技术领域
[0001] 本
发明涉及的是一种中药
节肢动物鉴别的技术领域，尤其涉及的是一种大小斑蝥粉末分子鉴别方法。
背景技术
[0002] 斑蝥，一种中药，为芫青科昆虫南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黄黑小斑蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥体。夏季或秋季时，捕捉大斑蝥或小斑蝥，处死后晒干制得。具有破血逐瘀，散结消瘸，攻毒蚀疮之功效，主治症瘕，经闭，顽癣，瘰疬，赘疣，痈疽不溃，恶疮死肌。
[0003] 南方大斑蝥呈长圆形，长1.5～2.5cm，宽0.5～1cm，头及口齐向下垂，有较大的复眼和触
角个1对，触角多已脱落，背部具革质鞘翅1对，黑色，有3条黄色或棕黄色的横纹；鞘翅下面与
薄膜状的内翅2片，胸腹部乌黑色，胸部有足3对。有特殊的臭气。黄黑小斑蝥相比较南方大斑蝥的体形小，长约1～1.5cm。
[0004] 传统的昆虫鉴别方法通常采用大小、体色、触角、头等形态特征进行鉴别，这种鉴别方式仅针对较为完整的个体。目前很多中药原药都被加工成粉末，以方便后续中药制剂的加工使用，因此，传统的形态学鉴别方法显然已经不适用了。
[0005] 对于加工成粉末的中药斑蝥，目前常用的检测方法为化学法测定粉末中斑蝥素，具体方法包括：将粉末用氯仿浸泡提取斑蝥素，滤液蒸干后的残渣用石油醚清洗，再用氯仿溶解，作为供试品溶液，另取斑蝥素，氯仿溶解配置成对照品溶液。然后通过薄层色谱法检测斑点，若供试品色谱与对照品色谱的相应
位置都显示有相同
颜色的斑点，说明粉末中含有斑蝥素，该样品为中药斑蝥。但由于大小斑蝥都可以作为中药使用，且两者都含有斑蝥素，因此，该化学方法仅能够鉴定真伪斑蝥，但无法将大小斑蝥区分开。
[0006] 陈俊华等人在1994年公开了一种大斑蝥和小斑蝥粉末显微鉴别方法，并具体公开了大斑蝥和小斑蝥的显微结构。该对比文件主要针对的是昆虫干燥体自然
破碎情况，通过观察粉末中残留组织的显微形态，对大小斑蝥进行区分。但是，随着科技的进步，尤其是近年来超微
粉碎技术在中药制剂领域的推广，已经破坏了细胞组织的特征，通过传统显微技术从外形上鉴别，显然已经无法适用。
[0007] 目前，中药分子鉴定技术为中成药鉴定提供了一种新的方法，DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受外界因素和
生物体发育等影响，因此，用生物体本身的遗传标记进行鉴定，则更为的准确可靠。如中国
专利文献ZL201110028117.7公开的一种土鳖虫药材及活血止痛胶囊中土鳖虫的分子鉴定方法，通过鉴定土鳖虫16SrRNA实现土鳖虫中药材的真伪鉴定。
[0008] EF-1α蛋白是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体
蛋白质，在蛋白质合成过程中起重要作用，真核生物延伸生长因子EF-1α基因在蛋白石翻译过程中起着重要作用，其序列具有高度保守性，是一种管家基因。魏久锋在研究生论文中公开了一种基于核基因EF-1α的盾蚧亚科7属的分子系统学研究，并得出了以EF-1α为目的基因鉴定盾蚧亚科不同属昆虫的可能。
发明内容
[0009] 本发明的目的在于克服
现有技术的不足，开发了一种大小斑蝥粉末分子鉴别方法，以提供一种能够辨别中药斑蝥粉末真伪及大小斑蝥鉴定的方法。
[0010] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0011] 一种大小斑蝥粉末分子鉴别方法，该方法以斑蝥EF-1α基因为分子标记基因进行分子鉴定，包括以下步骤：
[0012] 步骤1.提取待检测中药斑蝥粉末的总RNA，并反转录成cDNA；
[0013] 步骤2.根据斑蝥EF-1α基因序列设计特异性扩增引物，以步骤1的cDNA为模板进行PCR扩增，获得PCR产物，斑蝥EF-1α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，GenBank登录号为JQ180220.1，该基因从133位点开始编码蛋白，编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，所述PCR产物为斑蝥EF-1α基因
片段，长度为n(bp)；值得注意的是，若该步骤无法获得目的片段，则说明该样品为假斑蝥，以此实现斑蝥的真伪鉴定；
[0014] 步骤3.利用HindⅢ酶切步骤2的PCR产物，
电泳检测酶切产物：
[0015] i)若PCR产物被HindⅢ酶切成了2条条带，则为大斑蝥；
[0016] ii)若PCR产物无法被HindⅢ酶切，即仅有PCR产物本身的1条条带，则为小斑蝥。
[0017] 进一步优选地，以距离EF-1α基因序列的第336位点上游200bp以上的序列为模板设计上游引物，以距离EF-1α基因序列的第336位点下游200bp以上的序列为模板设计下游引物，且EF-1α基因序列的第336位点的上游扩增产物与下游扩增产物的长度差≥100bp，这样控制酶切产物长度在200bp以上，酶切后酶切位点上下游条带长度差在200bp以上，差异显著，易于区分。
[0018] 进一步优选地，所述特异性扩增引物为：
[0019] SEQ ID NO.3：上游引物：ggtactggtgaatttgaagccggt
[0020] SEQ ID NO.4：下游引物：tatacccttaggattttcttcagttgttttacca
[0021] 该特异性扩增引物可扩增获得EF-1α基因全长，即n＝828，大斑蝥酶切产物包括一长度335bp和一长度489bp共计2条条带(HindⅢ酶切位点位于第335-340位)，小斑蝥无法用HindⅢ酶切，因此仅有一条828bp长度的条带。
