磺胺嘧啶对感染Wolbachia的短管赤眼蜂生殖行为中的应用
阅读：852发布：2020-05-14
专利汇可以提供磺胺嘧啶对感染Wolbachia的短管赤眼蜂生殖行为中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了磺胺嘧啶对在感染Wolbachia的短管赤眼蜂生殖行为中的应用。本发明提供了磺胺嘧啶在清除动物体内共生Wolbachia或降低Wolbachia滴度中的应用。本发明首次发现单独使用含有1.0mg/ml磺胺嘧啶的蜂蜜 水 饲喂短管赤眼蜂，能够很好的去除短管赤眼蜂携带的Wolbachia，这种方法更方便、省时，并且获得完全雄性后代。这将为进一步利用Wolbachia调控 节肢动物 生殖方式奠定 基础 ，有很好的应用价值和推广意义。，下面是磺胺嘧啶对感染Wolbachia的短管赤眼蜂生殖行为中的应用专利的具体信息内容。
1.磺胺嘧啶在清除动物体内共生Wolbachia或降低Wolbachia滴度中的应用。
2.磺胺嘧啶在制备清除动物体内共生Wolbachia或降低Wolbachia滴度的药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述动物为节肢动物门动物或线虫动物门动物。
4.磺胺嘧啶在恢复共生Wolbachia引起的节肢动物生殖行为改变中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述生殖行改变为导致宿主的胞质不相容、诱导孤雌生殖、导致雄性基因的雌性化、雄性致死或增强繁殖力中的一种或几种。
6.磺胺嘧啶在消除或减弱共生Wolbachia引起的线虫生长发育和生殖的促进或增强作用。
7.磺胺嘧啶在制备无感染Wolbachia动物中的应用。
8.磺胺嘧啶在制备由线虫寄生引起的病害或疾病的药物的应用。
9.一种对携带Wolbachia的短管赤眼蜂获得完全雄性后代的方法，其特征在于，对短管赤眼蜂饲喂磺胺嘧啶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，使用含有1.0mg/ml磺胺嘧啶的蜂蜜水饲喂短管赤眼蜂不少于24h。
磺胺嘧啶对感染Wolbachia的短管赤眼蜂生殖行为中的应用
技术领域
背景技术
[0002] Wolbachia是一种常见的细胞内共生菌，昆虫、螨类等节肢动物和线虫中都有较高的感染率。研究显示，根据已有报道的数据，通过模型估算认为，自然界中的节肢动物有66％都感染了Wolbachia。长期的进化过程中，Wolbachia拥有了以下调控宿主生殖方式的能力：导致宿主的胞质不相容、诱导孤雌生殖、导致雄性基因的雌性化、雄性致死、增强繁殖力，以有利于自身的生存和传播，而对宿主的繁衍存在负面的影响。
[0003] 赤眼蜂(Trichogramma Westwood)隶属于膜翅目赤眼蜂科的一种寄生性昆虫，赤眼蜂属一共包括180多种，是生物防治中使用最广的一类天敌昆虫。赤眼蜂为卵寄生蜂，幼虫在蛾类的卵中寄生，因此可用以进行生物防治。研究报道赤眼蜂已成功地用来防治各种鳞翅目林农害虫。例如：在玉米田可寄生玉米螟、黏虫、条螟、棉铃虫、斜纹夜蛾、地老虎和松毛虫等鳞翅目害虫。
