[0001] 本申请主张中国在先申请，申请号：202310212978.3，申请日2023年3月8日的优先权；该申请的说明书、权利要求书、摘要以及附图组作为本申请的一部分全部引用。

[0002] 本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测五种血小板抗体的试剂盒及制备方法、使用方法和应用。

[0003] 自身免疫性血小板减少症是一类由自身抗体导致血小板破坏增多的出血性疾病，自身免疫性血小板减少症的英文简称为ITP。多数学者认为自身免疫性血小板减少症与体液免疫有关，机体对血小板相关蛋白发生免疫反应，产生抗血小板抗体，大量的抗血小板抗体活跃于脾脏中，血小板会通过脾脏以高度的选择性与抗血小板抗体发生结合，不仅会使人们出现各种过敏反应，而且结合完成后还会被单核巨噬细胞完全吞噬掉，此时血小板的含量发生骤降，患有自身免疫性血小板减少症的患者的骨髓巨核细胞有成熟障碍。在排除其他继发性血小板减少症的基础上，目前ITP的诊断仍依赖临床表现和骨髓检查。检测血小板抗体虽然已成为ITP实验室诊断的一个重要指标，但是市面上制备得到的检测血小板抗体的试剂盒由于检测抗体为多克隆抗体且试剂盒操作步骤繁琐的缘故，导致试剂盒在使用过程中需要的检测时间长且检测操作复杂；同时有些试剂盒中的检测抗体为单克隆抗体，然而单克隆抗体直接与生物素连接进行检测，检测过程中单克隆抗体与生物素之间的空间位阻的影响较大，从而对检测结果造成不良的影响，以上原因导致现有试剂盒存在检测效率低和准确度低的缺点。

[0004] 因此，急需提供一种新的可同时检测多种血小板抗体的试剂盒及其制备方法和使用方法以解决现有技术存在的上述问题。

[0005] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测五种血小板抗体的试剂盒及制备方法、使用方法和应用，通过优化抗人IgG抗体的序列，增强抗人IgG抗体和血小板抗体间的结合力，从而显著提高试剂盒检测结果的准确性与灵敏度，并显著降低了抗人IgG抗体的用量；通过在抗人IgG抗体溶液中添加封闭剂(包括BSA、甘氨酸、明胶水解物、PEG、CE210)，显著降低了样本中其余抗体(非血小板抗体)和抗人IgG抗体之间的结合，也解决了抗人IgG抗体标记PE所导致的血小板抗体和抗人IgG抗体在结合过程中受到PE荧光空间位阻的干扰，进一步减小了空间位阻，同时显著提高了抗人IgG抗体与血小板抗体的有效结合，进一步提高了检测结果的灵敏度、准确性与特异性；通过添加捕获抗体微球混合液，可一次性检测五种特异性抗体，显著提高试剂盒的检测效率和准确度，同时降低检测时间、降低试剂和人工的成本；同时还改进了血小板裂解液、血小板反应缓冲液的配方，进一步提高了试剂盒检测的准确度和灵敏度，同时具有较好的重复性和批间差，使批内实验的变异系数不大于5％，批间实验的变异系数不大于8％。

[0006] 一方面，本发明提供一种基于流式细胞仪同时检测五种血小板抗体的试剂盒，包括捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、血小板反应缓冲液；所述检测抗体溶液中，包括抗人IgG抗体，所述抗人IgG抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

[0007] 进一步地，所述编码抗人IgG抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0008] 在最初制备本发明可同时检测五种血小板抗体的试剂盒的过程中，使用市售的抗人IgG抗体(厂家：Bio‑Rad，货号：MCA647G)，发现对于市售抗人IgG抗体的用量需求极大，但是依然存在检测灵敏度低的问题，因此发明人想到了通过优化抗人IgG抗体的序列来解决这一问题。在一些实施方式中，通过对抗人IgG抗体H/L链的CDR3区序列分别设计核苷酸突变，最终得到16种抗人IgG抗体的序列。为测试16组序列制备得到的IgG抗体的效果，分别取市售的抗人IgG抗体、以及所述16组序列制备得到的IgG抗体制备试剂盒，进行同步检测。实验结果表明：对于本发明中五种血小板抗体，选择不同抗人IgG抗体制备试剂盒，对检测结果的准确性与灵敏度均具有极大影响。当优选组合14的序列制备抗人IgG抗体，此时试剂盒对五种血小板抗体检测结果的准确度与灵敏度均显著提升。其中，所述组合14最终优化后制得抗人IgG抗体(H‑1/L‑3)。

[0009] 进一步地，所述捕获抗体微球混合液中的捕获抗体包括五种血小板抗体；所述五种血小板抗体包括抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体中的任意一种或多种的组合。

[0010] 进一步地，所述检测抗体溶液中还包括封闭剂，所述封闭剂包括BSA、甘氨酸、明胶水解物、PEG、CE210中的任意一种或多种的组合。

[0011] 在一些实施方式中，对加入封闭剂对五种血小板抗体检测结果的影响进行探究，实验结果表明：在制备检测抗体溶液时，需先向所述抗人IgG抗体溶液中加入合适工作浓度的封闭剂后，再加入生物素进行标记处理，封闭剂的加入对优化后的IgG抗体序列的结合位点进行封闭，显著降低了样本中其余抗体(非血小板抗体)和抗人IgG抗体之间的结合，也解决了抗人IgG抗体标记PE所导致的血小板抗体和抗人IgG抗体在结合过程中受到PE荧光空间位阻的干扰，从而进一步显著降低空间位阻，同时也显著提高了抗人IgG抗体与血小板抗体的有效结合，使参与有效反应的抗人IgG抗体明显增加，信号值上升，才使得最终制得可同时高灵敏度检测五种血小板抗体的试剂盒，且检测结果准确性、灵敏度与特异性均显著提高。

[0012] 同时，也对不同封闭剂对五种血小板抗体检测结果的影响进行了对比测试，实验结果表明：只有当优选加入封闭剂1：BSA、甘氨酸、明胶水解物、PEG、CE210时，才可显著降低抗人IgG抗体与样本中其余非特异性抗体的结合，从而提高检测结果的准确性与特异性。

[0013] 进一步地，所述血小板裂解液包括Tris、NaCl、四甲基氯化铵、Triton X‑100、SDS中的任意一种或多种的组合。

[0014] 在一些实施方式中，对血小板裂解液的配方对试剂盒检测结果的影响进行了探究，实验结果表明：只有当选择中最佳血小板裂解液1的配方时，样本的检测结果才可达到完全准确，且平均荧光强度显著高于临界值；而当替换血小板裂解液配方成分时，检测结果均会产生明显降低，从而显著降低检测的准确性与灵敏度。

[0015] 进一步地，所述血小板反应缓冲液包括Tris、NaCl、N‑月桂酰肌氨酸钠盐、BSA、Krovin500、Tween‑20中的任意一种或多种的组合。

[0016] 在一些实施方式中，对血小板反应缓冲液的配方对试剂盒检测结果的影响进行了探究，实验结果表明：只有当选择最佳血小板反应缓冲液1的配方时，样本的检测结果才可达到完全准确，且平均荧光强度显著高于临界值；而当改变血小板反应缓冲液配方成分时，检测结果均会产生明显降低，从而显著降低检测的准确性与灵敏度。

[0017] 进一步地，所述检测抗体溶液中的抗人IgG抗体，采用生物素标记；所述抗人IgG抗体与所述生物素的摩尔比为1:(5～20)。

[0018] 进一步地，所述生物素为琥珀酰亚胺‑6‑(生物素酰氨基)‑6‑己酰氨基己酸酯。

[0019] 进一步地，所述偶联物溶液包括荧光素标记的链霉亲和素，每毫升所述偶联物溶液含有1‑5微克荧光素标记的链霉亲和素。

[0020] 进一步地，所述荧光素包括藻红蛋白、别藻蓝蛋白、紫草素叶绿素、异硫氰酸荧光素中的任意一种或多种的组合。

[0021] 另一方面，本发明提供一种如上技术方案中任一项所述的试剂盒的制备方法，所述检测抗体溶液的制备中，先将封闭剂加入抗人IgG抗体溶液中进行封闭处理，混合均匀后，再加入生物素进行标记处理。

