| 热词 | 核酸 buffer 粪便 提取 a260 缓冲 tris naca 浓度 样品 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410597795.2 | 申请日 | 2024-05-14 |
| 公开(公告)号 | CN118460671A | 公开(公告)日 | 2024-08-09 |
| 申请人 | 壹宏(深圳)基因有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 陈佳耿; 文颖怡; 孙相鑫; | 第一发明人 | 陈佳耿 |
| 权利人 | 壹宏(深圳)基因有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 壹宏(深圳)基因有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省深圳市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省深圳市龙岗区葵涌街道三溪社区金业大道140号生命科学产业园A11栋306 | 邮编 | 当前专利权人邮编：518000 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/6806 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 深圳鼎合诚知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 李小焦; 彭家恩; |
| 摘要 | 本 申请 公开了一种 粪便 样品核酸提取的 试剂 盒 和方法。本申请试剂盒包括粪便样品处理液、第一裂解液、第二裂解液和结合液；粪便样品处理液缓冲液为Tris‑CA，Tris浓度10‑50mM，含有NaCl 0.1‑0.2M，DTT 0.01‑0.02M，甘油5‑25％(V/V)；第一裂解液缓冲液为10‑20mM的Tris‑HCl，含有0.05‑2mg/mL溶菌酶，9‑18g/L 葡萄糖 ，1‑2％(W/V)SDS，0.1‑0.3mg/mL蜗 牛 酶，1‑3mM 葡萄糖酸 锌；第二裂解液缓冲液为10‑20mM的Tris‑HCl，含有蛋白酶K0.1‑1mg/mL，CaCl25‑15mM；结合液缓冲液为50‑100mM的CA‑NaCA，含有2.5‑4M 硫酸 铵。本申请试剂盒通过粪便样品处理液、第一裂解液、第二裂解液和结合液的优化和改进，使其能对20‑200mg微量粪便样品进行核酸提取，且提取核酸具有较高浓度和纯度，能满足后续使用需求。 | ||
| 权利要求 | 1.一种粪便样品核酸提取的试剂盒，其特征在于：包括粪便样品处理液、第一裂解液、第二裂解液和结合液； |
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| 说明书全文 | 一种粪便样品核酸提取的试剂盒和方法技术领域[0001] 本申请涉及核酸提取技术领域，具体涉及一种粪便样品核酸提取的试剂盒和方法。 背景技术[0002] 核酸提取的原理主要包括细胞破碎、核酸溶解和净化三个步骤。首先，细胞膜和细胞壁需要被破坏，以释放细胞内的核酸。其次，核酸需要被有效地溶解，使其能够被提取出来。最后，通过净化步骤去除蛋白质、多糖和其他杂质，从而得到纯净的核酸样品。目前市面上的方法主要有酚氯仿法、硅胶柱法和磁珠法。 [0003] 酚氯仿法是最常用的核酸提取方法之一，其原理是利用酚和氯仿两种有机溶剂与水相不相溶的特性，将细胞裂解液中的蛋白质等杂质分离出去，从而得到纯净的核酸。缺点是会用到有毒的有机试剂，且操作繁琐复杂，这个方法在市面上已经逐步被淘汰。 [0004] 磁珠法是近年来发展起来的一种核酸提取新方法，通过在磁珠表面修饰亲核酸的功能基团，使得核酸能够与磁珠结合。利用磁场的作用，将核酸与磁珠分离出来，从而实现核酸的提取和纯化。这种方法操作简便，且适用于高通量提取。缺点是高度依赖全自动核酸提取仪，试剂盒手动提取随着处理样品管数增加所需时间也会大大增长。