next找Module A、ModuleD、ModuleI、ModuleI、Module A)—按Start—按more进行测量或观察，若流量不合适，则调节下阀门压力，直至达到要求(具体检测要求见下表1)。

[0057] 表1.多肽合成仪流速检测标准表

[0058]试剂瓶号 Module 标准范围
35％Piperidine 1 A 1.0～1.2ml
3％AIM 4 D 1.0～1.2ml
100％MeOH 9 I 3.5～4.0ml
DIC 8 I 0.45～0.55g
100％NMP 10 A 2.6～2.8ml

[0059] 3、包被抗原合成开始

[0060] 在433A合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列发送Std Fmoc 1.0 Sol DIC90到合成仪上。File-New-Sequence-编辑合成肽的序列，保存。File-New-Run，检查Chemistry是否为Std Fmoc 1.0 Sol DIC 90；Sequence是否为所存名字；设定Cycles；保存。最后发送到合成仪上。

[0061] Main Menu—Cycle Monitor—begin，开始运行。

[0062] 4、包被抗原合成进行

[0063] Fmoc基团的脱除，Fmoc基团的芴环系的吸电子作用使9-H具有酸性，易被较弱碱除去，反应时用哌啶(PIP)进攻9-H,β消除形成二苯芴烯，很容易被二级环胺进攻形成稳定的加成物。Fmov基团的脱除后暴露出“－NH2”基团以进行合成反应。然后加入活化的下一个Fmoc基团保护的氨基酸和1-羟基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole，HOBT)至反应器内。

[0064] 如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照特定的顺序，依次不断地重复合成步骤(合成按程序自动完成，具体循环步骤如下表2)。期间观察记录试剂用量及运行情况。

[0065] 表2.包被抗原合成循环步骤

[0066]

[0067] 5、包被抗原合成结束

[0068] 包被抗原合成结束后合成仪将自动停止，并且肽树脂(肽连接在树脂上)基本洗涤干净。然后从多肽合成仪上取下反应器，再用100％甲醇洗涤肽树脂3次后，在通风橱内吹干，然后将多肽树酯全部转移至棕色的聚乙烯瓶内，放入-20℃冰箱内，封口膜密封备用。

[0069] 二、包被抗原的裂解及鉴定

[0070] 1、多肽抗原的裂解

[0071] 经上述反应所得到的多肽是与固相载体通过化学键结合在一起的，必须通过特定的有机强酸的酸解把多肽与固相载体分离。酸解的同时也除去了各个氨基酸官能团上的保护基。步骤如下：

[0072] 从冰箱内取出合成的肽树酯(多肽连接在树脂上)，放入一只2L的圆底烧瓶内，在通风橱内向烧瓶中加入90ml三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA)、10ml的三丙基硅烷(TIS)和磁力搅拌子，然后稳定地将烧瓶放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌1h至反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发30～120min除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到包被抗原。

[0073] 2、包被抗原的鉴定

[0074] 多肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MODAL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析，用常见的氨基酸分析来鉴定所合成的肽。

[0075] 3、包被抗原纯化

[0076] 将环化后的多肽抗原使用循环式切向过滤膜包进行超滤(用PALL公司生产的Tangential Flow Device循环式切向过滤膜包以及与其配套的蠕动泵)，多肽抗原作为大分子不能通过一定孔径的滤膜，而前期合成过程以及后期环化反应形成或引进的小分子杂质则可以通过滤膜。然后再通过孔径为0.2μm 过滤器除菌，将最后所得溶液分装到无菌塑料瓶内，贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件，分装后，储存于-20℃或-40℃备用。

[0077] 4、包被抗原冷冻干燥

[0078] 为了便于长期保存和运输，需要将包被抗原进行冷冻干燥以得到固体状态的多肽。将预先冷冻好的包被抗原放置于Labconco的冷冻干燥机上进行干燥，得到固体状态的包被抗原。包装后贴上标签。标签上注明多肽的名称、编号、生产批号、浓度、生产日期、保存期限及保存条件。

[0079] 实施例2、口蹄疫A型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的制备

[0080] 口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒包括：

[0081] (1)包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板；2×96孔。

[0082] (2)辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白(购自abcam公司，货号ab7456)，2瓶(各12ml)。

[0083] (3)阳性对照血清：是以实施例1中人工化学合成的包被抗原作为免疫原，分别免疫25～35日龄无特定病源体猪制备的高免血清，过0.22μm滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清(1管，1.5ml/管)。

[0084] (4)阴性对照血清：是用无口蹄疫抗体的正常猪血清，过0.22μm滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清(1管，1.5ml/管)。

