大豆主栽品种的遗传转化、基因编辑及分析方法
阅读：868发布：2020-05-08
专利汇可以提供大豆主栽品种的遗传转化、基因编辑及分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 农作物 领域，尤其涉及大豆主栽品种的遗传转化、基因编辑及分析方法。首先公开了一种基因编辑转化载体，其基于CRISPR/Cas9系统，以农杆菌转化载体pCambia3301为骨架，设计提高Cas9和gRNA表达量的启动子。本发明首次实现了大豆主栽品种的快速和有效遗传转化，且开发了鉴定基因编辑效果的简单快速PCR扩增测序分析方法。通过遗传分离和分子 生物 学分析技术筛选，成功获得了生产用大豆品种不携带外源基因的基因编辑后代植株，编辑位点得到稳定遗传。，下面是大豆主栽品种的遗传转化、基因编辑及分析方法专利的具体信息内容。
1.一种基因编辑转化载体，其特征在于，基于CRISPR/Cas9系统，以农杆菌转化载体pCambia3301为骨架，设计提高Cas9和gRNA表达量的启动子，得到基因编辑转化载体。
2.根据权利要求1所述的基因编辑转化载体，其特征在于，所述基因编辑转化载体包含三个基因表达单元；所述基因表达单元从T-DNA的右边界顺序依次为GmU6-9pro:gRNA:
AtU6-26、GmEF2pro:Cas9:PsRbcSE9和CaMV35S pro:Bar:CaMV 35S。
3.根据权利要求1所述的基因编辑转化载体，其特征在于，所述gRNA针对特定的植物基因设计。
4.根据权利要求3所述的基因编辑转化载体，其特征在于，所述植物为双子叶植物；优选的，所述植物为大豆。
5.根据权利要求3所述的基因编辑转化载体，其特征在于，针对GmFad2-1A基因和GmFad2-1B基因分别设计2个gRNA，并通过tRNA序列将这2个gRNA串联起来表达，得到基因编辑转化载体KF57。
6.一种植物品种的遗传转化方法，其特征在于，将权利要求1-5任一项所述的基因编辑转化载体导入植物细胞，再筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。
7.根据权利要求6所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：受体植物进行遗传转化得到再生植株；
S2：检测再生植株的基因编辑是否成功；
S3：筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。
8.根据权利要求7所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，所述植物为大豆；优选的，所述大豆品种为垦保小粒豆1号或龙垦314。
9.根据权利要求8所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，所述S1包括：
S11：活化携带有基因编辑转化载体的农杆菌；
S12：制备大豆外植体；
S13：将农杆菌和大豆外植体共培养；
S14：诱导长出丛生芽；
S15：培养丛生芽得到无根幼苗后诱导其生根，得到大豆幼苗；
S16：将大豆幼苗进行驯化移栽得到再生植株。
10.根据权利要求7所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，在S3中，将再生植株T0的种子种植萌发后得到后代植株T1，取叶片进行检测得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。
11.根据权利要求10所述的植物品种的遗传转化方法，其特征在于，所述再生植株T0的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列如SEQ ID NO：31-41所示。
12.一种不携带外源基因的后代植株，其特征在于，通过权利要求6-10任一项所述方法制备得到。
13.根据权利要求12所述的后代植株，其特征在于，所述后代植株T1的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列如SEQ ID NO：42-55所示。
14.一种基因编辑产物的分子分析流程方法，其特征在于，采用PCR扩增结合DNA片段直接测序的分析方法，分三步进行，分别为PCR1、PCR2和PCR3；
PCR1：检测编辑载体的转化情况，阳性为转基因事件；
PCR2：扩增目标基因被编辑片段，用其中一个引物直接测序，编辑的片段会在编辑处开始出现套峰，克隆后再测序以确定编辑后的序列变化；
PCR3：其中一个引物的3‘端部分横跨野生型序列预期的Cas9切断点，以用于分析后代植株T1分离群体，阳性为野生型和杂合编辑，阴性为纯合或双等位基因编辑。
15.根据权利要求1-5任一项所述的基因编辑转化载体、权利要求6-10任一项所述的遗传转化方法、权利要求11-13所述的后代植株或权利要求14所述的基因编辑产物的分子分析流程方法在育种领域中的应用；优选的，所述育种领域为双子叶植物育种领域。
大豆主栽品种的遗传转化、基因编辑及分析方法
技术领域
背景技术
[0002] 大豆起源于中国，是人类赖以生存的主要农作物之一，是植物蛋白和食用油的重要来源，在世界及中国农业生产中占有重要位置。根据美国农业部2019年5月公布的世界农业生产分析的统计数据(World Agricultural Production，USDA WAP 5-19)，2018年全球的大豆种植面积为12460万公顷，总产36208万吨，平均单产为每公顷2.88吨，美国的种植面积为3566万公顷，其中约95％为抗除草剂等转基因品种，总产12366万吨，平均单产为每公顷3.47吨，而中国的种植面积为840万公顷，总产1590万吨，平均单产仅为每公顷1.89吨，远远低于美国及世界平均产量。
[0003] 中国作为世界第一人口大国，随着居民生活水平的不断提高和对肉类食品的需求增加，也是大豆消费的第一大国，2017年总消费已超过11000万吨，而自产仅为1530万吨。根据海关总署的统计数据，2017年中国大豆进口量最高，达9553万吨，相当于当年世界大豆总产量的26.7％，对外依存度高达87％，2018年进口多年来首次下降，仍高达8803万吨。除受可耕地面积制约、大豆种植面积难以扩大到自给自足水平外，品种综合性状差、单产低、油脂含量低、生产栽培技术落后等也是限制中国大豆生产的主要因素。美国和南美国家如巴西、阿根廷等是中国大豆进口的主要货源国，绝大部分为抗灭生性除草剂草甘膦的转基因大豆。转基因大豆种植成本低，价格低廉，外观和整齐度较好，品质优良，含油量比国产大豆高1.5％～2％，所以加工企业倾向于使用转基因大豆以提高效益和降低成本。
[0004] 转基因可以选择性的将特定功能基因用遗传转化的方法转入到目标作物中，能够准确的、有目的的对作物的农艺、品质等性状进行定向改良，从而获得具有优良性状的转基因作物。相较于常规育种，转基因技术克服了植物远缘杂交的不亲和性，例如可以将细菌等任何来源的基因转入到植物中表达，获得农业生产品种需要的特殊性状。目前广泛种植的抗草甘膦大豆就是将农杆菌突变菌株CP4的莽草酸合酶抗性突变基因EPSPS 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase用农杆菌侵染法转入大豆中表达，突变的CP4-EPSPS酶蛋白对竞争性抑制型除草剂草甘膦的亲和力降低，从而不受草甘膦的抑制性伤害而获得抗性，极大的改善了大豆田间杂草的防控，降低了种植成本。
