【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、パラクレゾールを微生物を用いて変換し、パラヒドロキシ安息香酸を製造する方法に関する。 さらに詳しく述べると、本発明は、エンテロバクター属に属し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体を用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、パラヒドロキシ安息香酸の製造は、フェノールを原料とし、そのカリウム塩に二酸化炭素を高温・高圧下で作用させるコルベ・シュミット法による化学合成法が一般に行われてきた。 しかし、反応条件として高温・高圧を要するためにエネルギー消費量が大きく、またアルカリ塩を多量に使用するなどの問題があった。

【０００３】一方、微生物を用いたパラヒドロキシ安息香酸の製造法は、常温・常圧で進行し、エネルギー的にも有利なことが期待される。 しかし、これまでの微生物転換法はアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger
(ＵＢＣ８１４））の菌体抽出酵素による安息香酸からのパラヒドロキシ安息香酸の生成（Reddy,CC & Vaidy
anathan,CS;Biochim.Biophys.Acta 384, 46-57) や、
パラキシレンを唯一の炭素源とするシュードモナス−エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa) のパラキシレン代謝経路でパラクレゾールやパラヒドロキシ安息香酸を検出している例（大森など、Agri.Biol.Chemi.Vol 31,
1337(1967)) 、シュードモナス属菌株のパラクレゾール代謝(S.Dagrey およびMDPatel; Biochem. J., 66, 22
7(1967))が知られている程度で、しかもいずれの反応も安息香酸からの生成や代謝分解中間体としてパラヒドロキシ安息香酸を検出して、パラキシレンの分解がパラヒドロキシ安息香酸を経て進行することを明らかにしているに過ぎない。 パラクレゾールを微生物に原料として与え、これを変換してパラヒドロキシ安息香酸を生成させて培地中に著量蓄積させて採取することは示唆されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、常温・常圧で進行する経済的な微生物転換法を利用して、パラヒドロキシ安息香酸を製造する新規な方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、化学的合成法よりも省エネルギー的である微生物の物質変換能に着目した。 すなわち、微生物に増殖を支える基質を与えて増殖させ、この培養液にパラクレゾールを共存させて、これを酸化し、変換させるコ・オキシデーション（Co-oxidation) の方法によってパラヒドロキシ安息香酸を生成させ、これを分解させることなく著量蓄積させる方法を完成することを目的とした。 そこで、本発明者らはコ・オキシデーションによりパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸を生成する能力を持つ微生物を検索した結果、エンテロバクター属に属する細菌菌株に、
パラクレゾールのみをパラヒドロキシ安息香酸に変換する菌株を見いだし、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は、エンテロバクター属に属し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体を用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供する。 前記エンテロバクター属に属し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体をパラクレゾールを添加した培地で培養するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供する。 前記エンテロバクター属に属し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体を培養して菌体を増殖させた後、パラクレゾールを一度にあるいは分割して添加して培養を継続するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供する。 前記エンテロバクター属に属する菌体を培養させた後、菌体を回収して、該菌体を用いてパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供する。 前記エンテロバクター属に属し、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を持った菌体が、エンテロバクター・クロッカエ（Enterobacter clo
acae）であるパラヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供する。

【０００７】本発明で使用する菌株は、エンテロバクター属に属するものの内、パラクレゾールを選択的にパラヒドロキシ安息香酸に変換する能力を有する菌株であればよい。 したがって、土壌から単離した菌株で、バージース・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Bergey's Mannual of Systematic Bacteriolog
y)，Ｖｏｌ． １（１９８４）に記載の基準により、エンテロバクター属に属する菌株であると同定した菌株であってもよい。 本発明の具体的なエンテロバクター属に属する菌体としては、エンテロバクター・クロッカエ（En
terobacter cloacae) ＩＦＯ １３５３５が挙げられる。

【０００８】本発明者は、この細菌菌株が、上述したように、コ・オキシデーション作用によりパラクレゾールを変換して、パラヒドロキシ安息香酸を生成することができることを知見し本発明に至った。

