一种食蟹猴肝组织单细胞悬液的制备方法
| 热词 | 细胞 单细胞 组织 离心 dpbs cd45 300g 胶原 离心力 碎块 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; |
| 专利有效性 | 公开 | 当前状态 | 公开 |
| 申请号 | CN202510497195.3 | 申请日 | 2025-04-21 |
| 公开(公告)号 | CN120158420A | 公开(公告)日 | 2025-06-17 |
| 申请人 | 昭衍(苏州)新药研究中心有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 贾丽君; 蒋华芳; 张金平; 张柏青; 侯德宝; 张素才; | 第一发明人 | 贾丽君 |
| 权利人 | 昭衍(苏州)新药研究中心有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 昭衍(苏州)新药研究中心有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省苏州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省苏州市太仓市生物医药产业园昭溪路1号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：215421 |
| 主IPC国际分类 | C12N5/071 | 所有IPC国际分类 | C12N5/071 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 苏州市方略专利代理事务所 | 专利代理人 | 张凌宇; |
| 摘要 | 本 发明 属于 生物 技术领域，具体涉及一种食蟹猴肝组织单细胞悬液的制备方法。将食蟹猴肝组织用预冷缓冲液清洗后，加工成组织碎 块 ；将组织碎块与消化溶液混合，消化溶液包含终浓度1±0.2 mg/ml的胶原酶I、终浓度1±0.2 mg/ml的胶原酶II、0.04±0.01%（w/v） 牛 血清 白蛋白 、10±2 U/ml的DNase I，余量为缓冲溶液；在37±2℃、150±50rpm条件下振荡孵育30±10min，进行组织消化；将消化后的悬液离心后去除上清液，用缓冲液重悬并通过细胞筛过滤，获得单细胞初悬液；对单细胞初悬液进行红细胞裂解、洗涤和重悬，制得食蟹猴肝组织单细胞悬液。该方法显著提升组织解离效率，减少细胞黏连与碎片，有效保护细胞表面 抗原 表位，具备操作简便、经济高效的优势。 | ||
| 权利要求 | 1.一种食蟹猴肝组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种食蟹猴肝组织单细胞悬液的制备方法技术领域背景技术[0002] 在现代生物技术领域，针对组织中特定细胞群体的研究广泛应用于免疫学、肿瘤学及药物研发等领域，例如药物组织分布分析、肿瘤免疫微环境解析和免疫细胞组织定位等。流式细胞术作为高通量细胞分析的核心技术，能够实现对细胞表型及功能的精准检测，而高质量单细胞悬液的制备是该技术应用的关键前提。 [0003] 食蟹猴肝脏组织的单细胞悬液制备面临多重技术挑战。在食蟹猴肝脏组织中，细胞通过紧密连接和桥粒形成紧密的板状结构，机械强度高，用常规机械剪切难以完全分离，同时细胞外基质富含胶原和层黏连蛋白，难以彻底消化；食蟹猴肝脏组织包括多种细胞类型，不同类型的细胞对于消化酶的敏感性差异很大，同时肝细胞富含线粒体和内质网，细胞膜脆性高，易在机械或化学作用下破裂，导致碎片增多；而且，对于应用于流式试验的单细胞悬液，在制备过程中还需要完整保留细胞表面抗原。 [0004] 尽管市售组织解离试剂盒及专用仪器可实现单细胞悬液制备，但其高昂成本限制了广泛应用，且制备的单细胞悬液质量仍有提高空间。因此，开发一种操作简便、经济高效且能兼顾细胞活性、单细胞纯度及表面抗原保护的食蟹猴肝组织单细胞悬液制备方法，对肝组织免疫细胞分析具有重要意义。 发明内容[0005] 针对现有技术存在的不足，本发明提供一种食蟹猴肝组织单细胞悬液的制备方法。 [0006] 本发明提供一种食蟹猴肝组织单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：（1）将食蟹猴肝组织用预冷缓冲液清洗后，加工成组织碎块； （2）将组织碎块与消化溶液混合，消化溶液包含终浓度1±0.2 mg/ml的胶原酶I、终浓度1±0.2 mg/ml的胶原酶II、0.04±0.01%（w/v）牛血清白蛋白、10±2 U/ml的DNase I，余量为缓冲溶液； （3）将步骤（2）的体系在 37±2℃、150±50rpm 条件下振荡孵育 30±10min，进行组织消化； （4）将消化后的悬液离心后去除上清液，用缓冲液重悬并通过细胞筛过滤，获得单细胞初悬液； （5）对单细胞初悬液进行红细胞裂解、洗涤和重悬，制得食蟹猴肝组织单细胞悬液。 [0007] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（1）中组织碎块的体积为0.5‑1mm³，通过手术剪剪切获得。 [0008] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（2）中组织碎块与消化溶液混合的体积比为1:8‑1:20。 [0009] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（2）中余量的缓冲溶液为杜氏磷酸缓冲盐溶液DPBS。 [0010] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（4）中离心条件为300±50g、4±1℃离心5±1分钟。 [0011] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（5）中红细胞裂解采用pH 7.0‑7.4的NH4Cl基裂解液。 [0012] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（5）中红细胞裂解液的制备包括以下步骤：配制成含NH4Cl 2.1 g/L、KHCO3 0.25 g/L、EDTA 0.0225 g/L的溶液后用HCl溶液调节pH至7.0 7.4，2 8℃保存。~ ~ [0013] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（5）中，室温裂解3±0.5分钟。 [0014] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（5）中，红细胞裂解步骤将细胞重悬液与红细胞裂解液按体积比1:9混合。 [0015] 作为食蟹猴肝组织单细胞悬液制备的进一步优化方案，步骤（4）中，细胞筛为30‑50μm孔径的尼龙筛网，过滤前预冷至4‑8℃并用含0.1% BSA的DPBS预润湿。 [0016] 有益效果本发明的方法能够有效将食蟹猴肝组织解离为高质量单细胞悬液，该方法可显著提升组织解离效率，减少细胞黏连与碎片产生，保持高细胞活性，同时有效保护细胞表面抗原表位，使单细胞悬液在流式分析中能清晰区分淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞亚群，为精准解析肝组织免疫细胞表型及功能提供了可靠的技术支持，具备优异的单细胞纯度、活性及表面抗原保留效果，适用于肝组织免疫细胞分析。 附图说明 [0017] 图1为实施例1中的食蟹猴肝组织单细胞悬液流式分析图（单核细胞与巨噬细胞分群）。 [0018] 图2为实施例1中的食蟹猴肝组织单细胞悬液流式分析图（淋巴细胞分群）。 [0019] 图3为食蟹猴肝组织单细胞悬液流式分析对比图，其中图3（a）对应对比例1，图3（b）对应实施例1。 [0020] 图4为食蟹猴肝组织单细胞悬液流式分析对比图，其中图4（a）对应对比例2，图4（b）对应实施例1。 具体实施方式[0021] 下面通过具体实施例进一步阐明本发明，这些实施例是示例性的，旨在说明问题和解释本发明，并不是一种限制。 [0022] 试剂配制红细胞裂解液：称取NH4Cl 4.2g，KHCO30.5g，EDTA 0.045g，加入到400ml超纯水中，溶解混匀后用超纯水稀释至500ml，用HCl溶液调节PH至7.0 7.4. 2 8℃保存。 ~ ~ [0023] 胶原酶I：将10ml DPBS加入到100mg 胶原酶I粉末中充分溶解，2 8℃保存。~ [0024] 胶原酶II：将10ml DPBS加入到100mg 胶原酶II粉末中充分溶解，2 8℃保存。~ [0025] 实施例1步骤1：取一小块食蟹猴肝脏组织，置于10cm细胞培养皿中，用预冷的DPBS洗去表面血污杂质。 [0026] 步骤2：在1.5ml离心管中加入200ul预冷的DPBS，剪一小块清洗后的肝脏组织置于离心管底部，用手术剪将组织剪成1 0.5 mm³大小的组织碎块，将组织碎块移入15ml离心管~中。 [0027] 步骤3：重复第2步操作，直至将全部组织块剪碎移入15ml离心管中。 [0028] 步骤4：组织消化体系1准备：在组织悬液中加入DPBS至4ml，加入0.5ml胶原酶I和0.5ml胶原酶II，同时加入0.04% BSA和10 U/ml DNase I。 [0029] 步骤5：将15ml离心管放到恒温振荡器上，37℃，150rpm孵育30min。 [0031] 步骤7：在离心管中加入5ml DPBS重悬组织悬液，取40um细胞筛置于50ml离心管上，组织悬液用细胞筛过滤，获得单细胞悬液。 [0032] 步骤8：将单细胞悬液在离心力300g 、温度4℃的条件下离心5min，去除上清。 [0033] 步骤9：用10ml 预冷的PBS重悬细胞，在离心力300g 、温度4℃的条件下离心5min，去除上清。 [0034] 步骤10：加入1ml预冷的PBS重悬细胞，加入9ml红细胞裂解液，室温裂解3min。 [0035] 步骤11：在离心力300g 、温度4℃的条件下离心5min，去除上清。 [0036] 步骤12：用10ml 预冷的PBS重悬细胞，在离心力300g 、温度4℃的条件下离心5min，去除上清。 [0037] 步骤13：加入2ml预冷的PBS重悬细胞，用AO/PI 细胞计数。 [0038] 对比例1本对比例采用胰酶 Trypsin‑EDTA (0.25%) 替代实施例 1 中的胶原酶 I 和胶原酶 II，其余操作步骤与实施例 1 保持一致。 [0039] 步骤 1：取一小块食蟹猴肝脏组织，置于 10cm 细胞培养皿中，用预冷的 DPBS 洗去表面血污杂质。 [0040] 步骤 2：在 1.5ml 离心管中加入 200μl 预冷的 DPBS，剪一小块清洗后的肝脏组织置于离心管底部，用手术剪将组织剪成 1 0.5mm³ 大小的组织碎块，将组织碎块移入 ~15ml 离心管中。 [0041] 步骤 3：重复第 2 步操作，直至将全部组织块剪碎移入 15ml 离心管中。 [0042] 步骤 4：组织消化体系 2 准备：在组织悬液中加入 DPBS 至 4ml，加入 4ml Trypsin‑EDTA (0.25%)，同时加入 0.04% BSA 和 10 U/ml DNase I。 [0043] 步骤 5：将 15ml 离心管放到恒温振荡器上，37℃，150rpm 孵育 30min。 [0044] 步骤 6：将单细胞悬液在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0045] 步骤 7：在离心管中加入 5ml DPBS 重悬组织悬液，取 40μm 细胞筛置于 50ml 离心管上，组织悬液用细胞筛过滤，获得单细胞悬液。 [0046] 步骤 8：将单细胞悬液在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0047] 步骤 9：用 10ml 预冷的 PBS 重悬细胞，在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0048] 步骤 10：加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞，加入 9ml 红细胞裂解液，室温裂解 3min。 [0049] 步骤 11：在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0050] 步骤 12：用 10ml 预冷的 PBS 重悬细胞，在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0051] 步骤 13：加入 2ml 预冷的 PBS 重悬细胞，用 AO/PI 细胞计数。 [0052] 对比例2本对比例在实施例 1 的基础上，将组织消化时间延长至60min，其余操作步骤与实施例1保持一致。 [0053] 步骤 1：取一小块食蟹猴肝脏组织，置于 10cm 细胞培养皿中，用预冷的 DPBS 洗去表面血污杂质。 [0054] 步骤 2：在 1.5ml 离心管中加入 200μl 预冷的 DPBS，剪一小块清洗后的肝脏组织置于离心管底部，用手术剪将组织剪成 1 0.5mm³ 大小的组织碎块，将组织碎块移入 ~15ml 离心管中。 [0055] 步骤 3：重复第 2 步操作，直至将全部组织块剪碎移入 15ml 离心管中。 [0056] 步骤 4：组织消化体系 1 准备：在组织悬液中加入 DPBS 至 4ml，加入 0.5ml 胶原酶 I 和 0.5ml 胶原酶 II，同时加入 0.04% BSA 和 10 U/ml DNase I。 [0057] 步骤 5：将 15ml 离心管放到恒温振荡器上，37℃，150rpm 孵育 60min。 [0058] 步骤 6：将单细胞悬液在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0059] 步骤 7：在离心管中加入 5ml DPBS 重悬组织悬液，取 40μm 细胞筛置于 50ml 离心管上，组织悬液用细胞筛过滤，获得单细胞悬液。 [0060] 步骤 8：将单细胞悬液在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0061] 步骤 9：用 10ml 预冷的 PBS 重悬细胞，在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0062] 步骤 10：加入 1ml 预冷的 PBS 重悬细胞，加入 9ml 红细胞裂解液，室温裂解 3min。 [0063] 步骤 11：在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0064] 步骤 12：用 10ml 预冷的 PBS 重悬细胞，在离心力 300g、温度 4℃的条件下离心 5min，去除上清。 [0065] 步骤 13：加入 2ml 预冷的 PBS 重悬细胞，用 AO/PI 细胞计数。 [0066] 测试例与结果分析流式细胞染色及上机检测方法：取 7 支流式管，各加入 200μl 单细胞悬液，依次加入 2ml DPBS 混匀后，于 300g、4℃离心 5min 弃上清。其中 5 支管分别加入 100μl 含 FITC‑CD45、PerCP‑CD3、PE‑CD20、BV605‑CD11b 及 Fixable Viability Dye eFluor 780 的单染液，1 支管加入含上述所有染料的全染液，剩余 1 支管加入 100μl DPBS 作为空白对照。样品于 4℃避光孵育 30min 后，用 DPBS 清洗 2 次（每次 2ml，300g、4℃离心 5min），最终用 1ml DPBS 重悬细胞，进行流式细胞仪检测。