[0005] 植物遗传转化方法有多种，大豆遗传转化常用农杆菌介导或基因枪轰击法(Homrich et al.2012,Genet Mol Biol 35(4suppl):998-1010；Verma1 et al.2014,J.Innov Biol 1:15-26；Kocsy 2007,Trans Plant J 1:129-144)。农杆菌介导的子叶节和改进的半粒法转化体系应用的最为广泛和成熟，以成熟种子为外植体，通过不定芽发生方式获得再生植株，具有取材方便、经济成本低、可靠性高、转化周期短和转化植株基因插入位点简单、遗传稳定等优点，但转化效率受到大豆基因型、农杆菌菌株感染转化能力、组织培养条件和转化后的筛选模式等因素影响，目前只有少数农艺性状较差、生产上已经淘汰品种如国外的Jack和Williams82，国内的天隆一号和东农50小粒豆等容易成功转化(Paz and Wang 2009,US patent7473822；Paz et al.2006,Plant Cell Rep 25:206-213；Li et al.2017,Front Plant Sci 8:246；Khan 2004,US patent appl 20040034889；Jia et al.2015,Int J Mol Sci 16:18522-18543；Martinell et al.2002,US patent 6384301B1；Martinell et al.2013,US patent 8592212B2；Pareddy 2014,US patent appl 20140173780)。基因枪轰击法通过以包裹DNA的金粉轰击不同外植体将外源基因导入细胞，大豆常以发育幼胚诱导胚性愈伤组织，进行悬浮培养扩增后可得到大量胚性愈伤组织颗粒用于轰击转化，通过体细胞发生途径获得再生植株，转化效率较高，但转化植株基因插入位点复杂，且也受基因型的限制，仅成功用于少数易转化的老旧品种(McCabe1988，Biotechnol 6:923-926；Christou et al.1989,Proc Natl Acad Sci USA 86:7500-7504；
Finer and McMullen 1991,Vitro Cell Dev Biol-Plant 27:175–182；Stewart et al.1996,Plant Physiol 112:121–129)。因为现有的综合性状较好的生产栽培品种往往难以直接用上述方法转化，待转化基因必须先引入到可遗传转化的中间材料中，然后通过多年的回交转育后转移到生产品种中，中间步骤可能引起部分优良性状的改变或丢失，这个漫长且不确定过程严重制约了转基因技术的直接生产应用，亟需开发优良生产品种的直接转化技术。
Finer and McMullen 1991,Vitro Cell Dev Biol-Plant 27:175–182；Stewart et al.1996,Plant Physiol 112:121–129)。因为现有的综合性状较好的生产栽培品种往往难以直接用上述方法转化，待转化基因必须先引入到可遗传转化的中间材料中，然后通过多年的回交转育后转移到生产品种中，中间步骤可能引起部分优良性状的改变或丢失，这个漫长且不确定过程严重制约了转基因技术的直接生产应用，亟需开发优良生产品种的直接转化技术。
[0006] 转基因作物特别是抗虫、抗除草剂玉米、大豆品种在美州和世界其它国家的广泛应用极大地促进了当地农业现代化和规模化种植，提高了产量，降低了成本，减少了杀虫剂和除草剂的使用，取得了巨大的经济价值和社会效益，中国抗虫棉花的广泛种植也同样取得了巨大成功。中国虽然大量进口转基因大豆和玉米用于消费，但尚不容许生产种植转基因大豆或玉米等粮食作物，迫切需要研发相关的转基因技术和创制性能优良的转基因品种，保障国家农业生产的种业战略安全。最近几年来迅速发展的基因编辑技术可以选择基因组中的特定基因进行修改，获得预期性状改良，且最终产品可不含任何外源DNA，本质上为非转基因，与常规育种产品等同，可避免昂贵的转基因产品监管审批费用(Jinek et al.2012,Science 337:816–821；Ma et al.2016,Mol Plant 9:961–974；Chen et al.2019,Ann Rev Plant Biol 70:667–97)。为将转基因和基因编辑技术有效地应用于生产育种，需要开发大豆优良主栽品种的直接遗传转化，本发明针对垦丰种业拥有自主知识产权的多个优良主载品种进行转化筛选和方法优化，研究出了几个品种包括垦保小粒豆1号和龙垦314的农杆菌介导的有效转化方法，获得了转基因再生植株，并成功实现了垦保小粒豆1号多个基因和位点的高效编辑。
[0007] 垦保小粒豆1号为亚有限结荚习性，植株高80厘米左右，具有抗倒伏，抗灰斑病，节间短、结荚密，不炸荚、三、四粒荚多，顶荚丰富等特性。百粒重约9克，蛋白质含量为41.71％，脂肪含量为20.45％。2013年生产试验平均公顷产量2512.7公斤。生育期在115天左右，需要大于10℃的活动积温2350℃左右，适宜黑龙江省第二积温带种植。龙垦314为无限结荚习性，植株高90厘米左右，无分枝，紫花，尖叶，灰色茸毛，荚弯形，成熟时呈褐色。种子圆形，种皮黄色，种脐无色，有光泽，百粒重约17克。三年平均品质分析蛋白质含量
38.85％，脂肪含量21.93％，为高油品种。2018年生产试验平均公顷产量2526.4公斤。在适应区出苗至成熟生育日数105天左右，需大于10℃活动积温2050℃左右，适宜黑龙江省第五积温带种植。
38.85％，脂肪含量21.93％，为高油品种。2018年生产试验平均公顷产量2526.4公斤。在适应区出苗至成熟生育日数105天左右，需大于10℃活动积温2050℃左右，适宜黑龙江省第五积温带种植。
[0008] 大豆油为中国居民主要食用油之一，油脂的主要成分包括棕榈酸(16:0)11％、硬脂酸(18:0)4％、油酸(18:1)23％、亚油酸(18:2)54％、和亚麻酸(18:3)8％。棕榈酸和硬脂酸是饱和脂肪酸，饱和脂肪酸含量高不利于人体健康，容易引发高血压等心脑血管疾病，油酸是单不饱和脂肪酸，其性质稳定并有助于预防心脑血管疾病，亚油酸和亚麻酸是多不饱和脂肪酸，其含量高会降低油脂的贮存稳定性，易因氧化导致酸败变质，产生不良气味。为提高大豆油的稳定性，食品工业通常用氢化处理将多不饱和脂肪酸还原，但过程中会产生大量人体不能吸收代谢的反式脂肪酸，对健康极为有害，因此这种处理方法正逐渐被淘汰。与其它油料作物如油菜、花生、芝麻和玉米等相比，大豆的油酸含量低而多不饱和脂肪酸含量过高，因此大豆油脂性状改良的主要方向是提高含油量、增加油酸含量、和降低饱和及多不饱和脂肪酸。油脂合成的生物化学途径研究的较为详细，相关的主要酶基因包括KasII、FatA、FatB、Δ9desaturase、Δ6desaturase Fad2、Fad3和Dgat等，多项研究实验已证实抑制Fad2和FatB基因表达可分别有效降低亚油酸和亚麻酸含量，减少饱和脂肪酸的积累，而农艺性状、含油量和蛋白质含量却没有改变，增强Dgat基因表达可促进脂肪酸积累，增加总含油量(Li et al.2010,Plant Physiol 154:622–631；Pham et al 2010,BMC Plant Biol