[0004] 赤眼蜂的性别决定为单倍/双倍体型。无雌雄交配条件下，产生单倍体的雄蜂。有雌雄交配条件下，产生双倍体的雌蜂。但一些赤眼蜂在感染Wolbachia后，会产生由产雄孤雌生殖转变为产雌孤雌生殖。由于在生产应用上，仅饲养雌蜂比饲养两种性别的赤眼蜂会节约更多的生产成本。而且在田间释放时，具有产雌孤雌生殖能力的赤眼蜂更利于建立田间种群，因此一直想获得一种稳定的产雌孤雌的赤眼蜂品系。利用Wolbachia对赤眼蜂生殖调控具有更节约、更高效的优势。为了改变赤眼蜂体内的Wolbachia滴度或去除赤眼蜂体内Wolbachia从而改变赤眼蜂的生殖模式，最常用的方法是高温(>30℃)和抗生素的运用。高温会降低赤眼蜂体内的滴度，导致产雌孤雌生殖的赤眼蜂在其后代中产生雄蜂或雌雄相嵌体。但是高温通常也会降低赤眼蜂的存活率及产卵量。
[0005] 感染了Wolbachia短管赤眼蜂(Trichogramma pretiosum)就是由产雄孤雌生殖转变为产雌孤雌生殖。目前短管赤眼蜂的基因组及其体内感觉的Wolbachia基因组都已经公布，但是Wolbachia对短管赤眼蜂孤雌产雌的调控机制仍待研究。其中一个最关键的问题是获得阴性的无感染Wolbachia孤雌产雄短管赤眼蜂品系作为阴性对照是一系列研究的必要条件。只有获得了阴性的无感染Wolbachia短管赤眼蜂品系，才有可能研究清楚Wolbachia对短管赤眼蜂从孤雌产雄转为孤雌产雌生殖行为调控现象的机制，进而利用Wolbachia对节肢动物的调控来控制节肢动物的生殖模式。在之前的报道有利用四环素和高温分别对多种赤眼蜂体内的Wolbachia进行处理，以消除其体内的Wolbachia，获得阴性的无感染Wolbachia赤眼蜂品系。但是多人多个实验室的实验结果表明，四环素和高温并不能完全去除短管赤眼蜂体内的Wolbachia或获得100％的孤雌产雄后代。因此目前缺乏一种安全的改变赤眼蜂体内的Wolbachia滴度或去除赤眼蜂体内Wolbachia方法，制约了相关研究的进展。
[0006] 此外，线虫动物是动物界中一个较大的类群，分布很广，自由生活种类在海水、淡水、土壤中都有，有的以藻类、真菌等为食，有的吃轮虫等；寄生种类寄生在人、动物和植物的体内，危害较大。其中，丝虫(filarial worm)是由节肢动物传播的一类线虫，其引起的丝虫病是指丝虫寄生在淋巴组织、皮下组织或浆膜腔所致的寄生虫病。研究表明，Wolbachia广泛的存在于丝虫体内，Wolbachia对丝虫的生长发育和生殖是必须的；Wolbachia还作用于哺乳动物宿主免疫系统，并通过引起包括中性粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞、在内的炎症反应而于丝虫病的致病原因相关。因此通过清除共生在线虫体内的Wolbachia将有利于防治由于线虫的寄生引起的动植物病害和疾病。
发明内容
[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供磺胺嘧啶对在感染Wolbach ia的短管赤眼蜂生殖行为中的应用。
[0008] 本发明的第一个目的是提供磺胺嘧啶在清除动物体内共生Wolbachia或降低Wolbachia滴度中的应用。
[0009] 本发明的第二个目的是提供磺胺嘧啶在制备清除动物体内共生Wolbachia或降低Wolbachia滴度的药物中的应用。
[0010] 本发明的第三个目的是提供磺胺嘧啶在恢复共生Wolbachia引起的节肢动物生殖行为改变中的应用。
[0011] 本发明的第四个目的是提供磺胺嘧啶在消除或减弱共生Wolbachia引起的线虫生长发育和生殖的促进或增强作用。
[0012] 本发明的第五个目的是提供磺胺嘧啶在制备无感染Wolbachia动物中的应用。
[0013] 本发明的第六个目的是提供一种对携带Wolbachia的短管赤眼蜂获得完全雄性后代的方法，
[0014] 为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