【０００９】本発明の製造方法は、エンテロバクター属に属する菌体のコ・オキシデーション作用を利用することにより、微生物の培養液中に出発物質を共存させ、微生物の増殖は変換させたい出発物質とは別の、増殖に必要な炭素源、窒素源で行い、増殖した微生物が培養液中に共存させた出発原料を酸化・変換させること、あるいは増殖した微生物を分離回収した後、微生物菌体を懸濁した反応液を調整して変換反応に必要なエネルギー源を供給しながら微生物の酸化能力を利用して出発原料を酸化・変換させることであり、本発明では、エンテロバクター属に属する細菌、例えばエンテロバクター・クロッカエに属する菌株、特にエンテロバクター・クロッカエ ＩＦＯ １３５３５株を用いて、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に酸化・変換することである。

【００１０】本発明の製造方法は、微生物を増殖させる工程および微生物を利用してパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する工程を包含する。 また、微生物を増殖させる工程（増殖工程）と微生物を利用してパラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換する工程（変換工程）は、別々の工程であっても、同時に行われる工程であってもよい。

【００１１】本発明の方法で使用する細菌菌株を増殖する（増殖工程）ための培地としては、通常の細菌用培地を使用してもよいが、この菌株が良好に成育できる培地で、かつ微生物変換反応を進行させるものであれば、いかなる組成の培地も使用できる。 この時に用いる培地は、培地成分として、適当な炭素源、窒素源および無機塩などを含有しうる。 また、本発明の変換工程に使用する培地は、菌体増殖用と同様の培地を用いてもよく、また異なる培地を用いてもよい。 また、菌体を増殖させた後、菌体の変換作用を維持できる溶液、例えば、生理食塩水のような溶液を培地の代わりに用いてもよい。 培地成分に、前記菌体を増殖するための培地に含まれる成分と同じ成分を含み得る。

【００１２】炭素源としては、本発明の菌株が利用できる任意の炭素源が使用できる。 かかる炭素源として利用できる有機物には、上記の菌学的性質において示したように、グリセリンなどの有機化合物、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、オリーブ油、大豆油などの脂質、エタノールなどのアルコールあるいはコーンスティープリカー、廃糖蜜など農産物の抽出・精製残渣、あるいはマロン酸、クエン酸などの有機酸が例示できる。 菌体増殖工程の培地の場合には、上述したような本発明の菌株が利用し得る１種または２種以上の炭素化合物を任意に炭素源として利用できる。 また、変換工程の培地の場合には、菌体増殖工程と同じ炭素源が利用できるが、
グリセリンなどの有機化合物、グルコース、フラクトースなどの炭水化物が好ましい。 炭素源の含有量は、炭素源の種類によっても異なるが、培地中２重量％以上であるのが好ましい。

【００１３】窒素源としては、特に限定されないが、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、およびペプトン、酵母エキス、カザミノ酸などの有機窒素源が利用できる。 有機窒素化合物を用いた場合、
これには炭素も含まれているので、別の炭素源を新たに加えることは増殖用培地の場合には必ずしも必要としない。

【００１４】無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸マグネシウム、ナトリウム塩、カリウム塩等が使用できる。 さらに、微量の重金属類（例えば、鉄塩、マンガン塩、銅塩、カルシウム塩、亜鉛塩、コバルト塩など）を培地に含有させてもよい。

【００１５】培養方法としては、振盪培養法、深部通気攪拌培養法などの方法により行うことができる。 培養温度は、２０〜３７℃、ＰＨは中性付近、攪拌は８０〜４
００ｒｐｍ、培養日数は反応の進行に応じて決めることができるが、通常は菌体増殖に１〜２日、パラクレゾールをパラヒドロキシ安息香酸に変換するのには、約２日が適当である。 ２日を超えると、菌体の増殖工程では、
増殖能の低下の点で好ましくなく、変換工程では、副生成物が生成する点で好ましくない。 両方の工程を合せて、２〜３日程度であるのが適当である。 この時に変換の原料となるパラクレゾールは水に難溶性であるために、ポリオキシエチレンソルビタンなどの各種の界面活性剤を培地に添加することも可能である。 また、必要に応じて、脂肪酸エステル系、シリコン系などの消泡剤を添加してもよい。