[0022] 进一步优选地，所述PCR扩增条件为：98℃预变性10min，98℃变性10s，64℃
退火5s，72℃延伸50s，共35个循环后，再72℃继续延伸5min，获得PCR产物。
[0023] 进一步优选地，所述电泳检测的方法为琼脂糖凝胶电泳检测或聚丙烯酰胺(SDS)凝胶电泳检测。
[0024] 本发明的原理为：EF-1α基因作为真核生物的管家基因，具有高度保守性，但不同属的生物体中EF-1α之间存在差异，故可用于不同属的鉴定。本发明通过大小斑蝥EF-1α基因序列之间的差异开发分子标记，发现小斑蝥EF-1α基因在第336位点上发生了突变，核苷酸由A突变为G，但该位点所编码的
氨基酸未发生突变，仍然为谷氨酸Glu。突变前该位点位于HindⅢ酶切位点处，且大斑蝥的EF-1α基因仅有一个HindⅢ酶切位点，当该酶切位点的
碱基发生突变，就无法被HindⅢ内切酶识别，为一种理想的分子标记位点，并以此开发了本发明的鉴别方法。
[0025] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种大小斑蝥粉末分子鉴别方法，该方法利用大小斑蝥EF-1α基因的差异，以EF-1α基因的第336位点的差异突变开发分子标记鉴定方法，该方法可以鉴定斑蝥真伪并区分大小斑蝥，克服了现有化学方法仅能判别真伪，而显微方法无法判别大小斑蝥粉末的技术
缺陷，检测率可达100％。
附图说明
[0026] 图1为用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4引物扩增获得的斑蝥EF-1α基因片段琼脂糖凝胶电泳图；
[0027] 图2为不同斑蝥粉末样本的酶切产物琼脂糖凝胶电泳图；图中，M为mark2000，1-10为测试样本。
具体实施方式
[0029] 1、材料
[0030] 本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的
试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
[0031] 2、方法
[0032] 步骤1.提取待检测斑蝥粉末的总RNA，并反转录成cDNA；
[0033] 总RNA提取步骤包括：
[0034] 步骤1.1.取30-40mg待检测斑蝥粉末，加入500μL的裂解液，充分混匀后，加入20μL浓度为10mg/mL的蛋白酶K溶液，56℃恒温
水浴过夜；
[0035] 步骤1.2.在步骤1.1水浴后的样品中加入等体积的25：24：1体积比的酚：氯仿：异戊醇
混合液，混匀，4℃下12000rpm离心5min；
[0036] 步骤1.3.取上清，加入24：1体积比的氯仿：异戊醇混合液，混匀，4℃下12000rpm离心5min；
[0037] 步骤1.4.取上清，加入等体积的70％体积比的预冷的异丙醇，混匀，4℃下放置30min，4℃下12000rpm离心5min；
[0038] 步骤1.5.去上清，沉淀用预冷的70％体积比的
乙醇洗涤2-3次，吸去乙醇，静止使残余的乙醇挥发，获得沉淀，即为斑蝥粉末总RNA，将总RNA用DEPC水溶解，置于-20℃下保存备用。
[0039] 利用反转录
试剂盒，将总RNA反转录成cDNA，备用。
[0040] 步骤2.根据NCBI公开的斑蝥EF-1α基因序列，利用生工
生物工程(上海)股份有限公司的在线引物设计平台，设计可扩增EF-1α基因全长的特异性扩增引物，如下所示：
[0041] SEQ ID NO.3：上游引物：ggtactggtgaatttgaagccggt
[0042] SEQ ID NO.4：下游引物：tatacccttaggattttcttcagttgttttacca
[0043] 该特异性扩增引物理论上可扩增获得828bp长度的EF-1α基因全长序列。
[0044] 以步骤1的cDNA为模板，利用特异性扩增引物进行PCR扩增，获得PCR产物。
[0045] PCR扩增体系：
[0046]
[0047] PCR扩增程序：
[0048] 98℃预变性10min，98℃变性10s，64℃退火5s，72℃延伸50s，共35个循环后，再72℃继续延伸5min，获得PCR产物。
[0049] 利用2％
质量比的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，图中PCR产物长度与理论长度大小一致，说明获得了目的片段。若未获得理论大小的目的条带，或无PCR产物条带，说明该样品为假斑蝥，故不再进行下一步的酶切检测环节。
[0050] 利用PCR回收试剂盒回收PCR产物，获得长度为828bp的斑蝥EF-1α基因片段。
[0051] 步骤3.用SphⅠ酶切步骤2的PCR产物，获得酶切产物，利用2％质量比的琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物：
[0052] i)若PCR产物被HindⅢ酶切成了2条条带，即获得一长度335bp和一长度489bp的2条条带，则为大斑蝥；
[0053] ii)若PCR产物无法被HindⅢ酶切，即仅有PCR产物本身的828bp的1条条带，则为小斑蝥。
[0054] 为验证本发明分子鉴定的有效性，取已知大小斑蝥中药粉末各5份，标记类型后打乱标号，获得1-10份样品，利用上述分子鉴定方法鉴定该10份样品的类型。酶切结果如图2所示(2％质量比琼脂糖凝胶电泳)，图中可以看出，5份大斑蝥(样2、3、4、6、8)的酶切结果为大小2条条带，且与预测的335bp和489bp长度吻合，5份小斑蝥(样1、5、7、9、10)的酶切结果为1条条带，且与预测的828bp长度吻合，10份样品全部检出，该验证结果说明了本发明的分子鉴定方法是有效的，且检出率达100％。
[0055] 以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