[0015] 发明人利用磺胺嘧啶对携带Wolbachia的短管赤眼蜂进行的去除Wolbachia，这种方法更方便、省时，并且获得完全雄性后代。
[0016] 因此本发明要求保护：
[0017] 磺胺嘧啶在清除动物体内共生Wolbachia或降低Wolbachia滴度中的应用；
[0018] 磺胺嘧啶在制备清除动物体内共生Wolbachia或降低Wolbachia滴度的药物中的应用。
[0019] 优选地，所述动物为节肢动物门动物或线虫动物门动物。
[0020] 优选地，所述节肢动物为短管赤眼蜂。
[0021] 磺胺嘧啶在恢复共生Wolbachia引起的节肢动物生殖行为改变中的应用。
[0022] 优选地，所述生殖行改变为导致宿主的胞质不相容、诱导孤雌生殖、导致雄性基因的雌性化、雄性致死或增强繁殖力中的一种或几种。
[0023] 优选地，所述节肢动物为短管赤眼蜂。
[0024] 磺胺嘧啶在消除或减弱共生Wolbachia引起的线虫生长发育和生殖的促进或增强作用。
[0025] 磺胺嘧啶在制备无感染Wolbachia动物中的应用。
[0026] 优选地，所述动物为节肢动物门动物或线虫动物门动物。
[0027] 优选地，所述节肢动物为短管赤眼蜂。
[0028] 一种对携带Wolbachia的短管赤眼蜂获得完全雄性后代的方法，对短管赤眼蜂饲喂磺胺嘧啶。
[0029] 优选地，使用含有1.0mg/ml磺胺嘧啶的蜂蜜水饲喂短管赤眼蜂不少于24h。
[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0031] 本发明单独使用含有1.0mg/ml磺胺嘧啶的蜂蜜水饲喂短管赤眼蜂，发现本发明能够很好的去除包括短管赤眼蜂在内的昆虫、螨类等节肢动物和线虫中都有较高的感染率的内生Wolbachia，这种方法更方便、省时，并且使得短管赤眼蜂获得完全雄性后代，消除Wolbachia对宿主的影响。这将为进一步利用Wolbachia调控节肢动物生殖方式奠定基础，有很好的应用价值和推广意义。
具体实施方式
[0032] 下面结合说明书具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0033] 1、供试昆虫
[0034] 试验短管赤眼蜂种群购自美国，经过雄外生殖器特征进行形态及ITS2基因测序进行分子鉴定(Stouthamer et al.,1998)。体内的Wolbachia利用wsp特异引物进行扩增及测序鉴定(Baldo et al.2006)。在恒温培养箱内25℃，相对湿度为70％-80％，光周期为16L：8D的条件下用米蛾卵Corcyra cephalonica繁殖赤眼蜂保种，经过多代饲养在本实验室稳定繁殖。
[0035] 2、试剂配制
[0036] 环丙沙星，磺胺嘧啶购于健阳生物公司。利用两种抗生素环丙沙星和磺胺嘧啶的三个浓度对短管赤眼蜂进行了处理，将环丙沙星、环丙沙星：磺胺嘧啶＝1：1、磺胺嘧啶分别用30％蜂蜜水稀释为0.1g/ml，10mg/ml，10mg/ml抗生素蜂蜜水。
[0037] 实施例1
[0038] 一、实验方法
[0039] 在体视镜下用小毛笔取出刚羽化的短管赤眼蜂雌蜂，单头放入指形管，分别饲喂三种抗生素蜂蜜水，并设置对照组，饲喂24h后放入不少于100粒已灭胚的新鲜米蛾卵卡进行寄生。寄生24h后用小毛笔挑出赤眼蜂放入离心管于-30℃保存，卵卡放入指形管继续放入气候箱培养，温度25℃,相对湿度80％～85％，光照条件L：D＝14:10。每个处理做三组重复。连续处理2代，记录每代处理米蛾卵变黑个数即赤眼蜂产卵量、雌性、雄性和雌雄镶嵌体个数，计算羽化率、雌雄性比。