【００１６】本発明の製造方法に用いるパラクレゾールは、菌体の増殖培養開始時に添加してもよく、また、菌体の増殖培養後添加してもよい。 さらに、増殖培養時および増殖培養後の両方に添加してもよい。 菌体の増殖培養開始時に添加する場合、添加するパラクレゾールの培養液中の濃度は、３重量％以下、特に１重量％以下であるのが好ましく、さらに０．２〜０．５重量％であるのが好ましい。 ３重量％超では、微生物が十分に作用しなくなるので好ましくない。 また、菌体の増殖培養後添加する場合、パラクレゾールを添加する時期は、菌体濃度が、６６０ｎｍの吸光度で、１．０〜１０．０の時に添加するのが好ましい。 また、経時的に添加する場合、増殖後１日目、２日目に等量に分割して添加してもよいし、さらに低濃度で、例えば０．２〜０．３重量％濃度を保ちながら、菌体の増殖にあわせて連続的に添加してもよい。 添加するパラクレゾールの培養液中の濃度は、
３重量％以下、特に１重量％以下であるのが好ましく、
さらに０．２〜０．５重量％であるのが好ましい。 ５重量％超では、微生物が十分に作用しなくなるので好ましくない。 パラクレゾールを添加する時期を、菌体の増殖前にするのと増殖後にするのとでは、菌体の増殖後に添加した方が５〜１０％変換率が高い。

【００１７】さらに、増殖工程および変換工程を、パラクレゾールを添加する時期の組み合わせで考えると、以下の組み合わせが例示される。 １）パラクレゾールを、増殖工程の開始点で加え、増殖工程と変換工程を同時に行う。 ２）微生物を増殖させた後パラクレゾールを加えて、変換工程を行う。 パラクレゾールの添加は、変換工程の途中、または開始点と途中の両方で添加する。 ３）パラクレゾールの添加を増殖工程と変換工程とに各々少なくとも１回以上行い、増殖工程の後に菌体を培地から分離して変換工程の培地に移植する。 上述の変換工程の培地は、増殖工程に用いた培地と同様の培地であってもよく、また、本発明の菌体が有する変換作用を妨げない溶液、例えば、生理食塩水のような溶液であってもよい。 また、前記２）の方法では、菌体を増殖後、パラクレゾールを添加して培養を継続することが含まれる。

【００１８】変換反応終了後、生成したパラヒドロキシ安息香酸を培養液から分離・精製する方法は、一般の有機化合物の分離・精製と同様に、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、中和、濃縮、結晶化などの当業者に周知の手段を適宜組合わせることにより行うことができる。 たとえば、培養液から固体を遠心分離によって除いた後、上清を濃縮し、次いで酸性化してパラヒドロキシ安息香酸を沈殿させて固液分離する方法、あるいは上記上清を酸性化した後、酢酸エチル、クロロホルムなどの有機溶媒による溶媒抽出で生成物を分離する方法がある。 また、パラヒドロキシ安息香酸が生成後沈澱している場合は、酢酸エチルなどの溶媒抽出による回収が有効な方法である。 得られた粗製物を各種のカラムクロマトグラフィーあるいは再結晶などの方法によって精製することができる。

【００１９】本発明の方法により製造されるパラヒドロキシ安息香酸は、防腐剤として使用される他、医薬品、
農薬、染料、液晶などの原料として有用である。

【００２０】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

【００２１】（実施例１）本実施例は、本発明の方法によるパラクレゾールからパラヒドロキシ安息香酸への微生物による変換を例示する。 使用した培地は下記組成のものであった。