[0022] 再一方面，本发明提供一种抗人IgG抗体用于制备提高试剂盒同时检测五种血小板抗体的检测准确性与灵敏度的制剂的用途，所述抗人IgG抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述编码抗人IgG抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0023] 再一方面，本发明提供一种封闭剂用于制备降低抗人IgG抗体与生物素之间的空间位阻的制剂的用途，所述封闭剂包括BSA、甘氨酸、明胶水解物、PEG、CE210中的任意一种或多种的组合。

[0024] 再一方面，本发明提供一种封闭剂用于制备提高试剂盒同时检测五种血小板抗体的检测准确性与灵敏度的制剂的用途，所述封闭剂包括BSA、甘氨酸、明胶水解物、PEG、CE210中的任意一种或多种的组合。

[0025] 再一方面，本发明提供一种血小板裂解液用于制备提高同时检测五种血小板抗体的检测的准确性与灵敏度的制剂的用途。

[0026] 再一方面，本发明提供一种血小板反应缓冲液用于制备提高同时检测五种血小板抗体的检测的准确性与灵敏度的制剂的用途。

[0027] 再一方面，本发明提供一种用于同时检测五种血小板抗体的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

[0028] S0：提供血小板、捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品；

[0029] S1：使用所述血小板裂解液对所述血小板进行裂解，离心取上清液以得到待检样本；

[0030] S2：分别向每管中加入捕获抗体微球混合液、样本、检测抗体溶液、偶联物溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h(一步孵育)；

[0031] S3：加入1000μL的1×洗涤缓冲液，进行涡旋重悬，以得到待检测物(一次洗涤)；

[0032] S4：检测所述待检测物的荧光类型和荧光强度，以得到所述待检测物中是否含有血小板抗体。

[0033] 本发明的一些实施例，所述制得的试剂盒，使用方法简单，且仅需一步孵育、一次洗涤，即可使试剂盒检测结果的准确性和灵敏度均得到显著提高。

[0034] 本发明取得的有益效果：

[0035] 1、本发明提供的一种试剂盒，通过优化抗人IgG抗体的序列，显著增强抗人IgG抗体和血小板抗体间的结合力，从而显著提高试剂盒检测结果的准确性与灵敏度，同时还显著降低了抗人IgG抗体的用量，降低实验成本。

[0036] 2、本发明提供的一种试剂盒，通过先在抗人IgG抗体溶液中加入封闭剂，再加入生物素进行标记处理，在生物素引入放大系统的基础上，封闭剂的加入显著降低了样本中其余抗体(非血小板抗体)和抗人IgG抗体之间的结合，也解决了抗人IgG抗体标记PE所导致的血小板抗体和抗人IgG抗体在结合过程中受到PE荧光空间位阻的干扰，进一步减小了空间位阻，同时显著提高了抗人IgG抗体与血小板抗体的有效结合，使参与有效反应的抗人IgG抗体明显增加，信号值上升，从而进一步提高了检测结果的灵敏度、准确性与特异性。

[0037] 3、本发明提供的一种试剂盒，通过添加捕获抗体微球混合液，可一次性检测五种特异性抗体，显著提高试剂盒的检测效率和准确度，同时降低检测时间、降低试剂和人工的成本，解决了现有制备方法制备得到的试剂盒检测效率低和准确度低的问题。

[0038] 4、本发明提供的一种试剂盒，通过改进了血小板裂解液和血小板反应缓冲液的配方，显著提高检测结果的准确性、灵敏度与特异性。

[0039] 5、本发明制得的试剂盒，使用方法简单，且仅需一步孵育、一次洗涤，即可使试剂盒检测结果的准确性和灵敏度均得到显著提高，且当样本中五种血小板抗体含量为10μg/mL时，仍可检出，且阳性率为100％；同时具有结果较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数不大于5％，批间实验的变异系数不大于8％。

[0040] 图1为本发明实施例的抗人GPⅨ特异性抗体、抗人IgG抗体、第一荧光微球、生物素和藻红蛋白标记的链霉亲和素之间的关系示意图。

[0041] 图2为本发明实施例的捕获抗体微球的分布情况。

[0042] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的的通常意义。本实施例中使用的试剂，除特别声明外，均为已知产品，通过购买市售产品获得。

[0043] 本发明的一些实施例，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有100‑300微克捕5 6
获抗体，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有2.5×10～1.0×10个微球，所述捕获抗体包括抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体，所述微球包括第一荧光微球、第二荧光微球、第三荧光微
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球、第四荧光微球和第五荧光微球。每毫升捕获抗体微球混合液中，微球的数量为2.5×10
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～1.0×10 个，使得特异性抗体的效价较好。一些具体实施例，控制每毫升所述捕获抗体微球混合液含有110微克、150微克、200微克、250微克和290微克的任意一种捕获抗体，控制每
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毫升所述捕获抗体微球混合液含有3.0×10个、5.0×10 个、7.0×10个、8.6×10个和9.9
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×10个的任意一种微球。

[0044] 本发明的一些实施例，所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球的内部包被有不同浓度的别藻蓝蛋白以使所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球显示出不同的荧光强度。

[0045] 本发明的一些实施例，所述每毫升所述捕获抗体微球混合液的所述抗人GPⅨ特异性抗体、所述抗人GPⅠb特异性抗体、所述抗人GPⅡb特异性抗体、所述抗人GPⅢa特异性抗体和所述抗人GMP140特异性抗体的含量相同，所述每毫升所述捕获抗体微球混合液的所述第一荧光微球、所述第二荧光微球、所述第三荧光微球、所述第四荧光微球和所述第五荧光微球的数量相同。

[0046] 本发明的一些实施例，微球为羧基修饰的不同大小的聚苯乙烯微球，每种聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白(APC)，不同种聚苯乙烯微球可以通过在Beckman公司生产的DxFLEX流式细胞仪上的别藻蓝蛋白通道荧光信号值(APC‑A)及别藻蓝蛋白偶联A750染料通道荧光信号值(APC‑A750‑A)来区分两个通道，A指通过激光时，产生波状信号的曲线下的面积，代表信号强度。可以将聚苯乙烯微球划分成5种不同参数的微球，对应P1～P5类型的荧光微球的APC‑A及APC‑A750‑A通道的检测结果，荧光强度见表1。

[0047] 表1、P1～P5类型的荧光微球的APC‑A及APC‑A750‑A通道的荧光强度检测结果[0048]微球类型 APC‑A强度 APC‑A750‑A强度
P1 2851882.25 12902457.00
P2 1433105.00 4528134.50
P3 544526.88 1391808.25
P4 167505.20 413587.18
P5 58247.20 141151.70

[0049] 一些具体实施例，所述抗人GPⅨ特异性抗体负载于所述第一荧光微球，所述抗人GPⅠb特异性抗体负载于所述第二荧光微球，所述抗人GPⅡb特异性抗体负载于所述第三荧光微球，所述抗人GPⅢa特异性抗体负载于所述第四荧光微球，所述抗人GMP140特异性抗体负载于所述第五荧光微球。

[0050] 本发明一些实施例，所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液的制备步骤为：取第一荧7
光微球1.0×10个，加入500微升含Tween‑20的磷酸盐缓冲液(英文简称PBST)清洗两次，分别加入100微克1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(简称为EDC)和50微克N‑羟基琥珀酰亚胺(简称为NHS)活化第一荧光微球30min，加入100微克抗人GPⅨ特异性抗体室温旋转反应5h，清洗第一荧光微球去除多余的抗人GPⅨ特异性抗体后加入5％脱脂奶粉封闭30分钟，去除封闭液后加入500微升pH值为7.2的三羟甲基氨基甲烷(英文简称Tris)缓冲液后即得所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液。

