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一种快速高效同时检测蔬菜中多种抗生素含量的方法

阅读：325发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种快速高效同时检测蔬菜中多种抗生素含量的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于环境污染物检测技术领域，提供了一种快速高效同时检测蔬菜中多种抗生素含量的方法，用乙腈/丙酮混合提取剂提取蔬菜样品，依次进行涡旋、超声、离心操作后，用N-丙基二乙胺净化上清液色素，氮吹近干后用初始流动相再溶，并转移到进样小瓶待测；利用超高液相色谱仪连接三重四级杆串连质谱仪进行抗生素含量测定。本发明克服了现有蔬菜中抗生素检测方法前处理复杂、抗生素检出种类少、检出限高等不足，可为进行蔬菜中抗生素的健康风险评价提供科学依据。，下面是一种快速高效同时检测蔬菜中多种抗生素含量的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种快速高效同时检测蔬菜中多种抗生素含量的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)样品前处理
对蔬菜样品进行冷冻干燥处理，并粉碎成粉末后在-20℃条件下密封保存备用；向蔬菜样品中加入回收率内标，静置20-30分钟；再添加提取溶剂，每次按照溶剂与植物样品体积/质量比为16mL/g添加，提取溶剂为体积比1：1的酸化乙腈与丙酮；按照上述添加方式，添加提取溶剂的过程重复3次，每次提取涡旋1-3分钟，超声10-30分钟，4000r/min离心10-30分钟，上清液混合；向上清液中添加N-丙基二乙胺净化，控制N-丙基二乙胺与提取溶剂的质量/体积比为25mg/mL，涡旋1-3分钟，静置15-30分钟；取上清液氮吹近干，加入1mL初始流动相重新溶解抗生素，过0.22μm滤膜，并转移到进样小瓶中待测；初始流动相为流动相A和流动相B按照体积比95/5；
(2)LC-MS/MS分析
使用超高液相色谱仪连接三重四级杆串联质谱仪进行分析；
色谱条件：使用C18色谱柱，流动相A为质量分数为0.1％甲酸-甲酸铵溶液，流动相B为体积比1:1的乙腈-甲醇，柱温40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5μL；梯度洗脱为：0～
2.5min，95VAL％A～90VAL％A；2.5～7min，90VAL％A～10VAL％A；7～8min，10VAL％A～
95VAL％A；8～10min，95VAL％A；
质谱条件：目标化合物的电离模式采用电喷雾离子源正离子和负离子切换扫描，多反应监测模式；干燥气温度和流速为：350℃，650L/Hr；雾化气压力为：7.00Bar；毛细血管电压为2.51kV。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酸化乙腈为用无水甲酸将乙腈的pH调至3。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，待测的抗生素包括磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、β-内酰胺类。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，待测的抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、恩诺沙星、诺氟沙星、克拉霉素、氟苯尼考和氯霉素。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，待测的抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、恩诺沙星、诺氟沙星、克拉霉素、氟苯尼考和氯霉素。

说明书全文

一种快速高效同时检测蔬菜中多种抗生素含量的方法

技术领域

[0001] 本发明属于环境污染物检测技术领域，具体涉及一种利用高效液相色谱串联质谱快速高效检测蔬菜中来自磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、β-内酰胺类多种抗生素的方法。

背景技术

[0002] 抗生素具有预防或治疗动物疾病、以及促进动物生长的作用，被广泛应用于人类医学、牲畜饲养及水产养殖等行业。抗生素在生产及使用过程中，会通过各种途径最终排放到环境中，并且引发菌群耐药性。目前在水体、土壤和沉积物等环境介质中均有抗生素检出。土壤是抗生素在环境中重要的汇，国内相关研究表明，土壤中抗生素的检出浓度可达μg/kg到mg/kg水平。当植物在受抗生素污染的土壤中生长时，通过根部吸收的抗生素可以在植物的可食用部分积累，对人体存在潜在的暴露风险。