以空白管调节 FSC/SSC 阈值及补偿参数，单染管校准各荧光通道电压，完成数据采集。 [0067] 如图1所示，对实施例1的食蟹猴肝组织单细胞悬液流式分析图进行All events圈门；将圈出的细胞进行single cells圈门去黏连；然后在single cells门中plot Fixable viability Dye eFluor 780通道圈活细胞群，圈出的阴性群live cells即为活细胞群；在活细胞群中plotFITC CD45通道，圈出CD45+阳性细胞群即为白细胞（leukocytes）。在CD45+阳性细胞群中分别plot PerCP CD3, PE CD20和BV605 CD11b，分别圈出CD3+, CD20+和CD11b+阳性细胞群，标记为CD45+CD3+, CD45+CD20+, CD45+CD11b+。结果如图1所示，该细胞群不表达CD3和CD20, 表达CD11b，因此该细胞群主要为表达CD11b的单核细胞（monocytes）与巨噬细胞（macrophage）。 [0068] 如图2所示，对实施例1的食蟹猴肝组织单细胞悬液流式分析图进行All events圈门；将圈出的细胞进行single cells圈门去黏连；然后在single cells门中plot Fixable viability Dye eFluor 780通道圈活细胞群，圈出的阴性群live cells即为活细胞群；在活细胞群中plotFITC CD45通道，圈出CD45+阳性细胞群即为白细胞（leukocytes）。在CD45+阳性细胞群中plot PerCP CD3，圈出CD3+阳性细胞群，标记为CD45+CD3+, 即为T淋巴细胞；在CD45+阳性细胞群中plot PE CD20，圈出CD20+阳性细胞群，标记为CD45+CD20+，即为B淋巴细胞。 [0069] 将根据实施例1与对比例1的方法获得的单细胞悬液进行流式分析对比。实施例1的结果如图3（b）所示，可获得约6.3% 淋巴细胞群（lymphocytes），1.1% 单核细胞群（Monocytes）和4.7% 巨噬细胞群（Macrophage）；对比例1的结果如图3（a）所示，只能获得约0.8% 淋巴细胞群（lymphocytes），0% 单核细胞群（Monocytes）和0.3% 巨噬细胞群（Macrophage）。表明对比例1的制备方法无法将组织有效消化获得高质量单细胞悬液。 [0070] 将根据实施例1与对比例2的方法获得的单细胞悬液进行流式分析对比。实施例1的结果如图4（b）所示，获得的单细胞群（All events）与细胞碎片（Debris）占比约15.3% : 17.7%；对比例2的结果如图4（a）所示，单细胞群（All events）与细胞碎片（Debris）占比约 4.2% : 33.4%。表明对比例2的制备方法虽仍可获得清晰的单细胞分群，但会显著增加细胞碎片。 [0071] 本发明方法制备的食蟹猴肝组织单细胞悬液展现出优异的细胞活性与单细胞纯度。图1中，单核细胞（monocytes）与巨噬细胞（macrophage）活细胞群（live cells）占比达96.3%；图2中，淋巴细胞活细胞群（live cells）达97.2%，表明本发明的方法制备的食蟹猴肝组织单细胞悬液活率良好。此外，如图1和图2所示，采用横坐标FSC‑A和纵坐标FSC‑H去除黏连细胞群（第一排中间示图），圈出单个细胞群（single cells），显示单细胞群（single cells）占比分别为91.5%和97.3%，证明该方法制备的食蟹猴肝组织单细胞悬液细胞悬液中绝大多数为单细胞，黏连细胞占比极少。 [0072] 从流式分析图效果来看，如图3（b）所示，该单细胞悬液可以在流式分析图FSC和SSC门中清晰地展示淋巴细胞群（lymphocytes），单核细胞群（Monocytes）和巨噬细胞群（Macrophage），表明该方法制备的食蟹猴肝组织单细胞悬液可获得高质量的流式分析图。 [0073] 在表面抗原保留与表型分析方面，针对 CD45、CD3、CD20、CD11b 等免疫标志物的染色结果显示，各目标细胞群（如 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、单核 / 巨噬细胞）均呈现清晰的阳性分群，与预期免疫表型高度一致（如图 1、图 2 所示）。这表明该方法在解离过程中有效保护了细胞表面抗原表位，为精准解析肝组织免疫细胞表型及功能提供了可靠的技术支持。 [0074] 综上所述，本发明提供了一种有效的方法对食蟹猴肝脏组织进行解离消化获得高质量单细胞悬液用于肝组织中免疫细胞分析，该方法通过采用特定配比的胶原酶I和胶原酶II，并同时添加一定比例的BSA对细胞进行保护和添加一定比例的DNaseI对组织解离过程中释放的DNA进行消化，可有效将组织解离成单细胞，降低组织细胞黏连，并且可有效保护细胞表面抗原表位，获得更高质量的单细胞悬液。 [0075] 以上实施方式是示例性的，其目的是说明本发明的技术构思及特点，以便熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 |
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