本发明涉及一种提取微孢子虫DNA的方法，属于微孢子虫分子诊断、鉴定技术领域。

微孢子虫是一种无线粒体的单细胞原生动物，细胞内寄生。自上个世纪发现引起家蚕毁灭性病害的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)之后，在许多真核生物中都发现有微孢子虫的寄生。由于其与动物及人类的健康关系密切，引起了广泛研究兴趣。而微孢子虫的分子生物学研究尤其具有重要的生物学意义和经济意义。其一方面有利于丰富生物种群，为生物防治提供较好的资源；同时有助于探讨检测蚕感染微孢子的实用技术，提高蚕种检疫的质量，对家蚕微粒子病的防治具有重要的科学意义。
目前有关PCR技术用于微孢子虫感染，特别是蚕蛾、蚕卵感染的分子诊断研究已有报道。其关键技术是高质量模板DNA的获得。模板DNA是PCR反应的初始底物，尽管用量极少(至少104DNA分子)，但对PCR产物的特异性、产量都有重要影响。由于昆虫微孢子虫孢子外被坚硬的几丁质和外壳蛋白质层组成孢子壁，不易破裂，用常规的酚/氯仿法很难提取到足够量的微孢子虫模板DNA。目前的方法大多数是先通过一些化学物质的处理，让孢子发芽弹出孢原质，或者让孢子破壁，然后再粗提DNA。这些成功的方法主要有：钾离子在碱性条件下的裂解法、液氮研磨法、玻璃珠研磨法、CTAB(Hexadecyl trimethyl-ammonium bromide，C16H33N(CH3)3Br，简称CTAB)法等。特别是应用钾离子在碱性条件下的裂解法在家蚕微孢子虫研究方面比较多，如KOH法(Ishihara et al.，1968)、H2O2+KCl法(Iwano et al.，1979)、KOH+EDTA法(潘敏慧等，2001)、KCl法、K2CO3法、KHCO3+K2CO3法、SDS-蛋白酶K法等等(陈秀，1997)。但这些方法普遍存在提取步骤复杂、操作时间长(一般需要4-7小时)，限制了其在实际生产中的大规模应用。

本发明在比较国内外各种微孢子虫抽提方法的基础上，建立了一种快速提取微孢子虫DNA的方法。
本发明的技术方案，首先配制含有KCl的碱性裂解液，使用前在110-126℃温箱内孵育15-30分钟，备用。然后取100μL裂解缓冲液加入1.5mL离心管后，加入100μL待提取的样品，混匀。沸水浴5-15分钟后，13,000rpm离心10分钟，取上清液即为微孢子虫核酸模板DNA。上清液可以直接作为PCR检测反应的模板DNA。裂解后的DNA样品保存在-20℃。每次重复实验前，都要将样品以13,000rpm/分钟，离心10分钟后取用。
按照本发明，含有KCl的碱性裂解液配制方法如下：900mL所说的裂解液含有9mL 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)、1.8mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)、18mL 5mol/L KCl、90mL 1％Tritonx-100，其余体积用水补足。
本发明之微孢子虫DNA提取方法适用于蜜蜂微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢子、感染家蚕微孢子虫孢子的蚕蛾组织或者小菜蛾微孢子虫等材料。
有益效果本发明使用煮沸法能够有效地提取到微孢子虫DNA。操作简单，操作过程只需15分钟左右。同时本发明方法的另一显著效果是适用范围广，可用于多种微孢子虫DNA的提取，如蜜蜂微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢子、感染家蚕微孢子虫孢子的蚕蛾组织或者小菜蛾微孢子虫等。使用本发明方法制备的DNA样品能够满足PCR方法对微孢子虫进行分子诊断的需要。
附图说明