[0003] 由于抗生素在蔬菜中的浓度水平一般较低，同时植物样品基质复杂，使得植物样品中抗生素的分析存在诸多挑战。其中，样品前处理是其分析的关键过程之一。样品常用的提取方法有超声提取法(ULE)和加速溶剂提取法(ASE)。ASE利用高温高压条件使化合物从固相样品进入到提取液中，然而过度的高温和过长的提取时间可能会使样品基质中的杂质更多地进入提取液，对后续净化或分离检测造成影响。ULE利用超声振动使样品和提取溶剂充分接触，具有费时少、提取率高、易操作的优点，其中选择合适的溶剂是提高提取效率的关键。抗生素常用的提取剂有甲醇、乙腈、丙酮等，但在提取过程中对色素也具有较强的萃取能力。固相萃取技术(SPE)是常用的净化方法之一，亲水亲脂平衡柱(HLB)是目前抗生素分析中最常用的萃取柱，其在较宽pH范围内对亲水和疏水化合物都有较强的保留能力，但其需要的净化时间较长且成本较高。由于植物基质复杂，色素等干扰物质含量较高，因此选择简单高效的前处理方法，且达到对蔬菜中抗生素的有效提取和快速定性定量成为蔬菜中抗生素检测的重点。

[0004] 实验选择利用酸化的有机溶剂对样品进行超声提取之后，为了提高吸附剂对植物样品的净化效果，尝试将N-丙基二乙胺(PSA)直接加到固液离心分离后的上清液中进行净化。样品利用UPLC-MS/MS技术进行检测，干扰杂质少，检测灵敏度提高，检出限降低，可以有效测定蔬菜等植物样品中抗生素的浓度。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种能够快速高效检测蔬菜中多种抗生素的方法，即基于简单高效的提取和净化方法，优化色谱和质谱条件，利用高效液相色谱-三重四级杆质谱串联仪对蔬菜样品中多种抗生素进行检测，具有操作简单，样品前处理成本低，方法检出限低、灵敏度高且检测速度快的特点，可为蔬菜中抗生素的分析提供技术方法。

[0006] 本发明的技术方案：

[0007] 一种快速高效同时检测蔬菜中多种抗生素含量的方法，步骤如下：

[0008] (1)样品前处理

[0009] 对蔬菜样品进行冷冻干燥处理，并粉碎成粉末后在-20℃条件下密封保存备用；向蔬菜样品中加入回收率内标(待测试的抗生素)，静置20-30分钟；

[0010] 再添加提取溶剂，每次按照溶剂与植物样品体积/质量比为16mL/g添加，提取溶剂为体积比1：1的酸化乙腈与丙酮；按照上述添加方式，添加提取溶剂的过程重复3次，每次提取涡旋1-3分钟，超声10-30分钟，4000r/min离心1 0-30分钟，上清液混合；向上清液中添加N-丙基二乙胺(PSA)净化，控制N-丙基二乙胺与提取溶剂的质量/体积比为25mg/mL，涡旋1-3分钟，静置15-30分钟；取上清液氮吹近干，加入1mL初始流动相(A:B＝95/5v/v)重新溶解抗生素，过0.22μm滤膜，并转移到进样小瓶中待测；

[0011] 所述的酸化乙腈为用无水甲酸将乙腈的pH调至3。

[0012] 测试的抗生素包括来自磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、β-内酰胺类，具体为磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、甲氧苄啶、恩诺沙星、诺氟沙星、克拉霉素、氟苯尼考和氯霉素。

[0013] (2)LC-MS/MS分析

[0014] 使用超高液相色谱仪连接三重四级杆串联质谱仪(UPLC-QqQ-MS/MS)进行分析；

[0015] 色谱条件：使用C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)，流动相A为质量分数为0.1％甲酸-甲酸铵溶液，流动相B为乙腈-甲醇(1:1V/V)，柱温40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5μL；梯度洗脱为：0～2.5min，95％(VAL)A～90％(VAL)A；2.5～7min，90％(VAL)A～10％(VAL)A；7～8min，10％(VAL)A～95％(VAL)A；8～10min，95％(VAL)A。

[0016] 质谱条件：目标化合物的电离模式采用电喷雾离子源正离子(ESI+)和负离子(ESI-)切换扫描，多反应监测模式(MRM)；干燥气温度和流速为：350℃，650L/Hr；雾化气压力为：7.00Bar；毛细血管电压为2.51kV。

[0017] 质谱参数如表1所示：

[0018] 表1.目标抗生素的质谱参数

[0019]

[0020] 注：带*为定量离子

[0021] 为了保证分析结果的准确性，采用两个原则控制：(a)实际样品中抗生素的保留时间在标准品保留时间的0.5min以内；(b)样品检测信噪比(S/N)>3。