[0051] 本发明的一些实施例，所述抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液的制备步骤、抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液的制备步骤、抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液的制备步骤和抗人GMP140特异性抗体微球溶液的制备步骤与所述抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液的制备步骤相似，不同之处在于：特异性抗体不同，荧光微球不同。一些具体实施例，不同所述特异性抗体与不同所述荧光微球溶液混合，不同所述荧光微球溶液是指所述荧光微球溶液中的荧光微球的内部含有不同浓度的别藻蓝蛋白以使得荧光微球显现出不同的荧光强度，用于区分所述特异性抗体的种类。具体的，所述荧光微球选自羧基修饰的聚苯乙烯微球。

[0052] 所述抗人GPⅨ特异性抗体购自MyBioSource，货号为MBS224431；所述抗人GPⅠb特异性抗体购自Beckman，货号为IM0409；所述抗人GPⅡb特异性抗体购自Biorbyt，货号为orb434440；所述抗人GPⅢa特异性抗体购自Biorbyt，货号为orb198049；所述抗人GMP140特异性抗体购自Thermo Fisher，货号为14‑0628‑82；

[0053] 以下通过具体的实施例对本发明实施例技术方案进行详细阐述。

[0054] 实施例中所使用仪器的生产厂家及其型号或者牌号见表2。

[0055] 表2、仪器的生产厂家及其型号或者牌号：

[0056]仪器名称 生产厂家 型号
流式细胞仪 贝克曼库尔特公司 DXFLEX
离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司 TGL‑16M
96孔板混匀仪 大龙兴创实验仪器(北京)股份公司 MX‑M

[0057] 实施例1本发明提供试剂盒及其检测方法

[0058] 一、溶液、对照品的配制

[0059] 本实施例提供的基于流式细胞仪同时检测五种血小板抗体(抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体)的试剂盒包括捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、封闭剂溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、血小板洗涤液、洗涤缓冲液、血小板反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。

[0060] 1、捕获抗体微球混合液的制备

[0061] 各取0.5毫升抗人GPⅨ特异性抗体微球溶液、抗人GPⅠb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅡb特异性抗体微球溶液、抗人GPⅢa特异性抗体微球溶液和抗人GMP140特异性抗体微球溶液混合均匀后得到含有五种捕获抗体的微球溶液，然后使用血小板反应缓冲液稀释100‑300倍，本实施例中具体为取97.5毫升血小板反应缓冲液加入上述含有五种捕获抗体微球溶液得到捕获抗体微球混合液，控制每毫升捕获抗体微球混合液含有5微克捕获抗体(捕获抗体由抗人GPⅨ特异性抗体、抗人GPⅠb特异性抗体、抗人GPⅡb特异性抗体、抗人GPⅢa特异性抗体和抗人GMP140特异性抗体组成)。

[0062] 2、检测抗体溶液的制备

[0063] 1、封闭剂的制备：分别取BSA(牛血清白蛋白)15g、甘氨酸1g、明胶水解物1g、PEG(聚乙二醇)2mL、CE210 1.5mL，向其中加入磷酸盐缓冲液(浓度为0.01mol/L)配制成1000mL的封闭剂。其中，BSA购自Proliant，货号为69760；甘氨酸购自Sigma，货号为C8654；明胶水解物购自Sigma，货号为G0262；PEG购自Sigma，货号为P7181；BlockmasterTM CE210购自MBL，货号为CE210；

[0064] 2、抗人IgG抗体的制备，具体如下：

[0065] (1)免疫筛选：市售的人IgG蛋白(厂家上海领潮生物，型号L1I008)免疫小鼠，通常采用皮下注射，腹腔和静脉注射，激发其免疫系统产生抗体，筛选出可以分泌抗体并且效价最高的单克隆细胞株。

[0066] (2)测序优化：经mRNA测序获得IgG抗体重链和轻链可变区核苷酸序列，抗体重链和轻链的可变区主要由CDR和骨架区(FR)组成。CDR是负责识别和结合抗原的区域，决定了抗体的特异性。骨架区主要起着支持CDR的作用，它们的氨基酸组成和排列相对不易改变，因此，将获得的鼠单抗IgG的CDR移植到人单抗的骨架区，就有可能使抗体人源化，并最大限度地降低鼠单抗的异源性。

[0067] (3)真核表达重组抗体：使用金斯瑞公司提供的密码子优化服务，合成重组抗体的H链/L链基因，载体质粒为pcDNA3.4(金斯瑞公司提供)，构建pcDNA3.4重组载体(金斯瑞公司提供)，利用感受态细胞制备大量质粒。转染当天将处于对数生长期的Expi293F细胞密度TM调整到2.5E6/mL，使用的培养基为Expi293 表达培养基(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，A1435101)。转染100mL细胞需使用100μg质粒(其中H链质粒35.5μg，L链质粒64.5μg)，加230μLHieff  悬浮细胞专用脂质体核酸转染试剂(翌圣生物科技(上海)股份有限公司，
40805ES08)。在37℃，8％二氧化碳条件下培养4‑5天后，3000G离心20分钟收集培养基，0.22μM滤膜过滤。得到的培养基上清通过10mM PBS(pH7.4)过柱的AT Protein A Diamond亲和层析介质(博格隆，AA0272)，结合在介质上的抗体通过10倍柱体积的100mM甘氨酸(pH3.1)洗脱，检测获得抗体质量，用10mM PBS(pH7.4)透析，‑20℃保存。

[0068] 3、分别取上述抗人IgG抗体溶液、封闭剂和生物素，将封闭剂加入抗人IgG抗体溶液中进行封闭处理，混合均匀后，加入生物素进行标记处理以得到生物素标记的检测抗体溶液，然后将生物素标记的检测抗体用血小板反应缓冲液稀释后得到检测抗体溶液，所述抗人IgG抗体与封闭剂的摩尔比为1:(1～5)，本实施例中，具体为1:2；所述抗人IgG抗体与生物素的摩尔比为1:(5～20)，本实施例中，具体为1:10；控制每毫升检测抗体溶液含有5‑10微克检测抗体，本实施例中，具体为5微克；控制每毫升检测抗体溶液含有0.1‑0.5微克生物素，本实施例中，具体为0.5微克；其中，生物素为琥珀酰亚胺‑6‑(生物素酰氨基)‑6‑己酰氨基己酸酯。

[0069] 3、偶联物溶液的制备

[0070] 使用荧光素标记链霉亲和素溶液，将所述荧光素链霉亲和素溶液混合均匀后使用血小板反应缓冲液稀释以得到偶联物溶液，其中，每毫升偶联物溶液中含有1‑5微克荧光素标记的链霉亲和素，本实施例中，具体为2微克；所述荧光素链霉亲和素中的荧光素包括藻红蛋白、别藻蓝蛋白、紫草素叶绿素、异硫氰酸荧光素中的任意一种，本实施例中，具体为藻红蛋白。

[0071] 4、血小板裂解液的制备

[0072] 将6.3克Tris、8.95克NaCl、0.5g四甲基氯化铵(生产厂家：Sigma)溶于1000mL纯水中，然后加入质量分数为1％的TritonX‑100(生产厂家：Sigma)和质量分数为0.1％的SDS(生产厂家：BBI生命科学)得到血小板裂解液。

[0073] 5、血小板洗涤液(10X)的制备

[0074] 将5克乙二胺四乙酸(生产厂家：国药集团化学试剂有限公司，简称为EDTA)、2.3克KH2PO4、36.3克Na2HPO4·12H2O、80克NaCl和2克KCl溶于1000毫升纯水配制成质量分数为0.5％的EDTA溶液，然后加入质量分数为0.3％的Krovin500(生产厂家：西宝生物)，并调节溶液的pH值至7.4得到血小板洗涤液(10X)，备用。