10:195；Clemente and Cahoon 2009,Plant Physiol 151:1030-1040)。杜邦先锋公司利用转基因技术通过RNA干扰抑制Fad2-1等基因，培育出高油酸大豆油Plenish品种DP-305423-
1等并已商业化推广，2010年获准在美国生产种植转基因Plenish高油酸大豆品种，油酸含量高于75％，生产健康的食用大豆油，并于2014年获得我国农业部批准进入中国消费市场。
孟山都公司通过抑制Fad2-1和FatB的表达得到转基因品种MON87705，生产高油酸、低饱和脂肪酸的Vistive Gold大豆油商业化推广，2017年也经我国农业部批准作为加工原料进入中国市场。
10:195；Clemente and Cahoon 2009,Plant Physiol 151:1030-1040)。杜邦先锋公司利用转基因技术通过RNA干扰抑制Fad2-1等基因，培育出高油酸大豆油Plenish品种DP-305423-
1等并已商业化推广，2010年获准在美国生产种植转基因Plenish高油酸大豆品种，油酸含量高于75％，生产健康的食用大豆油，并于2014年获得我国农业部批准进入中国消费市场。
孟山都公司通过抑制Fad2-1和FatB的表达得到转基因品种MON87705，生产高油酸、低饱和脂肪酸的Vistive Gold大豆油商业化推广，2017年也经我国农业部批准作为加工原料进入中国市场。
[0009] 由于转基因大豆品质好，生产成本低，中国的大豆消费市场已逐渐被国外转基因大豆占领。虽然国家相关部门投入了大量科研基金组织科研院所进行转基因专项研究，但由于基础薄弱等多种原因，尚未有任何转基因大豆品种进入商业化生产阶段。加快转基因技术在大豆遗传育种中的应用对我国大豆产业具有重要意义，研发大豆生产品种的遗传转化技术是转基因技术应用的必备基础。近年来快速发展的基因编辑技术利用特异性核酸内切酶选择性切断细胞中的特定基因，通过细胞固有的DNA重组修复机制，在修复切断点的同时引入插入或缺失突变，从而使基因失活，或定点插入预先设计好的DNA片段，将目标基因修改，获得期待的性状改良。基于拟转录激活效应因子核酸酶TALENS的基因编辑技术已经成功用于改良大豆脂肪酸组成，通过抑制Fad2-1A and Fad2-1B并经后代遗传分离获得了不携带任何转基因成分的高油酸大豆基因编辑品种(Haun et al.2014,Plant Biotechnol J 12:934-940)。相对于TALENS基因编辑技术，基于CRISPR/Cas9核酸酶的基因编辑实验设计简单易行，基因编辑效率高，可以同时对多个基因位点进行编辑，结合多重gRNA技术，是基因编辑技术育种的优选方法(Li et al.2015,Plant Physiol 169:960–970；Xie et al.2015,Proc Natl Acad Sci USA 112:3570-3575)。但受制于大豆优良品种的转化困难，尚未见到直接基因编辑优良生产用大豆品种的成功报道。
发明内容
[0010] 本发明的目的在于公开一种大豆品种的遗传转化方法，且成功的获得了不携带外源基因的后代大豆植株，编辑位点得到稳定化遗传。
[0011] 本发明主要涉及大豆生产用品种的遗传转化和基因编辑，涵盖从基因克隆和载体优化到转化植株后代基因编辑确认的完整过程，所用技术方案主要步骤包括基因编辑转化载体的构建，大豆生产用品种的遗传转化，转化事件的分子生物学分析和基因编辑确认，基因编辑植株后代的遗传分离鉴定和筛选，最终获得不携带任何外源基因(即非转基因)的基因编辑后代植株，重点创新突破是大豆生产用品种的遗传转化、多基因同步编辑、和简单可靠的基因编辑鉴定分析方法。
[0012] 具体的，本发明的技术方案如下：
[0013] 本发明第一个方面公开了一种基因编辑转化载体，其基于CRISPR/Cas9系统，以农杆菌转化载体pCambia3301为骨架，设计提高Cas9和gRNA表达量的启动子，得到基因编辑转化载体。
[0014] 优选的，所述基因编辑转化载体包含三个基因表达单元；所述基因表达单元从T-DNA的右边界顺序依次为GmU6-9pro:gRNA:AtU6-26、GmEF2pro:Cas9:PsRbcSE9和CaMV35S pro:Bar:CaMV 35S。三个表达单元的终止子分别来源于拟南芥的U6-26，豌豆二磷酸核酮糖羧化酶RuBisCO小亚基，和花椰菜病毒35S基因。
[0015] 优选的，所述gRNA针对特定的植物基因设计。
[0016] 更优选的，所述植物为双子叶植物；较佳的，所述植物为大豆。
[0017] 更优选的，针对GmFad2-1A基因和GmFad2-1B基因分别设计2个gRNA，并通过tRNA序列将这2个gRNA串联起来表达，得到基因编辑转化载体KF57。
[0018] 本发明第二个方面公开了一种植物品种的遗传转化方法，将上述的基因编辑转化载体导入植物细胞，再筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。
[0019] 优选的，包括以下步骤：
[0020] S1：受体植物进行遗传转化得到再生植株；
[0021] S2：检测再生植株的基因编辑是否成功；
[0022] S3：筛选得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。
[0023] 应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
[0024] 优选的，所述植物为大豆；较佳的，所述大豆品种为垦保小粒豆1号或龙垦314。
[0025] 更优选的，所述S1包括：
[0026] S11：活化携带有基因编辑转化载体的农杆菌；
[0027] S12：制备大豆外植体；
[0028] S13：将农杆菌和大豆外植体共培养；
[0029] S14：诱导长出丛生芽；
[0030] S15：培养丛生芽得到无根幼苗后诱导其生根，得到大豆幼苗；
[0031] S16：将大豆幼苗进行驯化移栽得到再生植株。
[0032] 应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S11之前、步骤S11和S12之间、步骤S12和S13之间、步骤S13和S14之间、步骤S14和S15之间、步骤S15和S16之间、步骤S16之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
[0033] 优选的，所述再生植株T0的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列如SEQ ID NO：31-41所示。
[0034] 应当理解，再生植株T0的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列并不限于如SEQ ID NO：31-41所示的序列，与所述SEQ ID NO:31-41所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且功能性相同的核苷酸序列均在本发明的保护范围之内。