并且，由于本身方法的缺陷，磁珠法提取核酸纯度相对较低，处理粪便等复杂样品这个问题会更明显。 [0005] 硅胶柱法是利用硅胶膜对核酸的亲和力受PH和盐浓度变化所影响而进行提取和分离。通过将样品加入硅胶柱后，在高盐低PH值条件下核酸能够与硅胶膜结合，而其他杂质则被洗脱掉。而低盐高PH值条件洗脱核酸来达到纯化核酸的目的。这种方法提取的核酸纯度高，适用于对纯度要求较高的实验，试剂盒提取处理样品量更多，操作简便。且近年出现一些基于硅柱法全自动提取核酸的仪器，使得硅柱法也可以进行全自动核酸提取。 [0006] 但是，现有市面上的硅柱法试剂盒提取粪便样品，对样品量有较大的需求，面对稀便、粘液便等特殊状态样品会难以采集足量样品，并且，微量样品提取的核酸浓度较低，难以满足后续检测的使用需求。因此，如何提取微量粪便样品的核酸，使其浓度和纯度满足使用需求，仍然是粪便样品核酸提取技术领域的研究重点和难点。发明内容 [0007] 本申请的目的是提供一种改进的粪便样品核酸提取的试剂盒和方法。 [0008] 为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案： [0009] 本申请的一方面公开了一种粪便样品核酸提取的试剂盒，包括粪便样品处理液、第一裂解液、第二裂解液和结合液；粪便样品处理液的缓冲液为三羟甲基氨基甲烷‑柠檬酸缓冲液，其中三羟甲基氨基甲烷的浓度为10‑50mmol/L，粪便样品处理液中含有NaCl 0.1‑0.2mol/L，二硫苏糖醇0.01‑0.02mol/L，甘油1‑25％(V/V)；第一裂解液的缓冲液为10‑ 20mmol/L的Tris‑HCl缓冲液，其中含有0.05‑2mg/mL的溶菌酶，9‑18g/L的葡萄糖，1‑2％(W/V)的SDS，0.1‑0.3mg/mL的蜗牛酶，1‑3mmol/L的葡萄糖酸锌；第二裂解液的缓冲液为10‑ 20mmol/L的Tris‑HCl缓冲液，其中含有蛋白酶K 0.1‑1mg/mL，CaCl2 5‑15mmol/L；结合液的缓冲液为50‑100mmol/L的CA‑NaCA缓冲液，其中含有2.5‑4mol/L的硫酸铵。 [0010] 需要说明的是，本申请的粪便样品核酸提取试剂盒，通过对粪便样品处理液、第一裂解液、第二裂解液和结合液进行优化和改进，使得本申请的试剂盒能够适用于20‑200mg的微量粪便样品的核酸提取，并且提取的核酸能够满足后续检测使用需求。 [0011] 本申请的一种实现方式中，粪便样品处理液中甘油的含量为10‑25％(V/V)。 [0012] 本申请的一种实现方式中，第一裂解液中溶菌酶的浓度为0.05‑0.2mg/mL。 [0013] 本申请的一种实现方式中，结合液的pH值为3.5‑4.0。 [0014] 本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括无机盐漂洗液、第一漂洗液和第二漂洗液；无机盐漂洗液的缓冲液为50‑100mmol/L的CA‑NaCA缓冲液，其中含有5‑20％(W/V)的PEG6000，0.2‑0.3mol/L的MgCl2；第一漂洗液的缓冲液为10‑20mmol/L的Tris‑HCl缓冲液，其中含有70‑80％(V/V)的乙醇，0.2‑0.3mol/L的MgCl2；第二漂洗液的缓冲液为10‑20mmol/L的Tris‑HCl缓冲液，其中含有70‑80％(V/V)的乙醇，1‑2mmol/L的EDTA。 [0015] 需要说明的是，虽然本申请的关键在于粪便样品处理液、第一裂解液、第二裂解液和结合液进行优化和改进；但是，本申请进一步的研究发现，通过对无机盐漂洗液、第一漂洗液和第二漂洗液的优化和改进，能够进一步的提高提取的核酸的纯度，从而更好的满足后续使用需求。 [0016] 本申请的一种实现方式中，无机盐漂洗液中PEG6000的浓度为10％(W/V)。 [0017] 本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括核酸洗脱溶液，该核酸洗脱溶液为水或Buffer TE。 [0018] 需要说明的是，核酸洗脱溶液可以采用实验室常规使用的灭菌双蒸水(ddH2O)、灭菌去离子水或Buffer TE；因此，核酸洗脱溶液可以根据需求组合到本申请的试剂盒中。 [0019] 本申请的一种实现方式中，Buffer TE的缓冲液为10‑20mmol/L的Tris‑HCl缓冲液，其中含有1‑2mmol/L的EDTA。 [0020] 本申请的一种实现方式中，本申请的试剂盒还包括核酸吸附柱和与之配套的收集管。 [0021] 需要说明的是，核酸吸附柱和与之配套的收集管可以采用现有的硅胶柱和实验室常规使用的EP管，为了使用方便，可以将核酸吸附柱和与之配套的收集管增加到本申请的试剂盒中。 [0022] 本申请的另一面公开了一种采用本申请粪便样品核酸提取试剂盒的粪便样品核酸提取的方法。 [0023] 本申请的一种实现方式中，本申请的粪便样品核酸提取的方法，包括以下步骤： [0024] (1)称取粪便样品，向其中加入粪便样品处理液，涡旋混匀； [0025] (2)在大于或等于5000rpm的速度下离心，弃上清，留沉淀； [0026] (3)向步骤(2)的沉淀中加入第一裂解液，37℃水浴裂解至少5min； [0027] (4)步骤(3)水浴完成后，向其中加入第二裂解液，60℃水浴酶解至少5min； [0028] (5)步骤(4)水浴完成后，向其中加入结合液，混匀，10000‑14000rpm离心至少5min；在新的收集管中插入核酸吸附柱后，将离心后的澄清液体加入核酸吸附柱中； [0029] (6)对核酸吸附柱进行10000‑14000rpm离心至少2min，取出核酸吸附柱，弃去收集管内的废液，核酸吸附柱重新套入收集管内； [0030] (7)向核酸吸附柱中加入无机盐漂洗液，10000‑14000rpm离心至少2min，取出核酸吸附柱，弃去收集管内的废液，核酸吸附柱重新套入收集管内； [0031] (8)向核酸吸附柱中加入第一漂洗液，10000‑14000rpm离心至少2min，取出核酸吸附柱，弃去收集管内的废液，核酸吸附柱重新套入收集管内； [0032] (9)向核酸吸附柱中加入第二漂洗液，10000‑14000rpm离心至少2min，取出核酸吸附柱，弃去收集管内的废液，核酸吸附柱重新套入收集管内； [0033] (10)对核酸吸附柱进行10000‑14000rpm离心至少2min，取出核酸吸附柱，将其放入新的收集管内，晾干； [0034] (11)向核酸吸附柱中加入水或者Buffer TE，静置至少2min； [0035] (12)对核酸吸附柱进行10000‑14000rpm离心至少1min，弃核酸吸附柱，收集管中的溶液即粪便样品的核酸。 [0036] 本申请的一种实现方式中，步骤(1)中称取20‑200mg的粪便样品进行核酸提取。 [0037] 由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于： [0038] 本申请的粪便样品核酸提取试剂盒，通过对粪便样品处理液、第一裂解液、第二裂解液和结合液进行优化和改进，使得本申请试剂盒能够对20‑200mg的微量粪便样品进行核酸提取，并且提取的核酸具有较高的浓度和纯度，能满足后续检测使用需求。附图说明 [0039] 图1是本申请实施例中不同用量甘油的粪便样品处理液提取的核酸的ABI测定结果； [0040] 图2是本申请实施例中不同用量溶菌酶的第一裂解液提取的核酸的ABI测定结果； [0041] 图3是本申请实施例中不同pH值的50或116mM CA(柠檬酸)‑NaOH缓冲液的结合液提取的核酸的ABI测定结果； [0042] 图4和图5是本申请实施例中不同种类盐的结合液提取的核酸的ABI测定结果； [0043] 图6是本申请实施例中不同硫酸铵浓度的结合液提取的核酸的ABI测定结果； [0044] 图7是本申请实施例中不同用量PEG6000的无机盐漂洗液提取的核酸的ABI测定结果； [0045] 图8是本申请实施例中不同试剂盒提取的核酸的ABI测定结果； [0046] 图9是本申请实施例中不同试剂盒提取的核酸的琼脂糖凝胶电泳结果图。 