[0075] 6、血小板洗涤液(1X)的制备

[0076] 将血小板洗涤液(10X)稳定到室温，待所有盐溶解；10mL血小板洗涤液(10X)加入到90mL纯水中得到血小板洗涤液(1X)。

[0077] 7、洗涤缓冲液(10X)的制备

[0078] 将2.4克KH2PO4、36.32克Na2HPO4·12H2O、8克NaCl、2克KCl溶于1000mL纯水中，然后加入20克牛血清白蛋白(生产厂家：Proliant，简称为BSA)、质量分数为1.5％的ProClin300(生产厂家：Sigma)和质量分数为0.8％的Tween‑20(生产厂家：Sigma)得到洗涤缓冲液(10X)，备用。

[0079] 8、洗涤缓冲液(1X)的制备

[0080] 将洗涤缓冲液(10X)稳定到室温，待所有盐溶解；10mL洗涤缓冲液(10X)加入到90mL纯水中得到洗涤缓冲液(1X)。

[0081] 9、阳性对照品

[0082] 将抗人GPⅨ抗体、抗人GPⅠb抗体、抗人GPⅡb抗体、抗人GPⅢa抗体和抗人GMP140抗体上的氨基和人IgG上的氨基结合分别形成抗人GPⅨ抗体偶联IgG抗体，抗人GPⅠb抗体偶联IgG抗体、抗人GPⅡb抗体偶联IgG抗体、抗人GPⅢa抗体偶联IgG抗体、抗人GMP140抗体偶联IgG抗体；将5种偶联IgG的抗体混合后得到。

[0083] 10、阴性对照品的制备

[0084] 将3.5克Tris、9.1克NaCl溶于1000mL纯水中，然后加入23克牛血清白蛋白(生产厂家：Proliant，简称为BSA)、质量分数为0.2％的Krovin500(生产厂家：西宝生物)得到阴性对照品，备用。

[0085] 11、血小板反应缓冲液的制备

[0086] 将6.5克Tris、8.65克NaCl、2.05克N‑月桂酰肌氨酸钠盐溶于1000mL纯水中，然后加入10克牛血清白蛋白(生产厂家：Proliant，简称为BSA)、质量分数为0.3％的Krovin500(生产厂家：西宝生物)和质量分数为0.2％的Tween‑20(生产厂家：Sigma)得到血小板反应缓冲液，备用。

[0087] 12、试剂盒的制备

[0088] 2.0毫升捕获抗体微球混合液装入第一包装瓶，2.0毫升检测抗体溶液装入第二包装瓶，2.0毫升偶联物溶液装入第三包装瓶，20毫升血小板裂解液装入第四包装瓶，30毫升血小板洗涤液(10X)装入第五包装瓶，20毫升洗涤缓冲液(10X)装入第六包装瓶，1.25毫升阳性对照品装入第七包装瓶，2毫升阴性对照品装入第八包装瓶，将第一包装瓶、第二包装瓶、第三包装瓶、第四包装瓶、第五包装瓶、第六包装瓶、第七包装瓶和第八包装瓶装入包装盒中以得到试剂盒。其中，试剂盒为100人份/盒。

[0089] 二、试剂盒的使用方法

[0090] 采用本实施例制备的试剂盒，使用方法如下：

[0091] S0：提供血小板、捕获抗体微球混合液、检测抗体溶液、偶联物溶液、血小板裂解液、洗涤缓冲液、阳性对照品和阴性对照品；

[0092] S1：使用所述血小板裂解液对所述血小板进行裂解，离心取上清液以得到待检样本；

[0093] S2：分别向每管中加入20μL捕获抗体微球混合液、100μL样本、20μL检测抗体溶液、25μL偶联物溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h(一步孵育)；

[0094] S3：加入1000μL的1×洗涤缓冲液，进行涡旋重悬，以得到待检测物(一次洗涤)；

[0095] S4：检测所述待检测物的荧光类型和荧光强度，以得到所述待检测物中是否含有血小板抗体。具体的检测过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。

[0096] 三、检测原理

[0097] 本实施例提供的检测方法中，样品中的抗人GPIX抗体检测过程原理如图1所示，所述抗人GPⅨ特异性抗体2固定于所述第一荧光微球1，所述抗人IgG抗体4由所述生物素5标记，首先固定于所述第一荧光微球1上的所述抗人GPⅨ特异性抗体2与待测样品3之间特异性结合，然后与所述生物素5标记的所述抗人IgG抗体4之间特异性结合，最后与藻红蛋白6标记的链霉亲和素7之间结合，通过生物素5标记的所述抗人IgG抗体4和藻红蛋白6标记的链霉亲和素7实现了GPIX信号的联级放大。

[0098] 样品中的GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa、GMP140抗体检测过程原理与抗人GPIX抗体检测过程原理类似，所述抗人GPⅠb特异性抗体负载于所述第二荧光微球，所述抗人GPⅡb特异性抗体负载于所述第三荧光微球，所述抗人GPⅢa特异性抗体负载于所述第四荧光微球，所述抗人GMP140特异性抗体负载于所述第五荧光微球。

[0099] 四、试剂盒检测结果分析

[0100] 1、试剂盒的批内实验：

[0101] 取批次I试剂盒，用阳性对照品重复检测10次，计算10次结果的平均值x和标准差SD，计算变异系数CV。批内试验结果详见表3，表3中的数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)。

[0102] 表3批内试验结果：

[0103]成分 GPIX GPIb GPIIb GPIIIa GMP140
批次I试剂盒1 147334.7 345548.4 111024.6 15456.6 71346.1
批次I试剂盒2 145264.3 345693.4 98004.3 14689.2 70158.9
批次I试剂盒3 150215.6 316202.3 103136.6 15875.3 74153.5
批次I试剂盒4 149056.4 340523.6 95235.2 15982.2 69856.2
批次I试剂盒5 159106.1 355623.5 98356.9 14856.5 65295.2
批次I试剂盒6 150362.5 348756.2 96547.2 15563.2 70198.5
批次I试剂盒7 150480.2 348698.3 101035.8 14128.8 69003.2
批次I试剂盒8 149562.3 352632.5 99639.4 15256.4 70128.5
批次I试剂盒9 156265.9 326482.3 96154.3 14896.9 72110.1
批次I试剂盒10 143023.8 369248.6 95268.8 15024.4 71204.7
均值 150067.2 344940.9 99440.3 15172.9 70345.5
SD 4735.5 14832.0 4806.6 568.7 2285.3
CV 3.16％ 4.30％ 4.83％ 3.75％ 3.25％

[0104] 通过表3可知，试剂盒的批内试验的变异系数不大于5％。

[0105] 2、试剂盒的批间实验：

[0106] 取批次I、批次II和批次III试剂盒，用阳性对照品检测，每个批次重复检测10次，计算30次结果的平均值x和标准差SD，计算变异系数CV。批间试验结果详见表5，表4中的数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)。