[0085] (5)底物显色液：由两种溶液混合组成，溶液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液(1瓶，12ml/瓶)；溶液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液(1瓶，12ml/瓶)；使用时两者以体积比为1:1的比例混合。

[0086] (6)浓缩洗涤液(20×)：含有0.5％(ml/ml)Tween-20和0.05％(g/ml)叠氮钠防腐剂的0.01M磷酸盐缓冲液，pH为7.4，后经过0.22μm滤膜除菌(2瓶，50ml/瓶)。

[0087] (7)终止液：2mol/L的硫酸溶液(1瓶，12ml/瓶)。

[0088] (8)样品稀释液：含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH为7.4的PBS缓冲液，过0.22μm滤膜(2瓶，12ml/瓶)。

[0089] 根据需要，试剂盒中还可以有血清稀释板(2块，96孔/块)，用于血清样品的稀释。

[0090] 其中，包被有口蹄疫病毒抗原的96孔可拆聚苯乙烯酶联反应板的制备方法为：将实施例1制备的多肽抗原溶于pH 9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔每肽50ng抗原(其中序列表中序列1所示的多肽与序列表中序列2所示的多肽及序列表中序列3所示的多肽，三种多肽的质量比为1:1:1)，在37℃放置2～4h，再4～8℃下放置8h，使多肽抗原与酶联反应板充分结合。然后按照300μl/孔浓度加入含1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(pH＝7.4)，37℃封闭2～3h，用洗涤缓冲液(浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液)洗涤后甩干，待反应板干燥后4℃密封保存。

[0091] 实施例3、口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的符合率试验[0092] 一、口蹄疫A型结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法

[0093] 1、平衡：将保存在4℃的试剂盒取出，平衡至室温备用；液体试剂用前混匀。

[0094] 2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；

[0095] 3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。

[0096] 4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。

[0097] 5、加样：2个阴性对照孔各加100μl阴性对照，2个阳性对照孔各加100μl阳性对照；其余孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样时间跨度应尽量短。

[0098] 6、温育：震荡混匀，置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。

[0099] 7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl步骤2中得到的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗涤液。连续洗板4次后拍干。

[0100] 8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌A蛋白。

[0101] 9、温育：置37℃温箱或水浴锅中，反应30min。

[0102] 10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液。连续洗板4次后拍干。

[0103] 11、显色：每孔分别加入100μl的底物显色液(其中溶液A和溶液B以体积比为1：1的比例混合)。加盖，37℃恒温箱里反应15min；

[0104] 12、每孔分别加入100μl终止液终止反应，混匀；

[0105] 13、测定每孔的OD450值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450值)。

[0106] 检测结果的判定：

[0107] 1、阴性对照OD450平均值应该≤0.15，否则无效。

[0108] 2、阳性对照每个检测值应该在0.9～2.3之间，否则无效。

[0109] 3、临界值的计算：牛血清临界值＝0.15×阳性对照OD450值平均值

[0110] 猪血清临界值＝0.18×阳性对照OD450值平均值

[0111] 待检血清测定OD450值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450值<临值者判为阴性。

[0112] 二、乳鼠血清中和试验(MSN)方法

[0113] 目前国内常用的口蹄疫血清学检测方法之一是乳鼠中和试验(MSN)，因此用本试剂盒同乳鼠中和试验进行符合率试验。

[0114] 材料

[0115] 1.免疫血清，50头份免疫猪血清(猪口蹄疫灭活疫苗(口蹄疫O型、A型、亚洲I型三价灭活疫苗，货号ABB10601730250)免疫后28天)；50头份免疫牛血清(牛口蹄疫灭活疫苗(口蹄疫O型、A型、亚洲I型三价灭活疫苗，货号ABB10601730250)免疫后21天)，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。

[0116] 2.健康猪血清50份、健康牛血清50份，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。

[0117] 3.试验用病毒为口蹄疫AF/72病毒，毒种由兰州兽医研究所提供，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂保存和使用，将病毒经6～8日龄乳鼠传2代后，收集病毒。用3～4日龄乳鼠测定并调整其毒价至1000LD50/0.2ml，置于-20℃保存待用。

[0118] 乳鼠血清中和试验方法如下：将血清用PBS作2倍稀释，取1ml与等量100LD50/ml的AF/72系病毒液混合，于37℃孵育1小时，然后接种3日龄乳鼠(颈部皮下注射0.2ml)，每组(亦即每个待检血清)4只，同时设立病毒对照、健康对照及标准阳性血清对照组，每组3只，观察7d，记录乳鼠死亡比率并判定结果，若乳鼠4/4或3/4健活，则待检血清为阳性(R)，若乳鼠4/4或3/4死亡，则待检血清为阴性(-)；若乳鼠2/4健活或2/4死亡，则判定结果可疑(±)，需加倍重复测定，重复试验中，有1组呈阳性，则判定为阳性。