图1以煮沸法及其他两种方法(常规法和CTAB法)提取的DNA为模板的PCR反应电泳检测结果。其中A：常规方法提取的DNA的PCR电泳检测结果；B：CTAB法提取的DNA的PCR电泳检测结果；C：煮沸法提取的DNA的PCR电泳检测结果。泳道1：蜜蜂微孢子虫；2：斜纹夜蛾微孢子虫；3：家蚕微孢子虫孢子；4：感染家蚕微孢子虫孢子的蚕蛾组织研磨液；5：小菜蛾微孢子虫；图中Nb为阳性对照；M和M1均为自制的标准DNA Marker，其中M1为400bp的酶切片段，用作阳性对照。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1以煮沸法及其他两种方法(常规法和CTAB法)提取的DNA为模板进行微孢子虫的PCR分子检测以蜜蜂微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、家蚕微孢子虫孢子、感染家蚕微孢子虫孢子的蚕蛾组织研磨液和小菜蛾微孢子虫的孢子悬浮液为材料，分别通过本发明的煮沸法、已报道的常规法(Terry R.S.；Smith J.E.；Bouchon D.；Rigaud T.；Duncanson P.；Sharpe R.G.；DunnA.M.，Ultrastructural characterisation and molecular taxonomicidentification of Nosema granulosis n.sp.，a transovarially transmittedfeminising(TTF)microsporidium，Journal of Eukaryotic Microbiology，1999，46(5)：492-499)；曹广力，张志芳，贡成良等.家蚕微粒子孢子DNA的制备方法，蚕业科学，1995，21(4)：260)和CTAB法(刘吉平，曹阳，Smith J E，徐兴耀.模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究.中国农业科学，2004，37(2)：1925-1931)提取微孢子虫的DNA，经PCR进行微孢子虫的分子检测鉴定。
1.煮沸法提取微孢子虫DNA的过程：取100μL裂解缓冲液加入5个1.5mL离心管中，做好标记，再向每个管中分别加入100μL浓度为108个/mL的蜜蜂微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、家蚕微孢子虫孢子、感染家蚕微孢子虫孢子的蚕蛾组织研磨液和小菜蛾微孢子虫的孢子悬浮液，混匀。沸水浴10分钟，13000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清液即为微孢子虫核酸模板DNA。
2.常规方法提取微孢子虫DNA的过程：微孢子虫DNA的常规抽提方法基本参照Terry et al(Terry R.S.；Smith J.E.；Bouchon D.；Rigaud T.；Duncanson P.；Sharpe R.G.；DunnA.M.，Ultrastructural characterisation and molecular taxonomicidentification of Nosema granulosis n.sp.，a transovarially transmittedfeminising(TTF)microsporidium，Journal of Eukaryotic Microbiology，1999，46(5)：492-499)和曹广力等(曹广力，张志芳，贡成良，吴祥甫.家蚕微粒子孢子DNA的制备方法.蚕业科学，1995，21(4)：260)的方法进行：1)取108个/mL孢子液100μL与400μL细胞裂解液(0.1mol/LNa2CO3，0.15mol/L NaCl，0.1mol/L SDS，0.1mol/L EDTA，0.1mol/LDTT，过滤灭菌)于无菌的1.5ml离心管中，在匀浆器上混匀，每隔30分钟，在振荡器上振荡离心管一次；然后离心去上清，沉淀用100μL ddH2O重悬，2)加5μL蛋白酶K，然后在37℃水浴锅里孵育12小时，每隔30分钟，在振荡器上振荡离心管一次；3)加入等体积的饱和酚溶液，混匀，离心，提取上层水相溶液移入新的无菌的1.5ml离心管中；4)加入等体积的饱和酚∶氯仿(1∶1)，混匀，离心，提取上层水相溶液移入新的无菌的1.5ml离心管中；重复此步骤2次，直至组织的蛋白质被完全分离去掉；5)加入等体积的氯仿，混匀，离心，提取上层水相溶液移入新的无菌的1.5ml离心管中；6)加入1/10体积的3mol/LNaCl或乙酸钠溶液，混匀后加入2.5倍体积的冷无水乙醇，在冰盒内置放120分钟，4℃ 13200rpm离心60分钟，小心弃去上清液，得到DNA沉淀。