[0107] 表4批间差试验结果：

[0108] 成分 GPIX GPIb GPIIb GPIIIa GMP140批次I试剂盒1 149718.2 368697.7 96421.4 15332.7 68120.4
批次I试剂盒2 140885.5 352300.4 115097.4 15421.4 70285.5
批次I试剂盒3 145776.5 369683.1 116355.6 15218.8 69956.7
批次I试剂盒4 144207.4 338931.5 115541.4 14953.5 71038.5
批次I试剂盒5 140468.5 335632.1 108224.3 15163.2 70157.3
批次I试剂盒6 147931.8 322150.3 116779.1 15759.7 71791.4
批次I试剂盒7 142667.1 347909.1 99902.7 14553.8 71918.5
批次I试剂盒8 140928.1 354848.1 97183.5 15442.5 69345.7
批次I试剂盒9 145114.5 353403.7 111021.2 15532.2 70169.3
批次I试剂盒10 148846.5 333685.6 116141.7 15308.3 72051.5
批次II试剂盒1 148713.8 325041.3 96033.7 14682.7 68924.7
批次II试剂盒2 149901.7 363689.5 100920.3 14423.5 71645.7
批次II试剂盒3 149640.4 329809.7 114183.3 14225.7 70113.6
批次II试剂盒4 140406.6 349207.8 115424.5 15768.4 68732.3
批次II试剂盒5 145821.6 347329.4 97383.8 15097.5 70766.8
批次II试剂盒6 141540.5 321780.4 102112.9 15455.3 71552.4
批次II试剂盒7 147273.5 343747.5 96464.1 14262.7 72682.6
批次II试剂盒8 147988.7 322507.7 104637.4 14507.8 68927.7
批次II试剂盒9 150572.1 325920.4 115277.5 14085.8 68244.6
批次II试剂盒10 143938.5 367621.1 97723.6 14403.4 72693.7
批次III试剂盒1 148085.6 339437.6 119031.3 15664.5 68962.7
批次III试剂盒2 146839.7 342160.7 104446.4 14075.7 68680.3
批次III试剂盒3 149132.4 351510.4 116443.7 15435.9 72034.7
批次III试剂盒4 146703.4 343270.1 96583.7 14530.4 72063.8
批次III试剂盒5 150109.1 347227.6 98561.8 14894.4 72298.2
批次III试剂盒6 145157.6 357746.3 101280.6 14289.6 70071.1
批次III试剂盒7 145423.5 363111.7 116587.7 15728.7 72583.7
批次III试剂盒8 146647.5 340759.6 96297.7 15470.6 69376.6
批次III试剂盒9 142225.7 343678.4 111355.3 14005.7 69429.7
批次III试剂盒10 149334.4 338046.7 113624.2 15046.3 72834.9
均值 146066.7 344694.9 106901.4 14958.0 70581.8
SD 3216.4 14073.6 8450.2 570.7 1499.6
CV 2.20％ 4.08％ 7.90％ 3.82％ 2.12％

[0109] 通过表4可知，试剂盒的批间试验的变异系数不大于8％。

[0110] 五、使用本发明提供的试剂盒检测样品

[0111] 按照下述步骤进行加样：

[0112] (1)待测样本制备：采集2mL全血样本，在200g条件下离心5min，分离富含血小板的血浆，取富含血小板的血浆500μL，在3000g条件下离心2min，弃上清，下层为血小板，加入800μL血小板洗涤液，在3000g条件下离心2min，弃上清，用血小板洗涤液洗涤三遍；

[0113] (2)阳性对照制备：提取1份正常人血小板；加入50μL试剂盒内的阳性对照品在18‑25摄氏度下振荡孵育0.5h；

[0114] (3)阴性对照制备：取3个阴性对照管，各加入100μL阴性对照品，得3份阴性对照；

[0115] (4)向待测样本血小板、阳性对照中各加入120μL血小板裂解液，充分混合均匀；

[0116] (5)将待测样本、阳性对照置于离心机中，离心机在3000g的条件下离心20min，取上清液各100μL分别加入至待测样本管、阳性对照管中；

[0117] (6)分别向待测样本管、阳性对照管、阴性对照管中加入20μL捕获抗体微球混合液、20μL检测抗体溶液、25μL偶联物溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h(一步孵育)；

[0118] (7)向待测样本管、阳性对照管、阴性对照管中分别加入1000μL洗涤缓冲液(1X)，涡旋重悬(一次洗涤)；

[0119] (11)将待测样本管、阳性对照管、阴性对照管置于离心机中，离心机在300g的条件下离心5min，弃上清液，保留微球；

[0120] (12)加入150～300μL洗涤缓冲液(1X)，涡旋重悬，使用Beckman公司生产的DxFLEX流式细胞仪检测；

[0121] (13)使用FCAP ArrayTMSoftwareVersion3.0对检测结果进行分析。

[0122] 图2为本发明实施例的捕获抗体微球的分布情况。

[0123] 参照图2，以别藻蓝蛋白通道荧光信号值(简称为APC‑A)为横坐标，横坐标用于区分荧光微球所带别藻蓝蛋白的荧光强度，以前向角散射光通道荧光信号值(简称为FSC‑A)为纵坐标，纵坐标用于区分荧光微球的大小。由横坐标可知，通过别藻蓝蛋白的吸光度能够区分出：P1代表的是第一荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅨ特异性抗体；P2代表的是第二荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅠb特异性抗体；P3代表的是第三荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅡb特异性抗体；P4代表的是第四荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GPⅢa特异性抗体；P5代表的是第五荧光微球，对应的捕获抗体为抗人GMP140特异性抗体。

[0124] 以3份阴性对照检测结果平均值作为阴性对照均值。

[0125] 临界值按照如下公式计算：

[0126] GPⅨ的临界值＝2.7×阴性对照均值；

[0127] GPⅠb的临界值＝2.0×阴性对照均值；

[0128] GPⅡb的临界值＝2.4×阴性对照均值；

[0129] GPⅢa的临界值＝3.9×阴性对照均值；

[0130] GMP140的临界值＝1.5×阴性对照均值；阳性符合率和阴性符合率评价的测试数据见表5和表6，表5和表6数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)。

[0131] 表5、使用本发明试剂盒的阳性符合率评价结果

[0132]   GPIX GPIb GPIIb GPIIIa GMP140阴性对照均值 2011.07 1302.53 592.23 2027.33 1348.80
临界值 5429.88 2605.07 1421.36 7906.60 2023.20
阳性对照1 13948.10 6621.10 28289.00 37030.40 163870.30
阳性对照2 13771.70 6967.60 25461.20 36666.50 166926.20
阳性对照3 13658.60 6987.20 28876.00 36944.60 165073.41
阳性对照4 14381.70 7498.50 25065.90 36170.90 165363.41
阳性对照5 14468.50 335632.1 26085.30 36163.20 170157.30
阳性对照6 14731.80 322150.3 25905.10 36759.70 161791.40
阳性对照7 14267.10 347909.1 26320.70 36553.80 161918.50
阳性对照8 14092.10 354848.1 27502.50 36442.50 169345.70
阳性对照9 14511.50 353403.7 27825.20 36532.20 170169.30
阳性对照10 14846.50 333685.6 28053.70 36308.30 162051.50

[0133] 注：临界值用于判断阳性对照的阴阳性，当阳性对照的数值大于临界值时，阳性对照显示阳性；

[0134] 表6、使用本发明试剂盒的阴性符合率评价结果

[0135]  GPIX GPIb GPIIb GPIIIa GMP140
阴性对照均值 2011.07 1302.53 592.23 2027.33 1348.80
临界值 5429.88 2605.07 1421.36 7906.60 2023.20
阴性对照1 2104.70 1265.40 660.70 1987.90 1670.90
阴性对照2 1929.10 1154.50 882.00 1793.90 1498.00
阴性对照3 2099.90 1276.20 611.20 1725.30 1633.30
阴性对照4 2062.60 1161.10 584.60 1913.40 1367.10
阴性对照5 1771.80 1408.10 766.40 1959.60 1451.30
阴性对照6 1904.00 1192.60 808.20 1826.40 1389.50
阴性对照7 1961.20 1210.10 751.40 1878.10 1434.60
阴性对照8 1908.70 1262.00 593.60 2008.40 1309.90
阴性对照9 1989.30 1284.30 586.00 1990.90 1331.20
阴性对照10 2135.20 1361.30 597.10 2082.70 1405.30

[0136] 注：临界值用于判断阴性对照的阴阳性，当阴性对照的数值小于临界值时，阴性对照显示阴性；

[0137] 通过表5和表6可知，对10份阳性对照进行检测，结果阳性率100％，对10份阴性对照进行检测，结果阴性率100％，说明使用本发明所述用于检测血小板抗体的试剂盒检测结果准确率较高。

[0138] 六、使用本发明提供的试剂盒检测健康人和自身免疫性血小板减少症患者[0139] 本实施例提供了3例健康人和3例自身免疫性血小板减少症患者中GPⅨ、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa、GMP140的判读结果。血小板抗体阳性判断标准为5个指标中如有一个为阳性即判为阳性，3例健康人和3例自身免疫性血小板减少症患者的判读结果见表7，表7数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)。