[0119] 敏感性＝判定阳性血清样本数/待测血清样本数

[0120] 三、符合率试验结果：

[0121] 利用实施例2制备的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验(MSN)分别检测100份猪血清(免疫血清50份，健康血清50份)，100份牛血清(免疫血清50份，健康血清50份)。

[0122] 口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒对猪血清的检测结果见表3。试剂盒的敏感性为98％，而乳鼠血清中和试验的敏感性为92％，在50份免疫猪血清中，两种方法检测结果一致的为47份。因此，本试剂盒和乳鼠血清中和试验的符合率为94％，因此本试剂盒具有较高的敏感性。对健康猪血清的测试两者的符合率为100％，检测结果均为阴性(见表3)。

[0123] 口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验一共检测100份猪血清，其中97份猪血清两种方法检测结果一致，3份猪血清检测结果有差异，符合率为97％。

[0124] 表3.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒及乳鼠血清中和试验法对免疫猪血清和健康猪血清的检测结果

[0125]

[0126]

[0127] 口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒对牛血清的检测结果见表4。结果表明，试剂盒的敏感性为98％，而乳鼠血清中和试验的敏感性为94％，在50份免疫牛血清中，两种方法检测结果一致的为48份，因此，本试剂盒和乳鼠血清中和试验的符合率为
96％，因此本试剂盒具有较高的敏感性。对健康牛血清的测试两者的符合率为100％，检测结果均为阴性(见表4)。

[0128] 口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒与乳鼠中和试验一共检测100份牛血清，其中98份牛血清两种方法检测结果一致，2份牛血清检测结果有差异，符合率为98％。

[0129] 表4.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒及乳鼠血清中和试验法对免疫牛血清和健康牛血清的检测结果

[0130]

[0131]

[0132]

[0133] 实施例4、口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的敏感性试验[0134] 敏感性试验是使用实施例3中的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒检测分别检测猪源和牛源血清的实验结果。猪感染血清由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供，为猪口蹄疫A型病毒感染血清。猪源免疫血清为猪口蹄疫A型病毒合成肽疫苗(合成肽疫苗的多肽序列为序列表中序列4)免疫后血清，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。牛感染血清由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供，为牛口蹄疫A型病毒感染血清。牛源疫苗免疫血清为牛口蹄疫A型病毒合成肽疫苗(合成肽疫苗的多肽序列为序列表中序列5)免疫后血清，由中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供。

[0135] 使用实施例2制备的三批口蹄疫A型病毒结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒(批次ZMAVP001、ZMAVP002、ZMAVP003)，依照实施例3中口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法分别对猪、牛口蹄疫A型病毒感染血清各200份及猪、牛口蹄疫A型病毒合成肽疫苗免疫血清各200份进行敏感性试验，实验结果见表5。

[0136] 使用实施例2所述的方法制备序列1、序列2和序列3所示的三个多肽，分别单独包被酶标板组装的A型病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒(ZMAVP1-1、ZMAVP1-2、ZMAVP1-3)，依照实施例3中口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法分别对猪、牛口蹄疫A型病毒感染血清各200份及猪、牛口蹄疫A型病毒合成肽疫苗免疫血清各200份进行敏感性试验，实验结果见表5。

[0137] ZMAVP001试剂盒对200份感染猪血清检测的敏感性为196/200×100％＝98％；对200份免疫猪血清检测的敏感性为198/200×100％＝99％。ZMAVP002试剂盒对200份感染猪血清检测的敏感性为197/200×100％＝98.5％；对200份免疫猪血清检测的敏感性为198/
200×100％＝99％。ZMAVP003试剂盒对200份感染猪血清检测的敏感性为197/200×100％＝98.5％；对200份免疫猪血清检测的敏感性为197/200×100％＝98.5％。

[0138] ZMAVP1-1试剂盒对200份感染猪血清检测的敏感性为193/200×100％＝96.5％；对200份免疫猪血清检测的敏感性为195/200×100％＝97.5％。ZMAVP1-2试剂盒对200份感染猪血清检测的敏感性为194/200×100％＝97％；对200份免疫猪血清检测的敏感性为
194/200×100％＝97％。ZMAVP1-3试剂盒对200份感染猪血清检测的敏感性为194/200×
100％＝97％；对200份免疫猪血清检测的敏感性为193/200×100％＝96.5％。