[0040] 产卵量的计算：接蜂后的第7天计录下每张卵卡上变色(黑)的卵粒数作为单头雌蜂的产量卵。
[0041] 羽化率的计算：当小试管中出现成蜂开始记录所有羽化的成蜂头数。
[0042] 羽化率％＝成蜂数/产卵量×100作为羽化率。
[0043] 产雄率的计算：每代的蜂死亡后，在100倍体视镜下根据触角形态特征和腹部是否具有产卵器来区分雌雄：雄蜂触角毛较长，其中最长的触角毛是鞭节最宽处的2.5倍，作为雄性的主要外部形态特征。雌蜂触角毛较短，腹部具有产卵器。
[0044] 产雄率％＝雄性个体数/总羽化个体数×100。
[0045] 二、实验结果
[0046] 1、抗生素对短管赤眼蜂产卵量的影响
[0047] 从表1的分析结果来看，F0代的平均产卵量为18.67～47.67粒，F1代的平均产卵量为27.00～36.00粒。除了10.0g/ml环丙沙星∶磺胺嘧啶＝1∶1处理中，F1代的产卵量比F0代的产卵量显著要高以外，其它处理不同世代间产卵量没有显著差异。然页，从整体趋势来看，F1代的产卵量比F0代的产卵量要高。
[0048] F0代的结果中，单独使用环丙沙星处理结果中呈现浓度低的处理产卵量比浓度高的处理更高的产卵量。并且，与对照组相比，0.1g/ml和1g/ml的环丙沙星处理产卵量具有高的产卵量，差异显著。而环丙沙星∶磺胺嘧啶＝1∶1和磺胺嘧啶的六个处理中，与对照相比产卵量差异不显著。
[0049] F1代的结果中，与对照相比，所有抗生素处理后的产卵量都差异不显著。
[0050] 表1：抗生素对短管赤眼蜂产卵量的影响：
[0051]
[0052]
[0053] 2、抗生素对短管赤眼蜂羽化率的影响
[0054] 从表2的分析结果来看，除了F2世代中0.1g/ml的环丙沙星处理的羽化率(75.86％)显著地低于F1代的羽化率外，其它处理在不同世代间的羽化率没有显著差异。
[0055] 在同一世代不同抗生素处理结果来看，与对照相比，F1代所有处理羽化率差异不显著，达到77.73％以上。在F2代中，10mg/ml磺胺嘧啶和10mg/ml环丙沙星处理的羽化率显著(分别为95.38％和95.96％)地高于0.1mg/ml环丙沙星∶磺胺嘧啶＝1∶1的羽化率(75.86％)，但与对照处理相比，差异都不显著。结果显示，仅在0.1mg/ml环丙沙星∶磺胺嘧啶＝1∶1处理中体现出F2代的羽化率比F1代的羽化率显著偏低外，其它的处理或更高浓度的抗生素处理在不同世代间相比都不出现变化的显著差异。
[0056] 表2抗生素对短管赤眼蜂羽化率的影响：
[0057]
[0058]
[0059] 3、抗生素对短管赤眼蜂子代性别的影响
[0060] 抗生素对短管赤眼蜂产雄率的影响中能看出(表3)，在F1代中，所有的处理都不曾出现雄性个体。从F2代开始，低抗生素浓度的处理(0.1mg/ml环丙沙星∶磺胺嘧啶＝1∶1和0.1mg/ml磺胺嘧啶的处理)开始出现了雄性个体，并且当浓度达到1.0g/ml以上的处理中出现了100％的雄性后代。并且，0.1mg/ml的环丙沙星∶磺胺嘧啶＝1∶1处理中出现了雌雄相嵌体。但是环丙沙星经过6代的筛选仍然未能获得雄性的后代。结果显示，单独利用环丙沙星的处理就不能获得雄性个体；利用1.0mg/ml磺胺嘧啶或利用环丙沙星与磺胺嘧啶混用对携带的短管赤蜂进行处理后，在F2代就已经出现了100％的雄性个体。这表明，磺胺嘧啶能有效地去除短管赤眼蜂体内的Wolbachia，以达到100％雄性后代的产生。
[0061] 表3抗生素对短管赤眼蜂产雄率的影响：
[0062]
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