[0140] 表7、健康人和自身免疫性血小板减少症患者的判读结果

[0141]   GPIX GPIb GPIIb GPIIIa GMP140 是否阳性阴性对照均值 2011.07 1302.53 592.23 2027.33 1348.80 /
临界值 5429.88 2605.07 1421.36 7906.60 2023.20 /
健康人1 2303.80 1222.90 749.60 748.30 1063.70 否
健康人2 2099.20 1337.80 796.50 736.71 1069.50 否
健康人3 1934.10 1398.90 828.00 734.20 1213.00 否
患者1 105055.50 1381.60 862.00 689.10 1206.60 是
患者2 11877.10 36266.90 3235.50 4581.40 14245.60 是
患者3 85906.25 1619.80 2152.20 3035.20 135752.50 是

[0142] 通过表7中的数据可知，健康人中血小板抗体均为阴性，自身免疫性血小板减少症患者的血小板抗体均为阳性。本发明提供的试剂盒一次可检测五种血小板抗体，且检测结果的准确率较高。

[0143] 综上可知，本发明制备得到的可同时检测五种血小板抗体的试剂盒，检测的准确性与灵敏度均显著提升，当样本中五种血小板抗体的含量仅为10μg/mL时，仍可检出，且阳性率为100％。

[0144] 实施例2抗人IgG抗体的制备方法对试剂盒检测结果的影响

[0145] 为验证实施例1中使用最佳方法制备得到的抗人IgG抗体对试剂盒检测结果的准确度与灵敏度存在显著影响，本实施例中对不同抗人IgG抗体的效果进行了对比测试，具体如下(本实施例中，除抗人IgG抗体的优化外，其余制备方法均为实施例1中最佳制备方法)：

[0146] 一、抗人IgG抗体的优化与筛选

[0147] 1、设计抗体氨基酸序列的突变

[0148] 将IgG抗体的原始序列输入数据库IgBlast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，分别获得所有H/L链的CDR3区序列，随后参考IMGT数据库中相似性较高的序列对CDR3区设计单个或多个氨基酸突变。

[0149] 所述IgG原始序列中，IgG‑L的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列具体如SEQ ID NO.2所示；IgG‑H的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列具体如SEQ ID NO.4所示。

[0150] 针对重组IgG抗体的L链DNA序列，CDR3区对应碱基325‑354，设计了3种突变，其他区序列不变，具体如表8所示。

[0151] 表8、IgG抗体L链的突变序列

[0152]突变序列编号 CDR3区核苷酸序列 CDR3区氨基酸序列
原序列L GCCCCTTATTGCACCGCCTCTTGTGTGATC APYCTASCVI
L‑1 GCCCCTTATTGGACCGCCTCTTGTGTGATC APYWTASCVI
L‑2 GCCCCTTATTGCACCGCCTCTAAGGTGATC APYCTASKVI
L‑3 GCCCCTTATTTCATCGCCTCTTGTGTGATC APYFIASCVI

[0153] 针对重组IgG抗体的H链DNA序列，CDR3区对应碱基340‑378，设计了3种突变，其他区序列不变，具体如表9所示。

[0154] 表9、IgG抗体H链的突变序列

[0155]

[0156] 2、抗体氨基酸序列的筛选

[0157] 将含有原始序列和不同突变序列的抗体的H/L链两两组合，使用pcDNA3.4载体和expi293F细胞表达，获得16种配对，并制备得到16种IgG抗体，具体组合方式见表10。

[0158] 表10、IgG抗体的突变序列配对检测结果

[0159]序列组合1 序列组合2 序列组合3 序列组合4
原始H/原始L H‑1/原始L H‑2/原始L H‑3/原始L
序列组合5 序列组合6 序列组合7 序列组合8
原始H/L‑1 H‑1/L‑1 H‑2/L‑1 H‑3/L‑1
序列组合9 序列组合10 序列组合11 序列组合12
原始H/L‑2 H‑1/L‑2 H‑2/L‑2 H‑3/L‑2
序列组合13 序列组合14 序列组合15 序列组合16
原始H/L‑3 H‑1/L‑3 H‑2/L‑3 H‑3/L‑3

[0160] 二、不同抗人IgG抗体对检测结果的影响

[0161] 为进一步测试上述优化后的16组序列制备得到的IgG抗体的效果，本实施例中，按照表10中的组合方案，使用不同的序列组合分别制备抗人IgG抗体，并分别按照本发明实施例1中最佳制备方法制备试剂盒；同时再取市售的抗人IgG抗体(厂家BIO‑RAD，型号MCA647G)，分别按照本发明实施例1中最佳制备方法制备试剂盒；选取一例血小板抗体阳性参考品(所述阳性参考品中，五种血小板抗体的浓度为10μg/mL，具体配制如实施例3中所述)进行测试，具体结果如表11所示，表11数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)

[0162] 表11、不同抗人IgG抗体制备的试剂盒对检测结果的影响

[0163] 不同试剂盒 GPIX测试值 GPIb测试值 GPIIb测试值 GPIIIa测试值 GMP140测试值临界值 5427.88 2598.02 1423.12 7901.5 2025.1市售IgG抗体 7345.63 3363.45 2421.13 3669.61 1865.14
序列组合1 5315.36 9335.41 8173.36 4636.91 5139.31
序列组合2 4149.63 9546.75 6637.41 1364.18 8766.39
序列组合3 4385.91 3636.33 6591.63 1636.43 8134.13
序列组合4 5136.31 10639.35 5613.53 10656.33 7363.41
序列组合5 8775.63 9564.54 4887.89 9613.63 8544.14
序列组合6 1056.31 9665.45 1653.34 8713.62 7815.63
序列组合7 7869.94 1339.41 5167.35 9543.36 8016.34
序列组合8 8671.45 9573.69 1044.63 1035.33 7877.45
序列组合9 1111.36 9986.68 1643.25 9639.87 1116.35
序列组合10 2135.31 3069.25 6637.34 2136.63 5234.35
序列组合11 6173.35 9363.43 4036.61 7679.15 2163.34
序列组合12 8697.69 9559.61 7997.68 9136.65 8767.15
序列组合13 5034.18 4369.97 2043.36 6447.74 7416.53
序列组合14 14694.65 11158.74 9146.63 20135.63 9857.98
序列组合15 11036.34 1363.54 4673.61 1963.36 6356.65
序列组合16 5335.41 8994.15 5116.53 10612.32 7337.96

[0164] 从表11中可知，对于上述五种血小板抗体，选择不同抗人IgG抗体制备试剂盒，对检测结果的准确性与灵敏度均具有极大影响。相比于竞品试剂盒或优化前序列或市售IgG抗体，当优选组合14优化后的序列制备抗人IgG抗体时，最终制备得到的试剂盒对五种血小板抗体检测的准确性和灵敏度均发生显著提高，这可能是因为优化后的抗人IgG抗体和抗体间结合力更强，从而显著提高了试剂盒检测结果的准确性与灵敏度。

[0165] 其中，所述组合14最终优化后制得抗人IgG抗体(H‑1/L‑3)；所述抗人IgG抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

[0166] 所述编码抗人IgG抗体的重链的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0167] 由此可知，本实施例中，优选组合14优化后的序列制备抗人IgG抗体，此时试剂盒对五种血小板抗体检测结果的准确度与灵敏度均显著提升。

[0168] 实施例3封闭剂提高检测准确性和灵敏度的效果

[0169] 一、加入封闭剂对五种血小板抗体检测结果的影响

[0170] 为验证在检测抗体溶液中加入封闭剂可显著降低抗人IgG抗体溶液和生物素之间的空间位阻，本实施例中对是否加入封闭剂的效果以及加入封闭剂的顺序进行了对比测试，且在实验过程中，发现五种血小板抗体的检测结果变化趋势基本一致，因此，在本实施例中，选择GPIX抗体的检测浓度数据来进行对比(本实施例中，除封闭剂外，其余制备方法均为实施例1中最佳制备方法)：