[0035] 优选的，在S3中，将再生植株T0的种子种植萌发后得到后代植株T1，取叶片进行检测得到可遗传、非转基因且稳定编辑的后代植株。
[0036] 本发明第三个方面公开了一种不携带外源基因的后代植株，通过上述方法制备得到。
[0037] 优选的，所述后代植株T1的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列如SEQ ID NO：42-55所示。
[0038] 应当理解，后代植株T1的基因组中针对GmFad2-1A基因或GmFad2-1B基因编辑的核苷酸序列并不限于如SEQ ID NO：42-55所示的序列，与所述SEQ ID NO：42-55所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且功能性相同的核苷酸序列均在本发明的保护范围之内。
[0039] 本发明第四个方面公开了一种基因编辑产物的分子分析流程方法，采用PCR扩增结合DNA片段直接测序的分析方法，分三步进行，分别为PCR1、PCR2和PCR3；
[0040] PCR1：检测编辑载体的转化情况，阳性为转基因事件；
[0041] PCR2：扩增目标基因被编辑片段，用其中一个引物直接测序，编辑的片段会在编辑处开始出现套峰，克隆后再测序以确定编辑后的序列变化；
[0042] PCR3：其中一个引物的3‘端部分横跨野生型序列预期的Cas9切断点，以用于分析后代植株T1分离群体，阳性为野生型和杂合编辑，阴性为纯合或双等位基因编辑。
[0043] 本发明第五个方面公开了上述的基因编辑转化载体、上述的遗传转化方法、上述后代植株或上述的基因编辑产物的分子分析流程方法在育种领域中的应用；优选的，所述育种领域为双子叶植物育种领域。
[0044] 本发明第六个方面公开了一种食品，将上述的后代植株得到的大豆进行加工得到。所述食品包括大豆油。所述大豆油的油酸含量比常规大豆油的油酸含量高。
[0045] 在本发明的一些优选实施例中，包括：
[0046] 1)基因编辑转化载体的构建：
[0047] 虽然大豆的遗传转化困难，效率低，但CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率在多种作物中可高达90％，从少数转化体中就可能得到编辑事件，因此不需要获得大量转化事件，即使难以转化的生产品种也有望实现基因编辑。通过使用大豆专用启动子等，优化基因编辑农杆菌转化载体pCambia3301(www.addgene.org)的设计和增强Cas9和gRNA表达，有助于在有限的转化大豆植株中实现基因编辑(Li et al.2015,Plant Physiol 169:960–970；Xing et al.2014,BMC Plant Biol 14:327)。本发明为了分别提高Cas9和gRNA在大豆中的表达，通过对大豆基因表达水平分析，鉴定并克隆了高效表达的大豆转译延伸因子基因GmEF2组成型启动子，用于高效表达Cas9基因；根据snRNA的序列高度保守性，利用拟南芥的U6snRNA序列搜索Phytozome12大豆基因组(phytozome.jgi.doe.gov)发现了至少18个U6snRNA同源序列，分别位于不同的染色体上，随后用PCR扩增方法克隆了第9号染色体上的GmU6-9启动子用于gRNA的高效表达，如图1所示。其中，A图中基因编辑载体由pCambia3301农杆菌转化双元载体改造而成，包含三个基因表达单元，从T-DNA的右边界顺序为大豆U6启动子表达gRNA，GmU6-9pro：gRNA：AtU6-26。大豆转译延伸因子启动子表达Cas9，GmEF2pro：Cas9：PsRbcSE9，花椰菜病毒35S启动子表达草胺膦抗性基因Bar，CaMV 35S pro：Bar：CaMV 35S，三个表达单元的终止子分别来源于拟南芥的U6-26，豌豆二磷酸核酮糖羧化酶RuBisCO小亚基，和花椰菜病毒35S基因。B图为大豆脂肪酸脱氢酶基因编辑转化载体KF57的结构图，含有GmFad2-G1和GmFad2-G2两个gRNA，可以同时编辑GmFad2-1A和GmFad2-1B基因的各两个位点。
[0048] 2)农杆菌介导的大豆遗传转化：
[0049] 农杆菌介导的大豆遗传转化通过不定芽发生方式获得再生植株，所用外植体为成熟种子，容易获得保存；转化过程简单，不需要昂贵复杂的实验设备，容易实施；转化周期短，从外植体制备到抗性再生植株驯化移栽仅需约3-4个月。使用的基本培养基配方列于表1，表1如下所示：
[0050] 表1：大豆农杆菌稳定遗传转化实验使用的基本培养基
[0051]
[0052]
[0053] 转化步骤和再生植株分析鉴定流程如图2所示，主要步骤的操作如下所述：
[0054] (1)农杆菌的活化：从-80℃低温冰箱中取出携带目标基因载体的农杆菌甘油保存管，取少量农杆菌划线接种于含相应抗生素的固体YEP培养基平板上，28℃暗培养2-3天。挑取单菌落接种培养过夜，对菌液进行载体特异性PCR检测，确认菌株携带目标基因载体。吸取阳性菌液，以1:100的接种量进行二次活化，将菌液加入到含有相应抗生素的100毫升液体YEP培养基中，28℃恒温摇床，220rpm(转/分)震荡培养约14小时。当菌液浓度达到OD600＝0.6时，转入离心管，以4000rpm离心10分钟，去除上清液，将沉淀农杆菌用约10倍体积的共培养液体培养基重悬浮并稀释到OD600＝0.5，用于外植体侵染转化。
[0055] (2)大豆外植体的制备：挑选健康饱满、干净无损伤、新近收获的大豆成熟种子约200-600粒，装在培养皿中后置于真空干燥器中。干燥器中放置一250ml烧杯，其中加96毫升浓度为10％的次氯酸钠，然后逐滴加入4毫升浓盐酸混合反应产生氯气，隔夜密闭消毒约16小时。取出培养皿并加入高温灭菌的去离子水，隔夜浸泡种子约16小时使其吸涨膨大。在超净工作台中逐粒去掉种皮，用手术刀沿下胚轴将大豆种子一分为二，切掉胚根，去除顶芽和侧芽，在子叶节胚轴处轻轻划3-5刀制造浅伤口，即为制备好的外植体待侵染。
[0056] (3)外植体的农杆菌浸染和共培养：将上述制备好的大豆外植体浸泡在重悬的农杆菌菌液中30分钟后，移出到铺有无菌滤纸的培养皿中，吸除外植体表面的菌液，然后将浸染好的外植体逐粒挑出，创伤面朝下摆放在铺有无菌滤纸的共培养基中，在25℃温室暗中共培养3至5天。
[0057] (4)丛生芽的诱导：收集共培养后的外植体，切除伸长的胚根，但保留基部约3-4毫米，检查是否有未切净的顶芽、侧芽并切除。将切好的外植体转入三角瓶中，用无菌水冲洗三次，无菌滤纸吸干表面残留的液体，将其子叶平面朝上、侵染切口向下并与培养基表面形成约45度角插入到芽诱导培养基中约3毫米，25℃培养室中18：6小时光周期约140μmoles/m2/s荧光灯下，培养3天后转入含3-30mg/L草胺膦的丛生芽诱导培养基中继续培养2周。因不同大豆品种对筛选剂的敏感性差异很大，芽诱导培养基中需要测试添加不同浓度的筛选剂，合适浓度的筛选剂抑制非转基因芽发生的同时允许抗性芽生长。
[0058] (5)丛生芽的筛选：2周后继代一次，转移生长膨大的外植体到新鲜的芽诱导培养基，继代时切除发源于未切除干净侧芽的真芽、真叶等，将伸长的胚轴切短，去除下胚轴褐化死亡的外植体，继续培养两周，直到外植体的侵染处有大量丛生不定芽发生。