[0022] 表2.目标抗生素的加标回收率、检出限、定量限

[0023]

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] (1)本方法前处理方法简单，提取剂易于配制，采用在提取的上清液中直接加入N-丙基二乙胺(PSA)净化色素，替代传统的HLB柱，在降低前处理成本的基础上，达到了良好的净化效果；

[0026] (2)本方法采用UPLC-MS/MS技术检测抗生素，与现有的其他方法相比，检出限低、灵敏度高；

[0027] (3)本方法能够同时检测蔬菜中8种抗生素，且在10分钟内能有效分离，克服了当前方法检测成本高、检测抗生素种类少的不足，为植物样品中抗生素的分析提供了技术参考。附图说明

[0028] 图1为实施例1中标准样品8种抗生素总出峰图。

[0029] 图2为实施例1中实际样品8种抗生素总出峰图。

[0030] 图3为实施例1中磺胺嘧啶标准样品出峰谱图。

[0031] 图4为实施例1中磺胺甲恶唑标准样品出峰谱图。

[0032] 图5为实施例1中甲氧苄啶标准样品出峰谱图。

[0033] 图6为实施例1中恩诺沙星标准样品出峰谱图。

[0034] 图7为实施例1中诺氟沙星标准样品出峰谱图。

[0035] 图8为实施例1中氟苯尼考标准样品出峰谱图。

[0036] 图9为实施例1中氯霉素标准样品出峰谱图。

[0037] 图10为实施例1中克拉霉素标准样品出峰谱图。

[0038] 图中：1磺胺嘧啶；2甲氧苄啶；3诺氟沙星；4恩诺沙星；5磺胺甲恶唑；6氟苯尼考；7氯霉素；8克拉霉素。

具体实施方式

[0039] 以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

[0040] 实施例1

[0041] (1)选择生菜(Lactuca sativa)作为模式生物，对于目标抗生素在50μg/L的浓度下进行水培实验，第3天时间点取样，对暴露结束的生菜进行冷冻干燥48h处理，并用粉碎机粉碎成粉末，-20℃条件下密封保存备用。

[0042] (2)配制标准曲线

[0043] 采用内标法，标准曲线梯度为0、0.5、5、10、50、100μg/L

[0044] (3)配制植物中抗生素提取剂

[0045] 取300ml乙腈，用无水甲酸调节pH至3.0，再加入300mL丙酮，超声混匀，得到抗生素提取剂。

[0046] (4)样品前处理

[0047] 称取0.3g叶冻干样品或0.1g根冻干样品放入40mL离心管，加入50μL浓度为1mg/L的回收率内标，静置30分钟；按照16mL/g的量加入提取剂，此过程重复3次，每次涡旋1分钟，超声15分钟，离心(4000r/min)15分钟，上清液混合；按照25mg/mL的剂量加入PSA净化，涡旋1分钟，静置30分钟；上清液氮吹近干，加入1mL初始流动相重新溶解抗生素，过0.22μm PTFE-Q滤膜，并转移到2ml进样小瓶准备UPLC-MS/MS分析。

[0048] (5)LC-MS/MS分析

[0049] 使用超高液相色谱仪连接三重四级杆串联质谱仪(UPLC-QqQ-MS/MS)进行分析。

[0050] 色谱条件：使用C18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)，流动相A为质量分数为0.1％甲酸-甲酸铵溶液，流动相B为乙腈-甲醇(1:1V/V)，柱温40℃；流速为0.3mL/min；进样量为5μL；梯度洗脱为：0～2.5min，95％A～90％A；2.5～7min，90％A～10％A；7～8min，10％A～95％A；8～10min，95％A。

[0051] 质谱条件为：目标化合物的电离模式采用电喷雾离子源正离子(ESI+)和负离子(ESI-)切换扫描，多反应监测模式(MRM)；干燥气温度和流速为：350℃，650L/Hr；雾化气压力为：7.00Bar；毛细血管电压为2.51kV。具体质谱参数见表1。

[0052] (6)实验结果

[0053] 通过内标法绘制标准曲线，计算得出8种抗生素在生菜组织中的浓度，并计算标准偏差(n＝3)，标准曲线及植物组织浓度见表3。

[0054] 表3目标抗生素标准曲线及在生菜组织检出浓度

[0055]

[0056]

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