[0171] 1、制备试剂盒1：按照实施例1的方法制备试剂盒1，在制备检测抗体溶液中，向抗人IgG抗体溶液中加入封闭剂后，再加入生物素，按最佳比例稀释后得到检测抗体溶液；

[0172] 2、制备试剂盒2：按照实施例1的方法制备试剂盒2，区别为：在制备检测抗体溶液中，向抗人IgG抗体溶液中加入生物素后，再加入封闭剂，按最佳比例稀释后得到检测抗体溶液；

[0173] 3、制备试剂盒3：按照实施例1的方法制备试剂盒3，区别为：在制备检测抗体溶液中，只加入生物素标记后的抗人IgG抗体溶液，不加入封闭剂，按最佳比例稀释后得到检测抗体溶液；

[0174] 4、取2份参考品，分别采用试剂盒1～3进行检测，每个参考品分别检测3次，检测结果如表12所示，表12数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)(阳性参考品的配制：将五种血小板抗体GPIX、GPⅠb、GPⅡb、GPⅢa、GMP140标准品配制成混合溶液，作为校准工作液的储备液，参考品采用血小板反应缓冲液配制，从而配制参考品；其中，参考品1中，五种血小板抗体的浓度均为10μg/mL，参考品2中，五种血小板抗体的浓度均为15μg/mL；其中，血小板抗体GPIX购自BD，货号为558816；血小板抗体GPⅠb购自biobyt，货号为orb636345；血小板抗体GPⅡb购自Thermo Fisher，货号为MA1‑19246；血小板抗体GPⅢa购自Beckman，货号为IM0540；血小板抗体GMP140购自Thermo Fisher，货号为MA1‑34004。

[0175] 表12、封闭剂对样品检测结果的影响

[0176]

[0177]

[0178] 从表12中可知：与试剂盒2与试剂盒3检测结果相比，试剂盒1对抗体GPIX的检测结果均明显增大，可知当不加入封闭剂或改变封闭剂的加入顺序时，最终检测结果均会发生显著降低。这可能是因为在生物素引入放大系统的基础上，加入封闭剂对优化后的IgG抗体序列的结合位点进行封闭，显著降低了样本中其余抗体(非血小板抗体)和抗人IgG抗体之间的结合，也解决了抗人IgG抗体标记PE所导致的血小板抗体和抗人IgG抗体在结合过程中受到PE荧光空间位阻的干扰，从而进一步显著降低空间位阻；同时，显著提高了抗人IgG·抗体与血小板抗体的有效结合，使参与有效反应的抗人IgG抗体明显增加，信号值上升，从而提高检测的灵敏度、准确性与特异性。

[0179] 由此可知，在本发明检测抗体溶液的配制中，需先加入封闭剂再加入生物素标记IgG抗体，封闭剂的加入进一步减小了空间位阻，同时显著提高了抗人IgG抗体与血小板抗体的有效结合，进一步提高了检测结果的灵敏度、准确性与特异性。

[0180] 二、加入不同封闭剂对五种血小板抗体检测结果的影响

[0181] 为进一步提高试剂盒对五种血小板抗体检测结果的灵敏度、准确性与特异性，本实施例中分别对不同的封闭剂的效果进行了对比测试，且由于五种血小板抗体的检测结果变化趋势基本一致，因此，在本实验中，仍选择GPIX抗体的检测浓度数据来进行对比，具体方案如表13所示：

[0182] 表13、生物素对样品检测结果的影响

[0183]

[0184] 注：表格中，CE510购自MBL，货号CE510；吐温‑20购自Sigma，货号P2287；卡拉胶购自Sigma，货号C1138；丙氨酸购自Sigma，货号A0325000；胎牛血清购自天杭生物，货号11011‑8611；

[0185] 按照表13中的方案，使用不同的封闭剂配方，分别按照本发明实施例1中最佳制备方法制备试剂盒1‑11，取2份已知浓度的校准品，分别采用试剂盒1～11和竞品试剂盒进行检测，每份分别检测3次，检测结果如表14所示，表14数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)。

[0186] 表14、不同封闭剂对样品检测结果的影响

[0187]

[0188] 从表14中可知：①与本发明制得的最佳试剂盒1相比，当减少所述封闭剂的任意一种组分或替换所述封闭剂的任意一种组分后，制得的试剂盒检测准确性与灵敏度均发生明显降低。

[0189] 由此可知，选用不同配方的封闭剂也会直接影响检测结果，其原因可能是不同的封闭剂对不同杂质的封闭效果有区别，只有当优选实施例1中最佳配方的封闭剂，才可显著提高检测结果的准确性、特异性与灵敏度。因此本实施例中，优选加入封闭剂1：BSA、甘氨酸、明胶水解物、PEG、CE210，降低抗人IgG抗体与样本中其余非特异性抗体的结合，从而提高检测结果的准确性、特异性与灵敏度。

[0190] 实施例4血小板裂解液的配方对试剂盒检测结果的影响

[0191] 为验证血小板裂解液的不同配方对试剂盒检测结果的准确度与灵敏度存在显著影响，本实施例中对血小板裂解液不同配方的效果进行了对比测试，且在实验过程中，发现GPIX、GPIb、GPIIb、GPIIIa和GMP140五种血小板抗体均可成功检测，且检测结果变化趋势基本一致。因此在本实施例中，选择GPIX抗体检测浓度数据来进行对比(本实施例中，除血小板裂解液的配方外，其余制备方法均为实施例1中最佳制备方法)：

[0192] 1、制备试剂盒1：按照实施例1的方法制备试剂盒1，所述血小板裂解液的配方为实施例1中最佳配方：将6.3克Tris、8.95克NaCl、0.5g四甲基氯化铵(生产厂家：Sigma)溶于1000mL纯水中，然后加入质量分数为1％的TritonX‑100(生产厂家：Sigma)和质量分数为
0.1％的SDS(生产厂家：BBI生命科学)得到血小板裂解液1；

[0193] 2、制备试剂盒2：按照实施例1的方法制备试剂盒2，区别为：所述血小板裂解液的配方为：将6.3克Tris、8.95克NaCl、0.5g四甲基氯化铵(生产厂家：Sigma)溶于1000mL纯水中，然后加入质量分数为1％的TritonX‑100(生产厂家：Sigma)得到血小板裂解液2；

[0194] 3、制备试剂盒3：将6.3克Tris、8.95克NaCl、0.5g四甲基氯化铵(生产厂家：Sigma)溶于1000mL纯水中，然后加入质量分数为0.1％的SDS(生产厂家：BBI生命科学)得到血小板裂解液3；

[0195] 4、取2份参考品，分别采用试剂盒1～3进行检测，每份分别检测3次，检测结果如表15所示，表15数值为藻红蛋白(PE)荧光通道的平均荧光强度(简称为MFI)(2份[0196] 参考品的配制具体如实施例3中所述)。

[0197] 表15、血小板裂解液的配方对样品检测结果的影响

[0198]

[0199] 从表15中可知，对于GPIX抗体，选择不同血小板裂解液的配方，对检测结果的准确性与灵敏度均具有极大影响。只有当选择实施例1中最佳血小板裂解液的配方时，样本的检测结果才可达到完全准确，且平均荧光强度显著高于临界值，说明本发明试剂盒检测灵敏度显著提升；而当减少血小板裂解液配方成分时，检测结果均会产生明显降低现象，从而显著降低检测结果的准确性与灵敏度。这可能是因为不同裂解液的裂解能力不同，较弱的裂解效果和过强的裂解效果均不能得到最理想的裂解效果。

[0200] 由此可知，本实施例中血小板裂解液的最佳配方优选为实施例1中的最佳配方：将6.3克Tris、8.95克NaCl、0.5g四甲基氯化铵(生产厂家：Sigma)溶于1000mL纯水中，然后加入质量分数为1％的TritonX‑100(生产厂家：Sigma)和质量分数为0.1％的SDS(生产厂家：
BBI生命科学)得到血小板裂解液。此时，所述制得的试剂盒可同时检测GPIX、GPIb、GPIIb、GPIIIa、GMP140五种血小板抗体，且检测结果的准确性、灵敏度与特异性均发生显著提升。