[0059] (6)丛生芽的伸长：挑选耐受筛选，发育健全，长势旺盛的丛生芽，切除外围老旧组织，转入含有同等筛选压力的芽伸长培养基的培养瓶中18：6小时光照培养，每2周用同样的芽伸长培养基继代一次，培养4-8周后部分芽会伸长为大于3厘米、具2-3片叶的无根幼苗。
[0060] (7)诱导抗性芽生根：当幼芽伸长到约3厘米高，发育出2或3片叶时，将芽苗从底部与基部组织切离，插入生根培养基中约5毫米，18：6小时光照培养2周，直到含有至少2条根的根系形成。
[0061] (8)抗性再生植株驯化移栽：当幼苗根系长为3-4厘米且较健壮时，打开培养瓶封口膜并加入少量蒸馏水，炼苗24小时后，小心用镊子将植株夹出，用清水冲洗植株根部附着的培养基，移栽至含蛭石营养土的苗盘中，人工气候室内培养，加盖保持湿度约1周直到有新叶长出后去除。用浓度为0.1％的草胺膦Basta除草剂(西安罗森伯科技有限公司，货号RZ0160)涂于再生植株的叶片表面半边，观察叶片反应情况。如果植株叶片在涂抹除草剂4-6天逐渐发黄甚至萎蔫死亡，则为非转基因植株，否则初步判断为阳性植株。随后取阳性植株叶片研磨提取后用Envirologix公司的Bar试纸条(Quickstix Kit for Liberty Link(bar)Cotton Leaf&Seed)再次检验确认为阳性后，移栽大盆生长成熟。
[0062] 3)再生植株的转基因检测和基因编辑鉴定：
[0063] 转化实验获得的抗性再生植株需要用分子生物学方法检测，确认遗传转化是否成功，即外源基因是否稳定整合到细胞的基因组中。常用的PCR扩增检测方法简单又可靠，根据转化载体DNA序列设计载体特异性的一对或多对DNA引物，例如图3中所示的PCR1为基因编辑转化载体中Cas9基因特异性检测。PCR1检测编辑载体的转化情况，阳性为转基因事件，取样再生植株叶片，提取少量DNA进行PCR1扩增，能获得特异性扩增片段的植株则为转化阳性。如果转化的是基因编辑载体，则可进一步检测目标基因的编辑效果。
[0064] 目标基因编辑情况常用PCR扩增结合DNA二代测序，特异性荧光定量PCR，PCR结合Surveyor酶切，PCR结合T7核酸内切酶I酶切等方法进行检测，这些方法各有费用高，效率低，或结果可靠性差等缺陷。本发明设计并实施了PCR扩增结合DNA片段直接测序的快速分析方法，效率高，费用低，简单可靠。PCR扩增测序方法根据目标基因DNA序列和预期的Cas9切断点位置，设计PCR2引物覆盖切断位点上、下游各约300bp长度(图3)，从再生植株叶片或其它组织来源的DNA扩增约400-800bp的目标基因片段，纯化后直接用同样的上游或下游引物测序。如果再生植株的DNA片段序列与野生型序列没有差异，则没有基因编辑；如果测得的DNA序列在预期的Cas9切断位点附近出现套峰，则说明所测序的PCR片段为混合模板，再生植株应为杂合编辑；如果再生植株DNA与野生型有确定的序列差异，则为纯合基因编辑。上述杂合编辑植株目标基因的PCR片段可以进一步用PCR TOPO克隆试剂盒克隆后，挑选至少3个克隆，用pCR2.1载体特异的M13F或M13F引物测序，确认目标基因序列的具体编辑变化。
[0065] 4)基因编辑植株后代的遗传分离和鉴定：
[0066] 基因编辑育种的突出优点是可以预先选定目标基因进行编辑，并且由于目标基因不会与暂时引入细胞的编辑工具Cas9-gRNA连锁，通过后代的自然遗传分离就可获得不携带任何外源基因的基因编辑后代，为非转基因的内源基因特定突变，与传统的突变育种没有区别，是更加精准的定向突变育种。大豆通过自花授粉进行繁殖，遗传转化再生的T0植株自然结实产生的T1种子就已经完成遗传分离，如果T0植株的单个目标基因位点被编辑，其T1代种子会按照孟德尔遗传分离为纯合编辑、杂合编辑、和非编辑的野生型三种后代。
[0067] 本发明设计并验证了PCR扩增快速鉴定非转基因纯合编辑后代的方法，效率高，费用低，简单可靠。收获T1种子适时播种萌发，由于涉及到目标基因和插入基因组的转化载体即Cas9编辑工具两个位点的重组分离，需要分析至少16株T1植株。取样植株叶片，提取DNA进行三次PCR扩增分析(图3)。PCR1用转化载体特异性的一对DNA引物扩增，能获得PCR1特异性扩增片段的植株仍然携带转化载体，为转基因T1植株，否则为不携带转化载体的非转基因分离T1后代。PCR3使用的第一个引物的末端必须跨越并终止于Cas9切断点对面1-3bp，第二个引物位于Cas9切断点的上、或下游约300bp，如果目标基因为纯合编辑，两个等位基因的Cas9切断点处发生DNA缺失或插入，不能和第一个引物配对，不能获得PCR3扩增，样品为纯合编辑T1后代；如果目标基因为杂合编辑或未编辑，至少一个等位基因序列在Cas9切断点处未发生变化，仍为野生型，PCR3可获得扩增，样品为杂合或未编辑T1后代。PCR2使用位于Cas9切断点上、下游各约300bp的一对引物，扩增上述非转基因纯合编辑后代，获得的PCR扩增片段直接测序，确认目标基因被编辑后的DNA序列。
[0068] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
[0069] 本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
[0070] (1)通过系统测试外植体处理、农杆菌感染、抗性筛选等条件找出与待转化受体大豆品种相匹配的转化和组培方法，首次实现了几个主栽品种包括垦保小粒豆1号和龙垦314的快速、有效遗传转化。
[0071] (2)通过优化基因编辑载体设计，分别使用高效Cas9和gRNA启动子等，提高基因编辑效率，首次实现生产用大豆品种垦保小粒豆1号的基因编辑，得到优良的生产用大豆品种。
[0072] (3)通过使用多重gRNA和利用同源基因的序列相似性，成功同步编辑了垦保小粒豆1号两个Fad2基因Fad2-1A和Fad2-1B各两个位点，实现了生产用大豆品种多基因位点的同步编辑。
[0073] (4)通过遗传分离和分子生物学分析技术筛选，成功获得了生产用大豆品种不携带外源基因的基因编辑后代植株，编辑位点得到稳定遗传，本质上为非转基因，与常规育种产品等同，可避免昂贵的转基因产品监管审批费用。
[0075] 图1为本发明中基因编辑转化载体示意图(A图：基因编辑载体由pCambia3301农杆菌转化双元载体改造而成，包含三个基因表达单元，从T-DNA的右边界顺序为大豆U6启动子表达gRNA，GmU6-9pro：gRNA：AtU6-26,大豆转译延伸因子启动子表达Cas9，GmEF2pro：Cas9：PsRbcSE9，花椰菜病毒35S启动子表达草胺膦抗性基因Bar，CaMV 35S pro：Bar：CaMV 35S，三个表达单元的终止子分别来源于拟南芥的U6-26，豌豆二磷酸核酮糖羧化酶RuBisCO小亚基，和花椰菜病毒35S基因；B图：大豆脂肪酸脱氢酶基因编辑转化载体KF57的结构图，含有GmFad2-G1和GmFad2-G2两个gRNA，可以同时编辑GmFad2-1A和GmFad2-1B基因的各两个位点)；
[0076] 图2为本发明中大豆主栽品种遗传转化和基因编辑流程图；
[0077] 图3为本发明中基因编辑效果PCR扩增和测序分析方法原理图；
