| 热词 | 荧光素酶 荧光素 nanoluc 荧光 萤火虫 萤火 试剂 裂解 底物 试剂盒 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202510093914.5 | 申请日 | 2025-01-21 |
| 公开(公告)号 | CN119639865A | 公开(公告)日 | 2025-03-18 |
| 申请人 | 广州博鹭腾生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 包华昱; 李莉薇; 李秋; 罗文波; 伍盛鋆; | 第一发明人 | 包华昱 |
| 权利人 | 广州博鹭腾生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 广州博鹭腾生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省广州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省广州市黄埔区神舟路288号C栋601房、C栋701房 | 邮编 | 当前专利权人邮编：510700 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/66 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/66 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 11 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 深圳市精英专利事务所 | 专利代理人 | 巫苑明; |
| 摘要 | 本 发明 公开一种萤火虫 荧光 素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测 试剂 盒 ，包括荧光素酶裂解液、萤火虫荧光素酶检测试剂、NanoLuc荧光素酶检测缓冲液和NanoLuc荧光素酶底物(50×)。经测试，本发明制备的萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测试剂盒检测灵敏度高、检测线性范围更宽、 信号 更高、信号衰减程度小、发 光信号 下降趋势更缓慢，更适合应用在高通量检测中。 | ||
| 权利要求 | 1.一种萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测试剂盒，其特征在于，包括荧光素酶裂解液、萤火虫荧光素酶检测试剂、NanoLuc荧光素酶检测缓冲液和NanoLuc荧光素酶底物(50×)。 |
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| 说明书全文 | 一种萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测试剂盒 技术领域背景技术[0002] 报告基因(reportgene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合，或与其他目的基因融合，在调控序列的控制下进行表达，通过检测报告基因的表达产物来“报告”目的基因的表达调控。常用的报告基因包括荧光素酶(Luciferase)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β‑半乳糖苷酶(β‑ga l)、分泌性人胎盘碱性磷酸酶(SEAP)和绿色荧光蛋白(GFP)等。其中荧光素酶报告基因因其分析方法简单、具有较宽的线性范围，且价格低廉而被广泛应用。 [0003] 荧光素酶报告基因是以荧光素(l uci fer i n)为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。原理是将目的基因转录调控原件构建入带有荧光素酶的表达载体，构建成报告基因质粒，使这段序列调控荧光素酶的转录表达。然后将报告基因质粒转染细胞，给予其不同的处理后裂解细胞，并加入底物荧光素，荧光素酶可催化荧光素发出荧光。