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一种生物 荧光探针及其在 农药检测中的应用

热词	敌敌畏 auncs lip 荧光探针溶液生物脂肪酶农药脂肪
专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查; 授权;
专利有效性	有效专利	当前状态	授权
申请号	CN202310058391.1	申请日	2023-01-17
公开(公告)号	CN116083080A	公开(公告)日	2023-05-09
申请人	北京大学;	申请人类型	学校
发明人	安丽华; 王宝娟; 房金鑫; 魏晓丽;	第一发明人	安丽华
权利人	北京大学	权利人类型	学校
当前权利人	北京大学	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：北京市	城市	当前专利权人所在城市：北京市海淀区
具体地址	当前专利权人所在详细地址：北京市海淀区颐和园路5号	邮编	当前专利权人邮编：100000
主IPC国际分类	C09K11/58	所有IPC国际分类	C09K11/58 ; C09K11/02 ; B82Y20/00 ; B82Y40/00 ; G01N21/64
专利引用数量	7	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	8	专利文献类型	A
专利代理机构	深圳国联专利代理事务所	专利代理人	常爱国;
摘要	本发明公开了一种生物荧光探针及其在农药检测中的应用，涉及荧光探针技术领域。本发明是以脂肪酶为模板，以氯金酸作为金属源，二者在碱性条件进行反应，反应结束后收集上清液即为本发明的生物荧光探针。本发明的生物荧光探针对样品中的敌敌畏具有较高的特异选择性以及高灵敏，能够克服现有农药检测的复杂性以及成本高、耗时长的问题，实现敌敌畏检测的可视化且高灵敏、定量检测。
权利要求	1.一种生物荧光探针，其特征在于，包括以下步骤制备而成： S1、称取摩尔比为1:2～5:2的脂肪酶和氯金酸，然后将脂肪酶溶解在水中得到0.5～ 3mM的脂肪酶溶液，将氯金酸溶解在水中得到10～50mM氯金酸水溶液；再将所述脂肪酶溶液与氯金酸水溶液混合均匀，得到混合溶液； S2、调整所述混合溶液的pH值为8～14，然后在温度为15～60℃下避光反应3～24h，离心收集上清液，即得到本发明所述生物荧光探针。 2.根据权利要求1所述生物荧光探针，其特征在于，步骤S2是采用氢氧化钠溶液调整所述混合溶液的pH值。 3.根据权利要求1所述生物荧光探针，其特征在于：所述的生物荧光探针在紫外灯下发出明亮红色荧光。 4.根据权利要求1所述生物荧光探针，其特征在于，所述的生物荧光探针在560nm的激发光下，于680nm处出现最大发射峰。 5.根据权利要求1所述的生物荧光探针在农药检测中的应用，其特征在于：所述生物荧光探针对食品中的农药进行检测，所述农药包括但不限于敌敌畏。 6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述生物荧光探针通过荧光比色法和/或可视化对农药进行检测。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生物荧光探针采用荧光比色法对食品中的农药进行检测时，检测样品的加标回收率为93.42％‑105.2％。 8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述食品包括但不限于水果和蔬菜。
说明书全文	一种生物荧光探针及其在农药检测中的应用技术领域 [0001] 本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种生物荧光探针及其在农药检测中的应用。背景技术 [0002] 敌敌畏(2,2‑二氯乙烯基磷酸二甲酯，Dichlorvos)是一种以有机磷为基础的合成农药，因其对昆虫DNA和神经系统的破坏而被广泛应用于农业保护、工业生产和家庭生活中。然而，食品中的敌敌畏残留会使人体内乙酰胆碱酯酶产生不可逆的抑制，导致乙酰胆碱的积累，进而造成头痛、胸闷、视物模糊、恶心、腹泻、惊厥等症状。 [0003] 目前，敌敌畏残留的检测方法包括气相色谱法、高效液相色谱法、表面增强拉曼光谱法、酶抑制生物传感器等，但它们复杂、耗时、需要昂贵精密的仪器，限制了它们的进一步应用。