[0078] 图4为本发明农杆菌转化植株再生和鉴定图(A图：垦保小粒豆1号丛生芽的诱导；B图：垦保小粒豆1号丛生芽的伸长；C图：再生植株叶片提取液Bar试纸条转基因检测；下面的紫带为指示带，上面的为转基因阳性带，样品1-7为垦保小粒豆1号，8-9为龙垦314阳性转化植株)；
[0079] 图5为本发明KF57转化的垦保小粒豆1号T0代再生植株的PCR检测电泳图(A图：引物Cas9-F1/Cas9-R1扩增KF57载体Cas9基因的540bp片段；B图：引物KF26-F4/KF26-R3扩增KF57载体骨架左侧470bp片段；C图：引物KF26-F12/RB-R扩增KF57载体骨架右侧331bp片段；DNA片段标记从大到小为2000，1000，750，500，250和100bp)；
[0080] 图6为本发明KF57转化的垦保小粒豆1号T0代再生植株目标基因编辑片段的PCR扩增图(A图：引物GmFad2A-F1/GmFad2A-R1扩增目标基因GmFad2-1A编辑区域817bp片段；B图：引物GmFad2BF1/GmFad2B-R1扩增目标基因GmFad2-1B编辑区域819bp片段；DNA片段标记从大到小为2000，1000，750，500，250和100bp)；
[0081] 图7为本发明垦保小粒豆1号转化KF57再生T0代植株的GmFad2-1A基因编辑图(A图：GmFad2-1A基因编辑区域的PCR扩增片段，显示两个gRNA GmFad2-G1和GmFad2-G2识别序列的相对位置和相邻DNA序列；B图：Cas9阳性再生T0代植株的GmFad2-1A基因序列编辑状况，每个植株的GmFad2-1A基因PCR片段共测序a,b,c三个克隆，但仅列出独特的编辑序列；gRNA识别序列为下标线黑体，“-”代表缺失序列，“/”代表未显示序列，插入序列为黑体或显示在插入位点“^”下方)；
[0082] 图8为本发明垦保小粒豆1号转化KF57再生T0代植株的GmFad2-1B基因编辑图(A图：GmFad2-1B基因编辑区域的PCR扩增片段，显示两个gRNA GmFad2-G1和GmFad2-G2识别序列的相对位置和相邻DNA序列；B图：Cas9阳性再生T0代植株的GmFad2-1B基因序列编辑状况，每个植株的GmFad2-1B基因PCR片段共测序a，b，c三个克隆，但仅列出独特的编辑序列；gRNA识别序列为下标线黑体，“-”代表缺失序列，“/”代表未显示序列，插入序列为黑体或显示在插入位点“^”下方)；
[0083] 图9为本发明KF57转化的垦保小粒豆1号T1代分离植株的PCR检测电泳图(A图：引物GmU6-9F1/GmU6-9R1扩增大豆GmU6-9内参基因启动子，片段为550bp；B图：引物Cas9-F1/Cas9-R1扩增KF57载体Cas9基因的540bp片段。DNA片段标记从大到小为2000，1000，750，500，250和100bp)；
[0084] 图10为本发明垦保小粒豆1号转化KF57的T1后代植株的GmFad2-1A基因编辑图(A图：GmFad2-1A基因编辑区域的PCR扩增片段，显示两个gRNA GmFad2-G1和GmFad2-G2识别序列的相对位置和相邻DNA序列；B图：编辑植株T1后代的GmFad2-1A基因序列编辑状况，每个植株的GmFad2-1A基因PCR片段共测序a，b，c三个克隆，但仅列出独特的编辑序列；gRNA识别序列为下标线黑体，“-”代表缺失序列，“/”代表未显示序列，插入序列为黑体或显示在插入位点“^”下方；黑体植株编号表明该植株为纯合编辑，所示序列为PCR片段直接测序)；
[0085] 图11垦保小粒豆1号转化KF57的T1后代植株的GmFad2-1B基因编辑图(A图：GmFad2-1B基因编辑区域的PCR扩增片段，显示两个gRNA GmFad2-G1和GmFad2-G2识别序列的相对位置和相邻DNA序列；B图：编辑植株T1后代的GmFad2-1B基因序列编辑状况，每个植株的GmFad2-1B基因PCR片段共测序a，b，c三个克隆，但仅列出独特的编辑序列；gRNA识别序列为下标线黑体，“-”代表缺失序列，“/”代表未显示序列，插入序列为黑体或显示在插入位点“^”下方；黑体植株编号表明该植株为纯合编辑，所示序列为PCR片段直接测序)。
具体实施方式
[0086] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0088] 基因编辑育种的突出优点是可以预先选定目标基因进行编辑，技术原理是利用特异性核酸内切酶将目标基因在设计的位点切断，通过细胞自身的DNA损伤修复系统，将断裂的DNA以非同源末端链接(NHEJ)或同源依赖重组(HDR)两种主要方式修复。NHEJ方式效率高，占主导地位，但过程不完美，会在修复位点引起短小的缺失或插入，导致基因失活；HDR方式效率低但可以将模板DNA精准地插入到修复位点，适用于外源基因的定点插入。基因编辑的具体实施包括：1)遗传转化载体构建，将特异性核酸内切酶等分子工具构建到转化载体中；2)受体植物的遗传转化，将上述分子工具置于细胞中发挥作用，进行基因编辑并获得再生植株；3)转化再生植株的分子生物学分析，检测目标基因编辑位点的状态，确认基因编辑是否成功；4)基因编辑植株后代的分子生物学分析，确认目标基因的编辑状态是否稳定遗传到后代，并挑选遗传分离产生的、不携带任何外源DNA的非转基因编辑后代。
[0089] 实施例1
[0090] 本实施例公开了基因编辑转化载体KF57的构建，具体包括以下步骤：
[0091] (1)克隆大豆转译延伸因子基因GmEF2启动子：用于基因编辑的农杆菌转化载体以pCambia3301骨架为基础，使用真核细胞编码优化的Streptococcus pyogenes(化脓性链球菌)Cas9核酸内切酶和单导引RNA(sgRNA)的同载体表达来实现目标基因位点的定点切断，利用抗草铵膦除草剂(Glufosinate，phosphinothricin)的Barnase基因表达筛选转化植株。美国能源部收集的大豆Williams82基因组Glycine max Wm82.a2.v1(phytozome.jgi.doe.gov)含有多个高水平组成型表达的转译延伸因子基因包括Glyma.05G089000.1，其启动子适合用于Cas9基因的高水平表达。为提高基因编辑效率，根据大豆基因组的DNA序列设计引物GmEF2-pF2和GmEF2-pR2(SEQ ID NO：2，3)，用PCR扩增方法克隆了大豆转译延伸因子基因Glyma.05G089000.1的启动子区域GmEF2pro(SEQ ID NO：
1)，用于Cas9基因在大豆中的高效表达。
1)，用于Cas9基因在大豆中的高效表达。