检测得到的荧光值高低可以判断不同处理组对该转录调控原件的影响。 [0004] 双荧光素酶报告基因，即在一个系统中同时表达和测量两个独立的报告基因，通常被用来提高实验精确度，可以避免由于细胞存活率或质粒转染效率差异所造成的误差。萤火虫和NanoLuc荧光素酶双报告基因是在萤火虫荧光素酶报告基因基础上同时转入NanoLuc荧光素酶的报告基因质粒作为内参提供反应基线，用来充当校正参数。 发明内容[0005] 为解决在一个系统中检测两个同时表达的独立报告基因的需求，本发明提出一种萤火虫和NanoLuc荧光素酶双报告基因的检测试剂盒，创新性地开发了NanoLuc荧光素酶检测缓冲液配方，使其有效屏蔽萤火虫荧光素酶的荧光信号，引入了自研的NanoLuc荧光素酶检测底物(HFFz)，实现了光信号强度大、持续时间长、灵敏度高的双荧光素酶的高通量筛选和使用。 [0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现： [0007] 第一方面，本发明提供一种萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测试剂盒，包括荧光素酶裂解液、萤火虫荧光素酶检测试剂、NanoLuc荧光素酶检测缓冲液和NanoLuc荧光素酶底物(50×)。 [0008] 所述荧光素酶裂解液包括PBS缓冲液、非离子型表面活性剂、金属离子遮蔽剂、还原剂、甘油、牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖。本发明的试剂盒采用的荧光素酶裂解液具有温和裂解细胞、保护裂解出来的荧光素酶活性、操作简便无需冰上裂解的特点，同时包括了稳定剂和糖类保护剂，更进一步增加了酶的稳定性。 [0009] 进一步的，所述PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4。 [0010] 进一步的，所述非离子型表面活性剂包括Tr itonX‑100、NP‑40中的一种，在荧光素酶裂解液中的体积分数为0.1％‑0.25％，优选为0.1％，非离子型表面活性剂可以起到破坏细胞脂质双分子层、溶解胞质和细胞膜的作用。 [0011] 进一步的，所述金属离子遮蔽剂包括乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸，在荧光素酶裂解液中的含量为3‑5mM，优选为3mM，在一定酸度条件下，可以遮蔽金属离子。 [0013] 进一步的，所述甘油在荧光素酶裂解液中的体积分数为10％‑15％，优选为10％，甘油可以起到稳定剂的作用。 [0014] 进一步的，所述牛血清白蛋白在荧光素酶裂解液中的质量体积比为0.1％‑0.2％，优选为0.15％，牛血清白蛋白可以起到稳定剂的作用。 [0015] 进一步的，所述海藻糖在荧光素酶裂解液中的含量为10mM，海藻糖可以起到酶保护剂的作用。 [0016] 进一步的，所述蔗糖在荧光素酶裂解液中的含量为5mM，蔗糖可以起到酶保护剂的作用。 [0017] 所述萤火虫荧光素酶检测试剂包括PBS缓冲液、抗坏血酸、ATP、六水氯化镁、D‑荧光素钾盐、还原剂。本发明试剂盒采用的萤火虫荧光素酶检测试剂，使萤火虫荧光素酶在检测底物、氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下，催化荧光素氧化，生成氧化荧光素，同时产生黄绿色光，荧光亮度和荧光素酶的量成正比。具有高度灵敏、线性范围宽、快速简便的特点，特别适合于在细胞信号低，药物作用效果弱，多细胞互作信号等方面的检测和高通量筛选应用。 [0018] 进一步的，所述PBS缓冲液含有137.07mM NaC l、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4。 [0019] 进一步的，所述抗坏血酸在萤火虫荧光素酶检测试剂中的含量为2‑4mM，优选为2mM，抗坏血酸可以起到稳定和保护荧光素底物的作用。 [0021] 进一步的，所述六水氯化镁在萤火虫荧光素酶检测试剂中的含量为1‑5mM，优选为3mM，六水氯化镁提供的镁离子是萤火虫荧光素酶与底物反应的必须离子。 [0022] 进一步的，所述D‑荧光素钾盐在萤火虫荧光素酶检测试剂中的含量为0.1‑0.5mg/mL，优选为0.3mg/mL，作为萤火虫荧光素酶底物。 [0023] 进一步的，所述还原剂为还原型谷胱甘肽，在萤火虫荧光素酶检测试剂中的含量为2‑5mM，优选为2mM，起到稳定和保护荧光素底物的作用。 [0024] 所述NanoLuc荧光素酶检测缓冲液含有PBS缓冲液、焦磷酸、EDTA。本发明试剂盒采用的NanoLuc荧光素酶检测缓冲液，可以有效的屏蔽萤火虫荧光素酶的荧光信号，抑制率达99％，避免了萤火虫荧光素酶的荧光信号对于后续NanoLuc荧光素酶检测的影响,同NanoLuc荧光素酶底物(50×)配制成NanoLuc荧光素酶检测工作液后可以检测NanoLuc荧光素酶的活性而对NanoLuc荧光素酶活性没有影响。 [0025] 进一步的，所述PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4。 [0026] 进一步的，所述焦磷酸在NanoLuc荧光素酶检测缓冲液中的含量为30‑50mg/mL，优选为35mg/mL。 [0027] 进一步的，所述EDTA在NanoLuc荧光素酶检测缓冲液中的含量为8‑12mM，优选为10mM。 [0028] 所述NanoLuc荧光素酶底物(50×)为HFFz，使用DMSO为溶剂溶解HFFz使其含量为0.6‑0.8mg/mL，优选为0.75mg/mL，本发明试剂盒采用的NanoLuc荧光素酶底物(50×)含有新型底物HFFz(Hydroxy l f l uorofur imaz i ne)用于检测NanoLuc荧光素酶，这使得在检测过程中光信号强度大、持续时间长、灵敏度高。用NanoLuc荧光素酶检测缓冲液将NanoLuc荧光素酶底物(50×)稀释50倍后可检测NanoLuc荧光素酶信号。 [0030] 第二方面，本发明提供如第一方面所述的萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测试剂盒在提高萤火虫荧光素酶报告基因检测灵敏度和NanoLuc荧光素酶报告基因检测灵敏度中的应用。 [0031] 利用萤火虫荧光素酶能催化荧光素产生生物荧光反应，反应过程如下所示： [0032] [0033] 利用NanoLuc荧光素酶能催化新型底物HFFz产生生物荧光反应，反应过程如下所示： [0034] [0035] 本发明公开了一种生物活性检测方法，检测方法为以下步骤： [0036] (1)裂解细胞 [0037] (1.1)对转染有萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶报告基因的细胞吸尽细胞培养液后，加入1mL 0.25％胰酶用于消化细胞，再加入5mL培养基将细胞重悬计数，吸取需要的细胞数量，离心收集细胞；去除上清液后，加入荧光素酶裂解液重悬细胞至1E6ce l l s/mL，室温孵育5分钟，充分裂解细胞。 [0038] (1.2)充分裂解后，10,000‑15,000×g离心3‑5分钟，取上清液用于测定。 [0039] (2)萤火虫荧光素酶检测 [0040] (2.1)取20μL上清液加至待检测的96孔板中，加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力。 [0041] (3)NanoLuc荧光素酶检测 [0042] (3.1)按照每个样品需100μL NanoLuc荧光素酶检测工作液的量，取适量NanoLuc荧光素酶检测缓冲液将NanoLuc荧光素酶底物(50×)稀释50倍配制成NanoLuc荧光素酶检测工作液； [0043] (3.2)加入100μL NanoLuc荧光素酶检测工作液至步骤(2.1)待检测的96孔板中，震板混匀，检测NanoLuc荧光素酶的活力。 [0044] 与现有技术相比，本申请的有益效果是： [0045] 本发明的NanoLuc荧光素酶检测缓冲液可以有效的屏蔽萤火虫荧光素酶的荧光信号，抑制率达99％，避免了萤火虫荧光素酶的荧光信号对于后续NanoLuc检测的影响。本发明通过D‑荧光素钾盐为底物检测萤火虫荧光素酶，创新性地引入了新型底物HFFz(Hydroxy l f l uorofur imaz i ne)用于检测NanoLuc荧光素酶，使得在检测过程中具有光信号强度大、持续时间长、灵敏度高的特点，有利于双荧光素酶的高通量筛选和使用。