² 、２０分間滅菌して使用）

【００２２】上記培地１００ｍＬにエンテロバクター・
クロッカエ ＩＦＯ １３５３５の菌株１白金耳を接種し、３０℃で１夜振盪培養した。 得られた培養液の１０
ｍＬを、同様の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容フラスコに接種して１日間振盪培養を行った。 培養条件は、温度３０℃、ＰＨ６．８、１８０ｒｐｍであった。
培養開始１日後および２日後にパラクレゾールを各々０．１ｇづつ添加して合計３日間の培養を行った。 培養終了後、遠心分離によって菌体を除き、減圧下で２０ｍ
Ｌに濃縮し、２０ｍＬの酢酸エチルで３回抽出を行った。 酢酸エチル層を合わせて蒸発乾固し、エタノール：
キシレンの１：１混合溶媒により再結晶させて、０．１
８ｇ（７０．４％）の精製物を得た。 得られた物質は、
元素分析およびＮＭＲ測定によって、パラヒドロキシ安息香酸と確認された。 元素分析値（Ｃ７，Ｈ６，Ｏ３） 計算値：Ｃ ６０．８７％、Ｈ ４．３８％ 実測値：Ｃ ６０．８６％、Ｈ ４．３７％ ¹³ Ｃ−ＮＭＲ（δｐｐｍ、ＤＭＳＯ−ｄ ₆中のＴＭＳ） カルボニルＣ：１６９．１ フェニレンＣ：１１５．４、１２１．３、１３２．１、
１６１．８

【００２３】（実施例２）実施例１で使用したものと同じ組成の培地に対して０．２重量％のパラクレゾールを添加した培地１００ｍｌに、実施例１と同様にエンテロバクター・クロッカエ ＩＦＯ １３５３５の菌株を１
白金耳接種して培養した前培養液１０ｍＬを、同様にパラクレゾール０．２重量％を添加した培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容フラスコに接種して２日間、実施例１と同じ培養条件で培養を行った。 ２日後の培養液中のパラヒドロキシ安息香酸の生成量は０．２０ｇ（７
８．３％）であった。 培養液からのパラヒドロキシ安息香酸の分離・精製は遠心分離によって菌体を除き、上清に硫酸を加えＰＨを１とした後、この酸性溶液よりクロロホルムでパラヒドロキシ安息香酸を抽出分離し、抽出液を減圧濃縮することによって粗結晶を得た。 この粗結晶を実施例１と同様にエタノール：キシレンの１：１混合溶媒により再結晶することによって白色針状結晶０．
１７ｇ（６６．５％）を得た。

【００２４】（実施例３）実施例１で使用したものと同じ組成の培地１００ｍＬを仕込んだ３００ｍＬ容三角フラスコ３本を使用し、エンテロバクター・クロッカエ
ＩＦＯ １３５３５を各々のフラスコに１白金耳接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。 得られた培養液３００ｍＬを、母菌として実施例１と同様な培地３．５Ｌを仕込んだ５Ｌ容のジャー・ファーメンターに接種し、同時に基質としてパラクレゾール６ｇを添加して培養を行った。 １日後さらにパラクレゾール５ｇを添加して培養を継続し、合計３日間の培養を行った。 培養条件は、温度３０℃、ＰＨ７．０、攪拌３００ｒｐｍ、
通気量０．５容量／容量／分であった。 培養終了後、１
０，０００×Ｇで２０分間の遠心分離によって菌体を除き、硫酸によりＰＨ１とした後、実施例２と同様に処理してパラヒドロキシ安息香酸１１．０ｇ（７８．３％）
を得た。

【００２５】（実施例４）実施例１で使用したものと同じ組成の培地に対して０．２重量％のパラクレゾールを添加した培地３．５Ｌで５Ｌ容のジャー・ファーメンターを用いて、実施例３と同様の培養条件で２日間エンテロバクター・クロッカエ ＩＦＯ １３５３５を培養した。 ２日後に菌体を、８，０００×Ｇで、２０分間遠心分離することによって集菌した。 菌体収量は、１０５
℃、２時間乾燥で４．０ｇ／Ｌであった。 集菌した生菌体全量を０．２％の生理食塩水５００ｍＬに懸濁し、これにパラクレゾール１．５ｇを添加して３０℃で弱く攪拌しながら２時間反応させた。 反応終了後、実施例３と同様の方法によりパラヒドロキシ安息香酸を抽出し、精製して再結晶によりパラヒドロキシ安息香酸１．５ｇを得た。 収率は７８．３％であった。

【００２６】

【発明の効果】本発明の方法により、従来は高温・高圧の反応で化学合成されていた防腐剤、医薬品、農薬、染料、液晶などの原料として有用なパラヒドロキシ安息香酸をエネルギーをほとんど要せずに微生物酸化によってパラクレゾールから安価に製造することができる。