[0201] 实施例5血小板反应缓冲液的配方对试剂盒检测结果的影响

[0202] 为验证血小板反应缓冲液的不同配方对试剂盒检测结果的准确度与灵敏度存在显著影响，本实施例中对血小板反应缓冲液不同配方的效果进行了对比测试，且在实验过程中，发现GPIX、GPIb、GPIIb、GPIIIa和GMP140五种血小板抗体均可成功检测，且检测结果变化趋势基本一致，因此，在本实施例中，选择GPIX抗体的检测浓度数据来进行对比(本实施例中，除血小板反应缓冲液的配方外，其余制备方法均为实施例1中最佳制备方法)：

[0203] 1、制备试剂盒1：按照实施例1的方法制备试剂盒1，所述血小板反应缓冲液的配方为实施例1中最佳配方：将6.5克Tris、8.65克NaCl、2.05克N‑月桂酰肌氨酸钠盐溶于1000mL纯水中，然后加入10克牛血清白蛋白(生产厂家：Proliant，简称为BSA)、质量分数为0.3％的Krovin500(生产厂家：西宝生物)和质量分数为0.2％的Tween‑20(生产厂家：Sigma)得到血小板反应缓冲液1；

[0204] 2、制备试剂盒2：按照实施例1的方法制备试剂盒2，区别为：所述血小板反应缓冲液的配方为：将6.5克Tris、8.65克NaCl、2.05克N‑月桂酰肌氨酸钠盐溶于1000mL纯水中，然后加入10克牛血清白蛋白、质量分数为0.3％的Krovin500得到血小板反应缓冲液2；

[0205] 3、制备试剂盒3：按照实施例1的方法制备试剂盒3，区别为：所述血小板反应缓冲液的配方为：将6.5克Tris、8.65克NaCl、2.05克N‑月桂酰肌氨酸钠盐溶于1000mL纯水中，然后加入质量分数为0.3％的Krovin500和质量分数为0.2％的Tween‑20得到血小板反应缓冲液3；

[0206] 4、取2份参考品，分别采用试剂盒1～3进行检测，每份分别检测3次，检测结果如表16所示(2份参考品的配制具体如实施例3中所述)。

[0207] 表16、血小板反应缓冲液的配方对样品检测结果的影响

[0208]

[0209] 从表16中可知，对于GPIX抗体，选择不同血小板反应缓冲液的配方，对检测结果的准确性与灵敏度均具有极大影响。只有当选择实施例1中最佳血小板反应缓冲液的配方时，样本的检测结果才可达到完全准确，且平均荧光强度显著高于临界值，说明本发明试剂盒检测灵敏度显著提升；而当改变血小板反应缓冲液配方成分时，检测结果均会产生明显降低现象，从而显著降低检测结果的准确性与灵敏度。这可能是因为BSA和Tween‑20能够提高缓冲液的稳定性，因此当减少这两种成分时，检测结果准确性会明显降低。

[0210] 由此可知，本实施例中血小板反应缓冲液的最佳配方优选为实施例1中的最佳配方：将6.5克Tris、8.65克NaCl、2.05克N‑月桂酰肌氨酸钠盐溶于1000mL纯水中，然后加入10克牛血清白蛋白(生产厂家：Proliant，简称为BSA)、质量分数为0.3％的Krovin500(生产厂家：西宝生物)和质量分数为0.2％的Tween‑20(生产厂家：Sigma)得到血小板反应缓冲液。此时，所述制得的试剂盒可同时检测GPIX、GPIb、GPIIb、GPIIIa、GMP140五种血小板抗体，且检测结果的准确性、灵敏度与特异性均发生显著提升。

[0211] 实施例6本发明制得的试剂盒检测灵敏度、准确性与特异性均显著提升的验证实验

[0212] 为验证本发明实施例1中制得的试剂盒检测灵敏度、准确性与特异性均显著提升，本实施例中取5份不同的阳性参考品，分别使用本发明实施例1中优化后的最佳试剂盒、市售竞品试剂盒(生产厂家：元德维康；注册编号：苏械注准20192400533)以及本发明优化前试剂盒(所述优化前的试剂盒使用市售的抗人IgG抗体(厂家：Bio‑Rad，货号：MCA647G)，且未加入封闭剂，血小板裂解液与血小板反应缓冲液的配方也未经优化，其余均为常规制备方法)进行对比测试，每份阳性参考品均设置三组重复(5份阳性参考品的配制具体如实施例3中所述，其中，参考品1中，五种血小板抗体的浓度均为10μg/mL；参考品2中，五种血小板抗体的浓度均为15μg/mL；参考品3中，五种血小板抗体的浓度均为30μg/mL；参考品4中，五种血小板抗体的浓度均为40μg/mL；参考品5中，五种血小板抗体的浓度均为50μg/mL)。具体检测结果如表17所示：

[0213] 表17、不同试剂盒阳性样本的判读结果

[0214]

[0215] 从表17中可知，(1)使用本发明实施例1中优化后的最佳试剂盒对上述5份阳性参考品分别进行检测，最终均可成功检出，阳性率为100％；(2)使用市售竞品试剂盒对上述5份阳性参考品分别进行检测时，当参考品1中五种血小板抗体的浓度仅为10μg/mL时，均无法检出，均显示假阴性；当参考品2中五种血小板抗体的浓度为15μg/mL时，检测结果准确性不高，仍会显示假阴性；只有当参考品中五种血小板抗体的浓度为30μg/mL及以上时，最终才可成功检出；(3)而当使用本发明优化前试剂盒进行检测时，只有当参考品中五种血小板抗体的浓度为50μg/mL时及以上时，最终才可成功检出，不出现假阴性。

[0216] 由此可知，本发明制备得到的可同时检测五种血小板抗体的试剂盒，检测的准确性与灵敏度均显著提升，当样本中五种血小板抗体的浓度仅为10μg/mL时，仍可检出，且阳性率为100％。

[0217] 实施例7一步法孵育工艺的选择

[0218] 本实施例分别采用本发明实施例1中优化后的最佳试剂盒、市售竞品试剂盒以及本发明优化前试剂盒(所述优化前的试剂盒使用市售的抗人IgG抗体(厂家：Bio‑Rad，货号：MCA647G)对2份阳性参考品进行五种血小板抗体的检测，其中孵育工艺分别采用一步孵育法(实施例1)，和两步孵育法。

[0219] 两步孵育法操作步骤如下：(1)分别向每管中加入20μL捕获抗体微球混合液，100μL样本，20μL检测抗体溶液，充分混合均匀，室温避光静置1.5h；

[0220] (2)加入1000μL的1×洗涤缓冲液(一次洗涤)，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，离心去上清；

[0221] (3)每管中加25μL偶联物溶液，充分混合均匀，室温避光静置1.5h，加入1000μL的1×洗涤缓冲液，通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，离心去上清；(两步孵育)；

[0222] 2份阳性参考品的配制具体如实施例3中所述，其中，参考品1中，五种血小板抗体的浓度为10μg/mL；参考品2中，五种血小板抗体的浓度为15μg/mL；检测结果如表18所示，由于5种血小板抗体的检测结果变化趋势基本一致，因此这里以GPIX的检测结果示例，每份参考品进行3次重复检测。

[0223] 表18、不同孵育法的检测结果

[0224]

[0225]

[0226] 根据表18可以看出，本发明制备的试剂盒，采用一步孵育法就能准确检测，对于2份参考品，阳性检出率均为100％；而市售竞品试剂盒和本发明优化前试剂盒的一步孵育检测结果准确性严重降低，结果均为假阴性，且即使采用两步孵育法也依然不能达到本发明试剂盒一步孵育的效果，结果仍出现假阴性。

[0227] 虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。