[0092] (2)克隆大豆U6细胞核小RNA基因GmU6-9启动子：细胞核小RNA(snRNA)的III型RNA多聚酶可有效表达Cas9导引gRNA小分子,不同物种的U6细胞核小RNA基因高度保守，用拟南芥的U6细胞核小RNA基因序列AT3G13857搜索大豆基因组，发现了约18个大豆U6snRNA基因，根据拟南芥U6snRNA基因启动子的序列特征(Waibel and Filipowicz 1990,Nucleic Acids Res 18:3451-3458)，鉴定了多个大豆U6snRNA基因的启动子区域，根据大豆基因组的DNA序列设计引物GmU6-9F1和GmU6-9R1(SEQ ID NO：5，6)，克隆了位于第九染色体的一个snRNA基因的启动子GmU6-9用于gRNA基因在大豆中的高效表达(SEQ ID NO：4，7)，同一个启动子可以同时表达多个用tRNA骨架间隔的gRNA基因(SEQ ID NO：8)，构建的KF49载体保留pCambia3301农杆菌转化双元载体骨架，包含三个基因表达单元，从T-DNA的右边界顺序为GmU6-9pro：gRNA：AtU6-26，GmEF2pro：Cas9：PsRbcS E9和CaMV 35S pro：Bar：CaMV 35S(SEQ ID NO：9)，其中的gRNA可以通过简单克隆修改为目标基因特异的gRNA，直接构建成用于编辑该目标基因的双元转化载体。
[0093] (3)基因编辑敲除大豆脂肪酸脱氢酶2GmFad2-1A和GmFad2-1B基因：大豆的单键不饱和脂肪酸油酸(18：1)的含量较低，脂肪酸脱氢酶2(Fad2)是催化油酸(18：1)转化为多键不饱和脂肪酸亚油酸(18：2)和亚麻酸(18：3)的关键酶，降低或阻断脂肪酸脱氢酶2的活性可有效抑制油酸向亚油酸的转化，显著提高大豆油酸含量。美国能源部收集的大豆Williams82基因组Glycine max Wm82.a2.v1(phytozome.jgi.doe.gov)含有六个脂肪酸脱氢酶2同源基因，分别位于不同染色体上，包括Glyma.03G144500.1，Glyma.09G111900.1，Glyma.10G278000.1(GmFad2-1A)，Glyma.15G195200.1(partial sequence)，Glyma.19G147400.1，和Glyma.20G111000.1(GmFad2-1B)(SEQ ID NO：10，11，12，13，14，15)，其中Glyma.10G278000.1(GmFad2-1A)和Glyma.20G111000.1(GmFad2-1B)两个基因主要在发育的种子中表达，是控制大豆种子油酸和亚油酸比例的关键基因，通过CRISPR基因编辑同时敲除大豆高油品种的GmFad2-1A和GmFad2-1B两个基因可快速获得生产健康及耐储存高油酸大豆油的基因编辑改良品种。
[0094] 由于GmFad2-1A和GmFad2-1B两个基因序列高度相似，可以设计gRNA同时识别两个基因。但在分析编辑效果时，又可以根据两个基因的序列差异，分别设计GmFad2-1A特异和GmFad2-1B特异的DNA引物，分别PCR扩增两个基因的编辑片段进行测序分析。为提高基因编辑成功率，设计了两个gRNA，GmFad2-G1和GmFad2-G2，(SEQ ID NO：16，17)并将两个gRNA通过tRNA串联表达方式，用NEBuilder(New England Biolabs)方法克隆到大豆基因编辑基本转化载体KF49中，形成KF57(RB-GmU6-9pro：GmFad2-G1-G2：AtU6-26term+GmEF2pro：Cas9：Ps E9term+35S pro：Bar：35S term-LB)基因编辑转化载体(SEQ ID NO：18)。遗传转化导入大豆细胞中表达后，可以通过Cas9-gRNA特异位点酶切产生DNA双链断裂诱导的DNA修复NHEJ途径，同时敲除编辑GmFad2-1A和GmFad2-1B两个基因的各两个位点，造成DNA移码突变，从而实现Fad2基因功能敲除，阻断种子中油酸(18：1)向多键不饱和脂肪酸亚油酸(18：
2)和亚麻酸(18：3)的转化，使细胞积累高水平油酸。
2)和亚麻酸(18：3)的转化，使细胞积累高水平油酸。
[0095] 实施例2垦保小粒豆1号的遗传转化
[0096] 基因编辑必须通过将基因编辑载体转化入细胞内表达后才能实现，为了编辑垦丰自主优良品种垦保小粒豆1号的Fad2基因，利用农杆菌介导方法，以垦保小粒豆1号膨大萌发种子为外植体，将基因编辑载体KF57转化入大豆细胞进行GmFad2-1A和GmFad2-1B基因的敲除编辑，具体操作流程如下：
[0097] (1)外植体制备：挑选垦保小粒豆1号表面光滑无伤痕的饱满种子装在培养皿中放在干燥器内，加入96毫升10％的次氯酸钠和4毫升浓盐酸产生氯气，密闭消毒种子约16小时。将灭好菌的种子在超净台中开盖吹净氯气，加入无菌的去离子水，将无菌种子浸泡约16个小时膨大萌发，次日用手术刀去掉种皮，沿下胚轴将两个子叶分开，切除掉暴露的顶芽和腋芽，在子叶节处轻轻划3-5刀制造伤口，即为制备好的外植体。
[0098] (2)农杆菌菌液的制备：从-80℃低温冰箱中取出携带目标基因的农杆菌甘油保存管，将农杆菌接种于含50mg/L卡那霉素的固体YEP平板上划线，28℃温箱暗培养2-3天。挑取单菌落接种到含有50mg/L卡那霉素的液体YEP培养24小时，然后以1：100的接种量进行二次活化，将菌液加入到100-200毫升液体YEP培养基中，220rpm，28℃震荡培养12-14小时。当菌液浓度达到OD600＝0.6左右时，以4000rpm离心10分钟，倒出上清液，将菌体用液体共培养培养基重悬浮并稀释到OD600＝0.5用于后续侵染。
[0099] (3)侵染及共培养：将制备好的外植体浸泡在重悬好的农杆菌菌液中30分钟后，先转移到铺有无菌滤纸的培养皿中，吸除外植体表面的菌液，再将外植体接种在铺有无菌滤纸的共培养基中，25℃培养室暗培养5天。
[0100] (4)芽诱导及筛选：将共培养后的外植体，切除伸长的胚根但保留基部约3-4毫米，并去除未切净的顶芽。将切好的外植体转入三角瓶中，用无菌水冲洗三次，然后用无菌滤纸吸干外植体表面残留的水分，将其平面向上、划伤的子叶节端以45度斜插入芽诱导培养基上。培养室中培养3天后转入含20mg/L草胺膦的丛生芽诱导培养基中继续培养2周后继代一次，继代时去除大顶芽或下胚轴褐化死亡的外植体，继续培养两周。
[0101] (5)芽伸长及生根：将筛选后的丛生芽转入含4-35mg/L草胺膦的伸长培养基中，每2周继代培养一次。有芽伸长到约3厘米以上并有2-3叶片长出时，将芽从底部切下插入生根培养基中，诱导1-2周直至长出2支以上主根。
[0102] (6)移栽：当幼苗根系长度大于3-4厘米且较健壮时，打开培养瓶封口盖并加入少量蒸馏水，炼苗24小时以上，小心用镊子将植株夹出，用清水冲洗根部培养基，移栽至含蛭石营养土中，加盖保持湿度，人工气候室内培养，有新叶长出后将盖去除。
[0103] 遵循上述流程并使用表1中所列的各种对应培养基，垦保小粒豆1号经过多批次试转化和培养条件优化后，能产生大量丛生芽，测试了4，8，12，16，20，30，35mg/L不同浓度的草胺膦筛选，在较低浓度如4，8，12，16mg/L草胺膦的筛选压力下，许多丛生芽会伸长并正常生根，但产生的再生植株经叶片涂抹0.1％Basta除草剂鉴定，并不具有抗性，多为假阳性非转化植株。在高浓度20，30，35mg/L草胺膦的筛选压力下，丛生芽产生能力受抑制，数量减少，但少数芽也会伸长并能诱导生根。采用30mg/L草胺膦筛选丛生芽诱导及伸长，从转化实验S31侵染的300粒外植体中获得了十多棵健康植株，经叶片涂抹0.1％Basta除草剂鉴定和Envirologix公司的Bar试纸条检测，确认7株为阳性T0转化苗S31-1，2，3，4，5，6，7(图4)，有效转化率约为2.3％。壮苗后移栽到温室中盆栽生长结实，期间取样进行基因型分析鉴定。