附图说明 [0046] 图1为试剂盒4个组分包装示意图。 [0047] 图2为试剂盒对报告基因活性检测结果示意图。 [0048] 图3为试剂盒检测萤火虫荧光素酶的线性性能检测结果对比图。 [0049] 图4为试剂盒检测NanoLuc荧光素酶的线性性能检测结果对比图。 [0050] 图5为试剂盒检测萤火虫荧光素酶的信号稳定性检测结果对比图。 [0051] 图6为试剂盒检测NanoLuc荧光素酶的信号稳定性检测结果对比图。 [0052] 图7为不同抑制剂对萤火虫荧光素酶抑制率的影响对比图。 [0053] 图8为不同NanoLuc底物对发光信号的影响对比图。 具体实施方式[0054] 下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，以下将描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0055] 应当理解，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，术语“包括”和“包含”指示所描述特征、整体、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但并不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元素、组件和/或其集合的存在或添加。 [0056] 还应当理解，在此本发明实施例说明书中所使用的术语仅仅是出于描述特定实施例的目的而并不意在限制本发明实施例。如在本发明实施例说明书和所附权利要求书中所使用的那样，除非上下文清楚地指明其它情况，否则单数形式的“一”、“一个”及“该”意在包括复数形式。 [0057] 本发明涉及的HFFz底物的制备方法记载于中国发明专利申请CN117924295A中，制备步骤如下： [0058] (1)以对甲苯磺酰叠氮和氢化钠为原料溶于超干四氢呋喃，冰浴条件下搅拌后，加入二乙基膦乙酸叔丁酯，于冰浴条件下反应20～40min，再将该混合物转移至室温搅拌反应1.5～2.5小时，终止反应后加入乙酸乙酯萃取，干燥、过滤并旋干，得到中间体1，其中对甲苯磺酰叠氮、氢化钠和二乙基膦乙酸叔丁酯的摩尔比为1.2:1:1； [0059] (2)将锌粉和碘悬浮在无水四氢呋喃和干燥DMF中，室温下搅拌至碘褪色，加入2‑氟苄基溴进行反应，反应结束后将反应混合物冷却至室温，加入2‑氨基‑3，5‑二溴吡嗪、PdC l2(PPh3)2、无水四氢呋喃和干燥DMF搅拌反应，然后过滤混合物，萃取滤液，干燥、浓缩、纯化后得到中间体2；其中，锌粉、碘、2‑氟苄基溴、2‑氨基‑3，5‑二溴吡嗪、PdC l2(PPh3)2的摩尔比为3.8:0.38:1.5:1:0.05； [0060] (3)惰性气氛下，将中间体1、中间体2、二聚醋酸铑溶于甲苯中进行反应，冷却后萃取、洗涤、干燥、浓缩并纯化后得到中间体3，其中，中间体2与中间体1、二聚醋酸铑的摩尔比为1:1～2：0.1，反应的温度为100～110℃，反应的时间为22～26h； [0061] (4)中间体3和2‑糠醛在甲醇中溶解，加入四甲基胍反应，萃取、干燥、浓缩、纯化后得到中间体4；其中中间体3、2‑糠醛、四甲基胍的摩尔比为1:1～2:2～3；反应温度为室温，反应时间为1.5～3.5h； [0062] (5)惰性气氛下，将中间体4溶于1,4‑二氧六环溶液中，加入四三苯基膦钯、苯硼酸类化合物、碳酸铯水溶液，85℃反应3～4小时，冷却后萃取、干燥、浓缩、纯化后得到中间体5，其中，中间体4、四三苯基膦钯、苯硼酸类化合物、碳酸铯水溶液的摩尔比为1:0.1:1.3:3； 1,4‑二氧六环溶液中，1,4‑二氧六环和水的体积比为5:1；所述的苯硼酸类化合物为3‑(叔丁基二甲基甲硅氧基)‑2‑氟苯基硼酸； [0063] (6)中间体5溶于二氯甲烷后冰浴，再加入三氟乙酸,在室温下搅拌反应4～6小时，减压除去挥发物，得到中间体6，其中中间体5和三氟乙酸的摩尔比为1:9～10； [0064] (7)中间体6溶于二氯甲烷，再加入CDI，冰浴下反应0.5‑2.5小时，萃取、干燥、浓缩、纯化后得到中间体7，其中，中间体6与CDI的摩尔比为1:1.5～2.5； [0065] (8)将中间体7溶于二氯甲烷和甲醇中，冷却后加入硼氢化钠反应20～40分钟，并将盐酸加入反应液中，调节pH，萃取、干燥、浓缩、纯化后得到中间体8，其中中间体7与硼氢化钠的摩尔比为1:2～4，盐酸的浓度为0.1摩尔/升； [0066] (9)中间体8溶于甲醇中，加入盐酸，反应16～24小时，萃取、干燥、浓缩、纯化后得到HFFz，其中，盐酸的浓度为6摩尔/升，中间体8与盐酸的摩尔比为1:8～20。 [0067] 本发明涉及的其它原料均可从市场上直接购买。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。 [0069] 实施例1 [0070] 本实施例提供一种萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测试剂盒，所述试剂盒包含了荧光素酶裂解液、萤火虫荧光素酶检测试剂、NanoLuc荧光素酶检测缓冲液和NanoLuc荧光素酶底物(50×)4种试剂，每种试剂的原料组成和制备方法如下。 [0071] (1)荧光素酶裂解液配制 [0072] 本实施例中，所述荧光素酶裂解液包括PBS缓冲液、非离子型表面活性剂、金属离子遮蔽剂、还原剂、甘油、牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖。 [0073] 其中，所述PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4；非离子型表面活性剂为NP‑40，金属离子遮蔽剂为乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸，还原剂为DTT和还原型谷胱甘肽。 [0074] 量取40mL的PBS缓冲液至容器中，然后加入0.1％体积分数的NP‑40、3mM的乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸、3mM的DTT、3mM的还原型谷胱甘肽、10％体积分数的甘油、0.15％质量体积比的牛血清白蛋白，10mM的海藻糖，5mM蔗糖，最后用PBS缓冲液定容至50ml，以上各组分可采用常规搅拌方法使其溶解，得到的透明粘稠液体即为荧光素酶裂解液。 [0075] (2)萤火虫荧光素酶检测试剂配制 [0076] 本实施例中，所述的PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4、还原剂为还原型谷胱甘肽、还包括抗坏血酸、ATP、六水氯化镁、D‑荧光素钾盐。 [0077] 量取40mL的的PBS缓冲液至容器中，然后加入3mM的还原型谷胱甘肽、2mM的抗坏血酸、5mM的ATP、3mM的六水氯化镁、0.3mg/mL的D‑荧光素钾盐，最后用PBS缓冲液定容至50ml，得到的淡黄色液体即为萤火虫荧光素酶检测试剂。 [0078] (3)NanoLuc荧光素酶检测缓冲液配制 [0079] 量取40mL的的PBS缓冲液至容器中，所述的PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4，然后加入35mg/mL的焦磷酸、10mM的EDTA，最后用PBS缓冲液定容至50ml，得到的透明液体即为NanoLuc荧光素酶检测缓冲液。 [0080] (4)NanoLuc荧光素酶底物(50×)配制 [0081] 量取10ml的DMSO加入容器中，称取HFFz使其浓度为0.65mg/mL，即为NanoLuc检测底物(50×)。 [0082] 实施例2 [0083] 本实施例提供一种萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶双报告基因检测试剂盒，所述试剂盒包含了荧光素酶裂解液、萤火虫荧光素酶检测试剂、NanoLuc荧光素酶检测缓冲液和NanoLuc荧光素酶底物(50×)4种试剂，每种试剂的原料组成和制备方法如下。 [0084] (1)荧光素酶裂解液配制 [0085] 本实施例中，所述PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4，非离子型表面活性剂为NP‑40、金属离子遮蔽剂为乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸、还原剂为DTT和还原型谷胱甘肽、其余为甘油、牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖。 [0086] 量取40mL的PBS缓冲液至容器中，然后加入0.2％体积分数的NP‑40、5mM的乙二醇双(2‑氨基乙基醚)四乙酸、5mM的DTT、5mM的还原型谷胱甘肽、15％体积分数的甘油、0.2％质量体积比的牛血清白蛋白，10mM的海藻糖，5mM蔗糖，最后用PBS缓冲液定容至50mL，以上各组分可采用常规搅拌方法使其溶解，得到的透明粘稠液体即为荧光素酶裂解液。 [0087] (2)萤火虫荧光素酶检测试剂配制 [0088] 本实施例中，所述的PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4、还原剂为还原型谷胱甘肽、还包括抗坏血酸、ATP、六水氯化镁、D‑荧光素钾盐。 [0089] 量取40mL的PBS缓冲液至容器中，然后加入5mM的还原型谷胱甘肽、4mM的抗坏血酸、3mM的ATP、5mM的六水氯化镁、0.5mg/mL的D‑荧光素钾盐，最后用PBS缓冲液定容至50mL，得到的淡黄色液体即为萤火虫荧光素酶检测试剂。 [0090] (3)NanoLuc荧光素酶检测缓冲液配制 [0091] 量取40mL的PBS缓冲液至容器中，所述的PBS缓冲液含有137.07mM NaCl、10mM Na2HPO4、1.84mM KH2PO4，然后加入50mg/mL的焦磷酸、12mM的EDTA，最后用PBS缓冲液定容至50mL，得到的透明液体即为NanoLuc荧光素酶检测缓冲液。 [0092] (4)NanoLuc荧光素酶底物(50×)配制 [0093] 量取10mLDMSO加入容器中，称取HFFz使其浓度为0.75mg/mL，即为NanoLuc检测底物(50×)。 [0094] 对比例1： [0095] 使用市购A型号试剂盒(Nano&Firefly‑Glo双萤光素酶报告基因检测试剂盒，美仑，MA0522‑1)。 [0096] 对比例2 [0097] 本对比例的试剂盒是将实施例1中的NanoLuc荧光素酶检测缓冲液中的成分焦磷酸替换为萤火虫荧光素酶抑制剂KI，含量为40mM，其他成分和配制方法与实施例1一致。 [0098] 对比例3 [0099] 本对比例的试剂盒是将实施例1的NanoLuc荧光素酶检测缓冲液中的成分焦磷酸替换为萤火虫荧光素酶抑制剂白藜芦醇，含量为1mM，其他成分和配制方法与实施例1一致。 [0100] 对比例4 [0101] 本对比例的试剂盒是将实施例1的NanoLuc荧光素酶底物(50×)中的HFFz替换为其他NanoLuc荧光素酶的底物FZ(Furimazine)，配制方法与浓度和实施例1一致。 [0102] 实施例3 [0103] 试剂盒报告基因活性检测，实验步骤如下： [0104] 1.检测方法 [0105] (1)裂解细胞 [0106] (1.1)对转染有萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶的细胞吸尽细胞培养液后，加入1mL 0.25％胰酶用于消化细胞，加入5mL培养基将细胞重悬计数，吸取需要的细胞数量，离心收集细胞；去除上清液后，加入荧光素酶裂解液重悬细胞至1E6cells/mL，室温孵育5分钟，充分裂解细胞。 [0107] (1.2)充分裂解后，10,000‑15,000×g离心3‑5分钟，取上清液用于测定。 [0108] (2)萤火虫荧光素酶检测 [0109] (2.1)取20μL上清液加至待检测的96孔板中，加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力。 [0110] (3)NanoLuc荧光素酶检测 [0111] (3.1)按照每个样品需100μL NanoLuc荧光素酶检测工作液的量，取294μL NanoLuc荧光素酶检测缓冲液和6μL NanoLuc荧光素酶底物(50×)配制成NanoLuc荧光素酶检测工作液。 [0112] (3.3)加入100μl NanoLuc荧光素酶检测工作液至步骤(2.1)中已加入萤火虫荧光素酶检测试剂的96孔板中，震板混匀，检测NanoLuc荧光素酶的活力。 [0113] 对实施例1、实施例2和对比例1制得的试剂盒进行上述测试，作为对比。 [0114] 结果如图2所示，说明本申请制备的试剂盒与常规市购试剂盒相比，对萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶的检测灵敏度高。 [0115] 实施例4 [0116] 试剂盒线性性能检测，测试步骤如下： [0117] 本实施例用荧光素酶裂解液共同稀释含有萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶的纯酶溶液，以此模拟萤火虫荧光素酶和NanoLuc双荧光素酶报告基因在细胞中的酶表达量，测试结果以酶浓度和检测信号值(RLU)做曲线进行线性拟合。 [0118] 1.试剂盒检测方法 [0119] (1)取荧光素酶裂解液稀释萤火虫荧光素酶纯酶(品牌：贝思迪，型号：P045)至浓度为1μg/mL，混合均匀，再继续用上述含有萤火虫荧光素酶的裂解液将NanoLuc荧光素酶纯酶(品牌：贝思迪，型号：P1412)稀释至浓度为100ng/mL，然后将上述加有两种荧光素酶的裂解液继续用荧光素酶裂解液梯度稀释为6个浓度，稀释后荧光素酶裂解液中含有萤火虫荧光素酶浓度为0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL、0.062μg/mL、0.031μg/mL和0.015μg/mL，同时荧光素酶裂解液中含有NanoLuc荧光素酶浓度为50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.1ng/mL、和1.56ng/mL。 [0120] (2)分别取20μL上述不同酶浓度的荧光素酶裂解液加至待检测的96孔板中，各加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，震板混匀，使用多功能酶标仪(Berthokd LB941)检测萤火虫荧光素酶的活力。 [0121] (3)按照每个样品需100μLNanoLuc荧光素酶检测工作液的量，取588μLNanoLuc荧光素酶检测缓冲液和12μL NanoLuc荧光素酶底物(50×)配制成NanoLuc荧光素酶检测工作液。 [0122] (3.3)各加入100μl NanoLuc荧光素酶检测工作液至步骤(2)中已加入萤火虫荧光素酶检测试剂的96孔板中，震板混匀，使用多功能酶标仪(Berthokd LB941)检测NanoLuc荧光素酶的的活力。 [0123] 采用实施例1、实施例2和对比例1制得的试剂盒进行上述测试，作为对比。 [0124] 对萤火虫荧光素酶线性测试结果如图3所示，说明本申请制备的试剂盒与常规市购试剂盒相比，对萤火虫荧光素酶的检测线性范围更宽，信号更高。 [0125] 对NanoLuc荧光素酶线性测试结果如图4所示，说明本申请制备的试剂盒与常规市购试剂盒相比，对NanoLuc荧光素酶的检测线性范围更宽，信号更高。 [0126] 实施例5试剂盒信号稳定性检测 [0127] 1.检测萤火虫荧光素酶的信号稳定性 [0128] (1)取荧光素酶裂解液将萤火虫荧光素酶纯酶(品牌：贝思迪，型号：P045)稀释至浓度为0.5μg/mL。 [0129] (2)取20μL含有0.5μg/mL萤火虫荧光素酶的荧光素酶裂解液加至待检测的96孔板中，加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，做3个重复孔，震板混匀，使用多功能酶标仪(Berthokd LB941)检测化学发光信号，设置每隔5min测定一次荧光值，总共测定30min荧光值，读取0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min时的平均荧光值进行后续分析。 [0130] 2.检测NanoLuc荧光素酶的信号稳定性 [0131] (1)取NanoLuc荧光素酶纯酶(品牌：贝思迪，型号：P1412)，用荧光素酶裂解液稀释至浓度为50ng/mL。 [0132] (2)按照每个样品需100μL NanoLuc荧光素酶检测工作液的量，取适量NanoLuc荧光素酶检测缓冲液，将NanoLuc荧光素酶底物(50×)稀释50倍配制成NanoLuc荧光素酶检测工作液。 [0133] (3)取20μL含有50ng/mLNanoLuc荧光素酶的荧光素酶裂解液加至待检测的96孔板中，加入100μLNanoLuc荧光素酶检测工作液，做3个重复孔，震板混匀，使用多功能酶标仪(Berthokd LB941)检测化学发光信号，设置每隔5min测定一次荧光值，总共测定30min荧光值，读取0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min时的平均荧光值进行后续分析。 [0134] 对实施例1、实施例2和对比例1进行上述测试，作为对比。 [0135] 对萤火虫荧光素酶检测的发光稳定性结果如图5所示，说明本发明试剂盒信号在30min内下降趋势缓慢，与对比例1相比，本发明试剂盒在30min内的信号衰减程度小。 [0136] 对NanoLuc荧光素酶检测的发光稳定性结果如图6所示，说明本发明试剂盒信号在30min内下降趋势缓慢，与对比例1相比，本发明试剂盒在30min内的信号衰减程度小。 [0137] 实施例6不同抑制剂对萤火虫荧光素酶抑制率的影响 [0138] 实验步骤如下： [0139] 1.检测方法 [0140] (1)裂解细胞 [0141] (1.1)对转染有萤火虫荧光素酶和NanoLuc荧光素酶的细胞吸尽细胞培养液后，加入1mL 0.25％胰酶用于消化细胞，加入5mL培养基将细胞重悬计数，吸取需要的细胞数量，离心收集细胞；去除上清液后，加入荧光素酶裂解液重悬细胞至1E6cells/mL，室温孵育5分钟，充分裂解细胞。 [0142] (1.2)充分裂解后，10,000‑15,000×g离心3‑5分钟，取上清液用于测定。 [0143] (2)萤火虫荧光素酶检测 [0144] (2.1)取20μL上清液加至待检测的96孔板中，加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，震板混匀，检测萤火虫荧光素酶的活力。 [0145] (3)NanoLuc荧光素酶检测 [0146] (3.1)在步骤(2.1)的96孔板中，在每个孔中加入98μLNanoLuc荧光素酶检测缓冲液，震板混匀，检测化学发光信号，得到的信号值反应出该缓冲液对上一步萤火虫荧光素酶催化反应的抑制效果。 [0147] (3.2)再向步骤(3.1)的96孔板中加入2μLNanoLuc荧光素酶底物(50×)，震板混匀，使用多功能酶标仪(Berthokd LB941)检测NanoLuc荧光素酶的活力。 [0148] 采用实施例1、实施例2和对比例2、对比例3进行上述测试。 [0149] 结果如图7所示，说明焦磷酸对萤火虫荧光素酶的抑制效果和常规的KI和白藜芦醇的抑制效果相比更具有优势，对NanoLuc荧光素酶没有抑制效果，不影响后续的化学发光信号测定。 [0150] 实施例7不同NanoLuc荧光素酶底物对发光信号的影响 [0151] (1)按照每个样品需100μL NanoLuc荧光素酶检测工作液的量，取适量NanoLuc荧光素酶检测缓冲液，将NanoLuc荧光素酶底物(50×)稀释50倍配制成NanoLuc荧光素酶检测工作液。 [0152] (2)取20μL含有50ng/mL NanoLuc荧光素酶的裂解液加至待检测的96孔板中，加入100μL NanoLuc荧光素酶检测工作液，做3个重复孔，震板混匀，使用多功能酶标仪(Berthokd LB941)检测化学发光信号，设置每隔5min测定一次荧光值，总共测定30min荧光值，读取0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min时的平均荧光值进行后续分析。 [0153] 对实施例1和对比例4进行上述测试，作为对比。 [0154] 结果如图8所示，新型底物HFFz在检测的30min内的发光信号下降趋势比常规底物FZ更缓慢，说明本发明使用的底物更适合试剂盒在高通量检测中应用。 [0155] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 |
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