因此，建立一种简便、灵敏的敌敌畏农药残留检测方法是亟待解决的问题。 [0004] 近年来，金纳米团簇(AuNCs)由于其独特的光电和光致发光特性，在化学传感和生物探测领域具有巨大的应用潜力。蛋白质模板的AuNCs具有制备简单、生物相容性好等优点，是生物传感和生物成像领域很有前景的发光探针。如何将具有高效催化活性、底物选择性等优良性能的生物蛋白酶与金纳米团簇优越的光学性能相结合，制备新型生物传感器值得探索。脂肪酶(lipase,Lip)是一类催化甘油三酯水解生成游离脂肪酸和甘油的酰基水解酶，目前被广泛应用于食品工业、能源开发、医学和化工领域这种新型生物传感器具有酶的特异性、生物相容性和对纳米材料检测的便捷性。但是，目前尚未有以脂肪酶为模板合成金属纳米簇的相关研究。本专利创新性的合成了以脂肪酶为模板的金纳米簇，并进一步开发了其在农药检测领域中的应用。发明内容 [0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种生物荧光探针及在农药检测中的应用。本发明提供的生物荧光探针，以脂肪酶(Lip)为模板，氯金酸作为金属源，通过简易、快速的生物矿化法合成红色荧光金纳米簇(Lip‑AuNCs)。本发明制备的生物荧光探针可以有效解决现有敌敌畏检测操作复杂，仪器昂贵、检测耗时等缺点。本发明还提供了Lip‑AuNCs的应用，其可用于食品中敌敌畏的检测。本发明将Lip‑AuNCs用于敌敌畏残留的检测，利用敌敌畏猝灭Lip‑AuNCs荧光的特性，通过荧光比色法检测敌敌畏残留，进一步开发了荧光可视化方法对样品中的敌敌畏残留进行检测，通过将该纳米簇直接滴加于样品，在紫外暗箱中观察荧光亮度即可得知溶液中敌敌畏的浓度。 [0006] 本发明是采用以下技术方案实现的： [0007] 一种生物荧光探针其包括以下步骤制备而成： [0008] S1、称取摩尔比为1:2～5:2的脂肪酶和氯金酸，然后将脂肪酶溶解在水中得到0.5～3mM的脂肪酶溶液，将氯金酸溶解在水中得到10～50mM氯金酸水溶液；再将所述脂肪酶溶液与氯金酸水溶液混合均匀，得到混合溶液； [0009] S2、调整所述混合溶液的pH值为8～14，然后在温度为15～60℃下避光反应3～24h，离心收集上清液，即得到本发明所述生物荧光探针。 [0010] 优选的，步骤S2是采用氢氧化钠溶液调整所述混合溶液的pH值。同时本发明对氢氧化钠水溶液的浓度不作特殊限定。在一些实施例中，本发明所采用的氢氧化钠溶液的浓度为1M。 [0011] 优选的，本发明所述的生物荧光探针在紫外灯下可以发出明亮红色荧光。 [0012] 优选的，本发明所述的生物荧光探针在560nm的激发光下，于680nm处出现最大发射峰。 [0013] 本发明还提供了所述生物荧光探针在农药检测中的应用，具体是利用所述生物荧光探针对食品中的农药进行检测。 [0014] 优选的，所述生物荧光探针通过荧光比色法和/或可视化对农药进行检测。 [0015] 优选的，所述生物荧光探针采用荧光比色法对食品中的农药进行检测时，检测样品的加标回收率为93.42％‑105.2％。 [0016] 本发明所制备的Lip‑AuNCs在敌敌畏检测中的应用，其应用范围为包括但不限于食品中敌敌畏浓度的检测，比如各种水果和蔬菜等；所述水果可以为橘子、梨和苹果等。所述蔬菜可以为蘑菇、卷心菜和西红柿等。 [0017] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： [0018] 本发明所述的荧光金纳米簇制备工艺简单、绿色，具有明显的红色荧光。本发明的Lip‑AuNCs有良好的生物相容性，并且对敌敌畏具有高选择性和敏感性，兼具荧光比色法和可视化检测双功能。本发明的Lip‑AuNCs可应用于水果和蔬菜等食物样品中敌敌畏的检测。该检测方法简便，特异性强，检测样品用量少，检测成本低，可带来一定的经济效益，促进了检测方法的发展。附图说明 [0019] 图1为实施例1所制生物荧光探针的荧光激发发射图； [0020] 图2为实施例1所制生物荧光探针的紫外‑可见吸收光谱图； [0021] 图3为实施例1所制生物荧光探针检测不同农药的荧光光谱图； [0022] 图4为实施例1所制生物荧光探针检测不同浓度敌敌畏的荧光光谱图； [0023] 图5为实施例1所制生物荧光探针检测不同浓度敌敌畏的相对荧光强度变化曲线； [0024] 图6为实施例1所制生物荧光探针检测卷心菜中敌敌畏的可视化检测图； [0025] 图7为实施例1所制检测卷心菜敌敌畏残留的相对荧光强度图。 [0026] 具体事例 [0027] 下面结合说明书附图介绍本发明的较佳实施例，举例证明本发明可以实施，通过向本领域中的技术人员完整介绍本发明，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，其保护范围并非仅限于文中提到的实施例，本文的附图和说明本质上是举例说明而不是限制本发明。 [0028] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。 [0029] 脂肪酶购自Sigma公司，由米曲霉发酵生产，其它所用的原材料、试剂和设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 [0030] 下面结合实施例对本发明做详细的说明。 [0031] 实施例1 [0032] 一种生物荧光探针，其制备方法如下： [0033] S1、称取摩尔比为5:2的脂肪酶和氯金酸，然后将脂肪酶溶解在超纯水中得到1mM的脂肪酶溶液，将氯金酸溶解在水中得到25mM氯金酸水溶液；再将所述脂肪酶溶液与氯金酸水溶液混合，在涡旋器上震荡10min，得到混合溶液； [0034] S2、在所述混合溶液中加入1M NaOH，以调整混合溶液的pH值至11，然后在温度为37℃下避光反应12h，最后8000rpm离心10min后收集上清液，即得到本发明所述生物荧光探针，Lip‑AuNCs。 [0035] 实施例2 [0036] 按照实施例1的制备方法，仅调整步骤S1中反应摩尔比换成1：2，步骤S2中pH换成8，反应时间为24h，其余条件均不改变，从而制得一种生物荧光探针。 [0037] 实施例3 [0038] 按照实施例1的制备方法，仅调整步骤S2中反应温度为15℃，反应时间为20h，其余条件均不改变，从而制得一种生物荧光探针。 [0039] 实施例4 [0040] 按照实施例1的制备方法，仅调整步骤S2中反应温度为60℃，反应时间为3h，其余条件均不改变，从而制得一种生物荧光探针。 [0041] 实施例5对脂肪酶溶液以及实施例1制备的Lip‑AuNCs荧光光谱的表征[0042] 称取1mL 1mM的脂肪酶(Lip)溶液以及1mL实施例1制备的生物荧光探针(Lip‑AuNCs)，分别置于离心管中，采用暗箱式紫外分析仪观察二者的荧光特性。 [0043] 结果表明：在305nm紫外灯照射下，Lip溶液无荧光现象，实施例1所制的Lip‑AuNCs溶液发射出强烈的红色荧光；在可见光照射下，Lip溶液和实施例1所制的Lip‑AuNCs溶液均呈无色透明。 [0044] 取实施例1所制的Lip‑AuNCs溶液放入比色皿中，使用RF‑5301荧光分光光度计测量Lip‑AuNCs溶液的最大激发光谱和最大发射光谱，结果表明该物质最大激发波长和最大发射波长分别为560nm和680nm(如图1所示)。 [0045] 实施例6对脂肪酶溶液以及实施例1制备的Lip‑AuNCs紫外光谱的表征称取1mL 1mM的脂肪酶(Lip)溶液以及1mL实施例1制备的生物荧光探针(Lip‑AuNCs)分别置于比色皿中，使用紫外分光光度仪UV‑1800检测二者的紫外光谱。 [0046] 结果表明：本发明Lip‑AuNCs溶液在250‑350nm范围具有较宽的吸收图谱，而Lip溶液在此处没有最大吸收(如图2所示)。 [0047] 实施例7：本发明Lip‑AuNCs生物荧光探针对不同农药的检测 [0048] 用甲醇溶液(高效液相色谱级别)分别配制浓度为100μg/mL的毒死蜱、异丙威、溴氰菊酯和敌敌畏标准品，用丙酮溶液配制浓度为100μg/mL的高效氟氯氰菊酯标准品；分别称取100μL上述标准品，在每个标准品中分别加入125μL实施例1所述Lip‑AuNCs和775μL超纯水(总计为1mL的混合溶液)； [0049] 分别将上述待检测的混合溶液在25℃水浴5min后，使用RF‑5301荧光分光光度计，在激发光波长为560nm的条件下，分别检测各混合溶液在680nm发射光的荧光强度，并与空白对照组(125μL实施例1所述Lip‑AuNCs和875μL超纯水)进行比较(I0为空白对照组的荧光强度，I为各农药与Lip‑AuNCs反应后的荧光强度)。 [0050] 如图3所示，与毒死蜱、异丙威、溴氰菊酯、高效氟氯氰菊酯标准品反应时，Lip‑AuNCs荧光强度基本保持不变，均在0.97以上，只有与敌敌畏标准品反应时，其荧光发生猝灭现象。 [0051] 结果表明例1所制的Lip‑AuNCs对敌敌畏具有高度选择性，因此可进一步探究本发明所制的生物荧光探针在敌敌畏检测中的应用。 [0052] 实施例8本发明Lip‑AuNCs生物荧光探针对不同浓度敌敌畏标准品的检测[0053] 用甲醇溶液(高效液相色谱级别)分别配制敌敌畏浓度为3×105ng/L、4×105ng/L、5 5 5 5 5 6 5.5×10 ng/L、6×10 ng/L、7×10 ng/L、8×10 ng/L、9×10 ng/L、1×10 ng/L、1.25× 6 6 6 6 6 6 10 ng/L、1.35×10 ng/L、1.5×10ng/L、1.75×10ng/L、2.5×10 ng/L、3×10 ng/L、5× 6 6 6 7 10ng/L、6×10ng/L、7×10ng/L、1×10ng/L的敌敌畏溶液(待测标准品)； [0054] 分别称取100μL上述标准品，在每个标准品中分别加入125μL实施例1所述Lip‑AuNCs和775μL超纯水(总计为1mL的混合溶液)； [0055] 分别将上述待检测的混合溶液在25℃水浴5min后，使用RF‑5301荧光分光光度计，在激发光波长为560nm的条件下，分别检测各混合溶液在680nm发射光的荧光强度。 [0056] 如图4所述，Lip‑AuNCs的荧光强度随混合溶液中敌敌畏浓度的增大而降低，其相2 对荧光强度线性检测方程为y＝0.481x+0.910(R ＝0.987)，其检测敌敌畏的线性范围为 5 7 4 3.0×10‑1.0×10ng/L，检测限为2.6×10ng/L(如图5所示)。 [0057] 结果表明实施例1所制的Lip‑AuNCs对敌敌畏具有高度敏感性，因此本发明所制的生物荧光探针可用于分析检测实际样品中敌敌畏的含量。 [0058] 实施例9利用本发明的生物荧光探针检测果蔬样品中的敌敌畏含量[0059] (1)制备六种待测样品 [0060] 分别从超市购买水果样品(橘子、梨、苹果)和蔬菜样品(卷心菜、蘑菇、西红柿)。将样品切碎并在研钵中研磨成固液混合状态，随后转移至离心管中。静置一段时间后吸取上方溶液10,000rpm离心10min，上清液通过0.45mm滤膜过滤，最后将滤液稀释100倍后用于敌敌畏的检测实验。 [0061] (2)六种待测样品中敌敌畏的检测： [0062] 分别称取100μL待测样品，并加入125μL实施例1所制Lip‑AuNCs溶液和775μL超纯水，制成1mL待测混合溶液； [0063] 分别将待测混合溶液体系于25℃水浴5min后，采用RF‑5301荧光光度计，在激发光波长为560nm的条件下，检测待测混合溶液在680nm发射光的峰高；将测试结果利用实施例5绘制的标准曲线进行计算，重复3次后。经检测，上述六种样品中敌敌畏浓度均为0mg/mL。 [0064] (3)检测加标回收率： [0065] 在上述六种待测样品中分别加入敌敌畏，制成0.3μg/mL、0.4μg/mL和0.55μg/mL敌敌畏含量的待测样品； [0066] 分别称取100μL加入敌敌畏的待测样品，并加入125μL实施例1所制Lip‑AuNCs溶液和775μL超纯水，制成1mL待测混合溶液； [0067] 将待测混合溶液体系25℃水浴5min，荧光分光光度计的检测方法及使用仪器均与步骤(2)上相同，即在激发光波长为560nm的条件下，检测溶液在680nm发射光的峰高，实验独立重复3次。 [0068] 检测结果如表1所示。可以看出在果蔬待测样品中加入不同浓度系列的敌敌畏后，利用本发明的荧光探针能够准确检测敌敌畏的浓度。同时敌敌畏的加标回收率为93.42％‑105.2％。 [0069] 其中，加标回收率＝测定样品敌敌畏含量/加标量×100％ [0070] 表1采用荧光比色法对加入敌敌畏的实际样品中的检测结果 [0071] [0072] [0073] 实施例10：实施例1所制的Lip‑AuNCs对实际样品的可视化检测 [0074] 为了更方便的使用Lip‑AuNCs检测敌敌畏的含量，对蔬菜表面敌敌畏残留进行可视化检测。先将含有不同浓度的敌敌畏注射入蔬菜表面模拟敌敌畏污染。然后，将Lip‑AuNCs滴于蔬菜表面并采用暗箱式紫外分析仪观察它们的荧光特性。如图6、7显示，在卷心菜表面红色荧光强度随敌敌畏浓度增加而降低，表明该荧光生物传感器在农药的可视化检测中具有优良的应用前景。 [0075] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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