[0104] 实施例3龙垦314的遗传转化
[0105] 龙垦314是另一个筛选出的可以用农杆菌介导方法转化的垦丰自主优良品种，同样转化KF57可以实现GmFad2-1A和GmFad2-1B基因的敲除编辑，获得高油酸性状。农杆菌介导的转化流程与上述垦保小粒豆1号的类似，测试了4，8，12，16，20，30mg/L不同浓度的草胺膦筛选，发现龙垦314农杆菌侵染适宜浓度和转化筛选剂的适宜浓度都略低，二者浓度过高会分别导致外植体及丛生芽褐变致死。采用20mg/L草胺膦筛选丛生芽诱导及伸长，从100粒外植体的转化中获得了2棵健康植株，并经叶片涂抹0.1％Basta除草剂鉴定和Envirologix公司的Bar试纸条检测证实为阳性T0转化苗8，9(图4)。
[0106] 实施例4垦保小粒豆1号T0再生植株基因编辑鉴定
[0107] 将试纸条检测为阳性的植株取叶片提取DNA进行Cas9基因的PCR检测，DNA提取使用植物基因组DNA提取试剂盒EasyPure Plant Genomic DNA Kit(全式金生物TransGenBiotech)，PCR反应体系采用TOYOBO的Quick Taq HS DyeMix(TOYOBO Bio-Technology)，20微升的PCR反应体系包含10微升2X Quick Taq HS DyeMix，1.0微升10pmol/μl引物Cas9-F1(SEQ ID NO：19)，1.0微升10pmol/μl引物Cas9-R1(SEQ ID NO：20)，
6.0微升无菌水，2.0微升50ng/μl的基因组DNA。PCR反应条件为95℃5分钟初始变性后，95℃
30秒；60℃30秒；72℃30秒共30个循环,然后72℃7分钟延伸，并在4℃保持。经检测，7株试纸条检测阳性苗中的2、5、6、7号植株成功扩增了540bp的特异片段，判定为Cas9基因阳性(图
5A)。随后用引物KF26-F4和KF26-R3(SEQ ID NO：21，22)扩增KF57载体骨架左侧470bp片段(图5B)，用引物KF26-F12和RB-R(SEQ ID NO：23，24)扩增KF57载体骨架右侧331bp片段(图
5C)，发现仅植株2和5分别携带KF57载体骨架右侧部分片段，经后续T0和T1代编辑植株的目标基因序列分析判断，Cas9阳性T0苗2和5应该来源于同一转化事件。
6.0微升无菌水，2.0微升50ng/μl的基因组DNA。PCR反应条件为95℃5分钟初始变性后，95℃
30秒；60℃30秒；72℃30秒共30个循环,然后72℃7分钟延伸，并在4℃保持。经检测，7株试纸条检测阳性苗中的2、5、6、7号植株成功扩增了540bp的特异片段，判定为Cas9基因阳性(图
5A)。随后用引物KF26-F4和KF26-R3(SEQ ID NO：21，22)扩增KF57载体骨架左侧470bp片段(图5B)，用引物KF26-F12和RB-R(SEQ ID NO：23，24)扩增KF57载体骨架右侧331bp片段(图
5C)，发现仅植株2和5分别携带KF57载体骨架右侧部分片段，经后续T0和T1代编辑植株的目标基因序列分析判断，Cas9阳性T0苗2和5应该来源于同一转化事件。
[0108] 设计使用基因特异性引物GmFad2A-F1和GmFad2A-R1(SEQ ID NO：25，26)，以及GmFad2B-F1和GmFad2B-R1(SEQ ID NO：27，28)，分别用PCR方法从Cas9阳性植株2、5、6、7号样品成功扩增了目标基因GmFad2-1A 817bp和GmFad2-1B 819bp片段(SEQ ID NO：29，30)，其中2、5、6号植株的GmFad2-1B基因PCR均扩增了大小接近的两条带(图6B)。使用单向或双向引物直接测序这些PCR片段，结果显示4个阳性植株每个基因都在预期的gRNA编辑位点附件存在套峰，不能准确测序，故推断目的基因位点均发生了编辑。将发生编辑的样品的PCR片段进行TOPO克隆到pCR2.1TOPO TA载体(Thermo Fisher Scientific)，每个样品送3个克隆再次测序，从而确定了具体编辑序列，发现GmFad2-1A及GmFad2-1B基因的两个位点均有缺失、插入等不同类型的编辑，分别与野生型GmFad2-1A及GmFad2-1B基因序列进行了比对以显示具体编辑情况(图7，8)。四棵T0植株GmFad2-1A及GmFad2-1B目标基因编辑片段克隆测序分析的结果如下表2所示。
[0109] 表2.垦保小粒豆1号转化KF57事件T0代植株GmFad2-1A和GmFad2-1B编辑[0110]
[0111]
[0112] 另外三株Cas9阴性T0苗1，3，4因未检测到携带KF57上的Cas9基因(图5)，故未进一步进行目标基因序列检测。
[0113] 上述序列分析显示垦保小粒豆1号GmFad2-1A基因的817bp片段与Williams82的参考基因序列完全相同，但GmFad2-1B基因的819bp片段有两个SNP，分别是PCR片段第61位的A/G和第332位A/G置换，垦保小粒豆1号序列的相应位置均为G。
[0114] 实施例5垦保小粒豆1号T1后代植株基因编辑鉴定
[0115] 由于新建的实验室和温室首次启用，T0再生植株的培养条件不理想导致早熟，结实效果差，4棵T0植株收获的T1种子在温室种植萌发后仅获得了13棵后代，用上述同样方法提取叶片DNA进行PCR检测，三棵植株S31-2-2，5-1，和6-3因遗传分离不再含有Cas9基因，为非转基因分离后代(图9B)。用引物GmU6-9F1和GmU6-9R1(SEQ ID NO：5，6)PCR扩增大豆GmU6-9内参基因启动子550bp片段为对照，各样品均为阳性，显示各样品的基因组DNA底物正常。随后从每一棵T1植株分别用前述同样PCR方法扩增两个目标基因GmFad2-1A 817bp和GmFad2-1B 819bp片段，直接测序发现部分T1植株的编辑位点已经纯合，其中五棵植株S31-2-1，2-5，5-1，6-3，和6-5的GmFad2-1A和GmFad2-1B基因都获得纯合编辑(表3)。杂合植株的PCR片段经TOPO克隆后分别测序三个克隆。T1代编辑植株GmFad2-1A和GmFad2-1B基因目标片段的测序分析比对结果分别列于图10和图11，并总结于表3中。
[0116] 表3.垦保小粒豆1号转化KF57事件T1代植株GmFad2-1A和GmFad2-1B编辑[0117]
[0118]
[0119] 综合上述分析，尽管生产品种垦保小粒豆1号的转化效率不高，且由于实验条件不适等原因导致T0植株的结实不好，仅产生了13株T1后代，两个脂肪酸脱氢酶GmFad2-1A和GmFad2-1B基因的同步编辑仍然在T1代即获得了非转基因纯合编辑植株，说明本发明描述的大豆遗传转化及基因编辑方法可有效地应用于大豆主栽品种的基因编辑品种改良。对实施例4和5中部分垦保小粒豆1号T0再生植株和T1后代植株的叶片DNA进行鉴定，得到核苷酸序列如SEQ ID NO：31-55所示。
[0121]
[0122]
[0123]
[0124] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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