最后样品的DNA沉淀溶于50μL去离子无菌水(或TE pH8.0)中，4℃冰箱保存过夜，即可作为PCR模板DNA；如要保证较长时间使用DNA的质量，则必须置-20℃冰箱保存。
3.CTAB裂解法提取微孢子虫DNA的过程：1)取取108个/mL孢子液100μL于无菌的1.5ml离心管中；6000rpm离心5分钟，弃上清；2)孢子沉淀用2％ CTAB抽提缓冲液(2％ CTAB，20mmol/LTris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，1.4mmol/L NaCl，2％β-巯基乙醇)400μL重悬，用玻璃棒研磨3分钟；加蛋白酶K(20mg/ml)约20μL，然后在振荡器上振荡30秒，55℃保温4小时，间或在振荡器上振荡30秒。
3)酶消化后的抽提液不经离心，待其冷却至室温后，直接加300μL氯仿，在振荡器上振荡混匀，13200rpm离心10分钟。
4)将上清液吸到新的无菌1.5ml离心管中(注意不要吸到氯仿层！)，加300μL室温保存的100％异丙醇溶液，在振荡器上振荡混匀，置于4℃冰箱里保持1小时以上，然后13200rpm离心5分钟；小心弃去上清液。
6)DNA沉淀再用75％乙醇300μL洗离2次。(注意小心弃去上清液，不要敲动DNA沉淀)。然后将离心管倒置于干净的纸巾上，让其自然凉干(约15min)或者37℃烘干(约10min)。
最后每样品的DNA沉淀溶于50μL去离子无菌水(或TE pH8.0)中，4℃冰箱保存过夜，即可作为PCR模板DNA；如要保证较长时间使用DNA的质量，则必须置-20℃冰箱保存。
由以上两种方法可以看出，常规法和CTAB法提取DNA的步骤都较复杂，花费的时间比较长，一般都需要一天以上才能得到目的DNA。特别是在常规法中，应用了苯酚，这是一种剧毒性和高度腐蚀性的化学物质，吸入、摄入、皮肤吸收可造成伤害；以上两种方法均用到氯仿，这是一种致癌剂，有肝、肾毒性，有挥发性，需要在通风柜内操作；此外蛋白酶K有刺激性，β-巯基乙醇、SDS、DTT甚至是乙酸钠等接触皮肤都可能造成伤害，使用时必须小心，都要求在通风柜内操作。而煮沸法则操作非常简单，并减少了接触以上各种化学物质的机会和时间，且在短时间内(约10分钟左右)完成模板DNA的制备。
分别以上述三中方法提取的DNA为膜板，通过PCR方法进行微孢子虫的分子诊断。
选用微孢子虫SSU-rRNA基因序列高度保守区的V1F/530R引物作为PCR诊断微孢子虫的通用引物，反应扩增的目的片段约为400bp：引物V1F/530R的碱基序列为：VIF：5’-CAC CAG GTT GAT TCT GCC TGA C-3’530R：5’-CCG CGG CTG CTG GCA C-3’25μl PCR反应体系为：5×Green GoTaqTM PCR反应液(Promega，UK)5μL，1μL 10mM dNTPs(PCR grade，Cat.#10297-018，Invitrogen，UK)混合液(即各2μL的dNTPs加92μLddH2O混合均匀)，5U/μL GoTaqTM DNA聚合酶0.125μL，以及终浓度为1.5mM MgCl2，ddH2O 15.875μL，10pmol引物V1f(正向引物)和530r(反向引物)各1μL，1μL模板DNA(约10.0ng/μl)。
PCR反应条件，即95℃变性8分钟后，35次循环为：95℃ 1分钟，60℃ 1分钟，72℃ 1分钟。最后72℃延伸10分钟。
取PCR反应产物6μL加3μL 0.5％溴酚蓝混合，点样于1.5％琼脂糖凝胶(225mg琼脂糖熔于15mL TAE缓冲液)的凝胶孔中(含溴化乙锭EtBr染色剂)电泳，100V电泳30min，紫外凝胶成像仪下观察并记录结果(图1)。
结果表明使用本发明方法提取的DNA，与其他两种提取方法相比，不但操作简单，而且DNA质量同样能满足PCR方法对微孢子虫的分子鉴定的需要。