[0139] ZMAVP001试剂盒对200份感染牛血清检测的敏感性为197/200×100％＝98.5％；对200份免疫牛血清检测的敏感性为196/200×100％＝98％。ZMAVP002试剂盒对200份感染牛血清检测的敏感性为197/200×100％＝98.5％；对200份免疫牛血清检测的敏感性为
197/200×100％＝98.5％。ZMAVP003试剂盒对200份感染牛血清检测的敏感性为197/200×
100％＝98.5％；对200份免疫牛血清检测的敏感性为198/200×100％＝99％。

[0140] ZMAVP1-1试剂盒对200份感染牛血清检测的敏感性为195/200×100％＝97.5％；对200份免疫牛血清检测的敏感性为194/200×100％＝97％。ZMAVP1-2试剂盒对200份感染牛血清检测的敏感性为194/200×100％＝97％；对200份免疫牛血清检测的敏感性为193/
200×100％＝96.5％。ZMAVP1-3试剂盒对200份感染牛血清检测的敏感性为193/200×
100％＝96.5％；对200份免疫牛血清检测的敏感性为195/200×100％＝97.5％。

[0141] 表5.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒对猪、牛血清的敏感性检测结果

[0142]

[0143] 实施例5、口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的特异性试验[0144] 使用实施例4中的三批试剂盒依照实施例3中所述的口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒的使用方法对200份健康猪血清(中牧实业股份有限公司保山厂和兰州生物药厂提供)、2份猪口蹄疫亚洲Ⅰ型(Asia1)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪口蹄疫O型(O)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪瘟阳性血清(中国兽医药品监察所)、2份猪水泡病阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)、2份猪圆环阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)和2份猪蓝耳病阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)分别进行检测。

[0145] 试剂盒的特异性检测结果如下表(表6)显示。对200份健康猪血清的检测结果表明，ZMAVP001试剂盒的特异性为99.0％，ZMAVP002试剂盒的特异性为99.5％，ZMAVP003试剂盒的特异性为99.0％。对2份猪口蹄疫亚洲Ⅰ型(AsiaⅠ)阳性血清、2份猪口蹄疫O型(O)阳性血清、2份猪瘟阳性血清、2份猪水泡病阳性血清、2份猪圆环阳性血清和2份猪蓝耳病阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这12份猪阳性血清检测的特异性均为100％。

[0146] 试剂盒的特异性检测结果如下表(表6)显示。对200份健康牛血清的检测结果显示，ZMAVP001试剂盒的特异性为99.0％，ZMAVP002试剂盒的特异性为99.5％，ZMAVP003试剂盒的特异性为99.5％。对2份牛口蹄疫亚洲Ⅰ型(AsiaⅠ)阳性血清、2份牛口蹄疫O型(O)阳性血清、2份牛病毒性腹泻阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这6份牛阳性血清检测的特异性均为100％。

[0147] 表6.口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒特异性检测结果[0148]

[0149]

[0150] 使用实施例2所述的方法制备序列1、序列2和序列3所示的三个多肽，分别单独包被酶标板组装的A型病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒(ZMAVP1-1、ZMAVP1-2、ZMAVP1-3)，依照实施例3中口蹄疫A型病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒使用方法分别对
200份健康猪血清(中牧实业股份有限公司保山厂和兰州生物药厂提供)、2份猪口蹄疫亚洲Ⅰ型(Asia1)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪口蹄疫O型(O)阳性血清(中牧实业股份有限公司兰州生物药厂提供)、2份猪瘟阳性血清(中国兽医药品监察所)、2份猪水泡病阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)、2份猪圆环阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)和2份猪蓝耳病阳性血清(中牧实业股份有限公司提供)分别进行检测。

[0151] 试剂盒的特异性检测结果如下表(表7)显示。对200份健康猪血清的检测结果表明，ZMAVP1-1试剂盒的特异性为97.0％，ZMAVP1-2试剂盒的特异性为98.5％，ZMAVP1-3试剂盒的特异性为98.0％。对2份猪口蹄疫亚洲Ⅰ型(AsiaⅠ)阳性血清、2份猪口蹄疫O型(O)阳性血清、2份猪瘟阳性血清、2份猪水泡病阳性血清、2份猪圆环阳性血清和2份猪蓝耳病阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这12份猪阳性血清检测的特异性均为100％。

[0152] 试剂盒的特异性检测结果如下表(表7)显示。对200份健康牛血清的检测结果显示，ZMAVP1-1试剂盒的特异性为98.0％，ZMAVP1-2试剂盒的特异性为97.5％，ZMAVP1-3试剂盒的特异性为97.5％。对2份牛口蹄疫亚洲Ⅰ型(AsiaⅠ)阳性血清、2份牛口蹄疫O型(O)阳性血清、2份牛病毒性腹泻阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此三个试剂盒对这6份牛阳性血清检测的特异性均为100％。

[0153] 表7.单独肽特异性检测结果

[0154]

[0155]

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