具体实施方式[0047] 下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。 [0048] 在本申请中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。 [0049] 在以下实施例中，未详尽描述的各种过程和方法都是本领域中公知的常规方法。 [0050] 实施例 [0051] 一、试剂盒优化方法 [0052] 1.基础配方 [0053] 本例首先根据粪便样品的特征研发了一个基础的粪便样品核酸提取配方，并在此基础上进一步的优化和改进，具体如下： [0054] (1)粪便样品处理液(Buffer PT) [0055] 本例的Buffer PT pH8.0，由以下组分组成： [0056] Tris‑CA(三羟甲基氨基甲烷‑柠檬酸)：50mM tris pH8.0 [0057] NaCl：0.15M [0058] DTT(二硫苏糖醇)：0.02M [0059] 甘油10％(V/V) [0060] 配制工艺：先配置Tris‑CA缓冲液，向去离子水加入过量柠檬酸直至无法溶解配置成饱和柠檬酸溶液。称取50mmol的Tris(三羟甲基氨基甲烷)，加入800mL的去离子水进行溶解，加入柠檬酸溶液调节pH值至8.0后，再加去离子水定容至1L，即获得Tris‑CA缓冲液。再将溶解溶质配制成溶液，具体的，称取0.15mol的NaCl和0.02mol的DTT于容器中，加入适量Tris‑CA缓冲液溶解，加入100mL甘油溶于缓冲液中，最后再加入Tris‑CA缓冲液定容至1L，即制备获得本例的Buffer PT。 [0061] (2)第一裂解液(Buffer L1) [0062] 本例的Buffer L1缓冲液为pH 7.5 20mM的Tris‑HCl缓冲液，其中，含有溶菌酶0.2mg/mL，葡萄糖18g/L，SDS2％(W/V)，蜗牛酶0.2mg/mL，葡萄糖酸锌2mM。 [0063] 配制工艺：先配制Tris‑HCl缓冲液，称取20mmol的tris(三羟甲基氨基甲烷)，加入800mL的去离子水进行溶解，加入稀盐酸溶液调节pH值至8.0后，再加去离子水定容至1L，即获得Tris‑HCl缓冲液。再溶解溶质配制成溶液，具体的，依次称取各个固体成分于容器中，加入适量Tris‑HCl缓冲液溶解，溶解完全后，再加入Tris‑HCl缓冲液定容至目标体积，使溶菌酶的浓度为0.2mg/mL，葡萄糖的浓度为18g/L，SDS的浓度为2％(W/V)，蜗牛酶的浓度为 0.2mg/mL，葡萄糖酸锌的浓度为2mM，即制备获得本例的Buffer L1。 [0064] (3)第二裂解液(Buffer L2) [0065] 本例Buffer L2的缓冲液为pH＝7.5 20mM Tris‑HCl缓冲液，其中含有Proteinase k 1mg/mL，CaCl2 10mM。 [0066] 配制工艺：缓冲液配制方法同Buffer L1，取20mg/mL Proteinase K加入缓冲液稀释成1mg/mL，并加入终浓度10mM的CaCl2。Buffer L2低温保存备用。 [0067] (4)结合液(Buffer B) [0068] 本例Buffer B的缓冲液为pH＝3.5 50mM CA(柠檬酸)‑NaCA(柠檬酸钠)缓冲液，其中含有4M的硫酸铵。 [0069] 配制工艺：先配制CA‑NaCA缓冲液，称取50mmol所需的柠檬酸溶于去离子水，加入NaOH溶液调PH至3.5，再加入去离子水定容至1L。称取硫酸铵于容器中，加入缓冲液CA‑NaCA溶解完全后定容至目标体积，使硫酸铵的浓度为4M。 [0070] (5)无机盐漂洗液(Buffer Wp) [0071] 本例Buffer Wp的缓冲液为pH＝3.5 50mM CA(柠檬酸)‑NaCA(柠檬酸钠)缓冲液，其中含有PEG6000 10％(W/V)，0.2M MgCl2。 [0072] 配制工艺：缓冲液配制方法同Buffer B，称取PEG6000和MgCl2于容器中，加入CA‑NaCA缓冲液溶解后定容至目标体积，使PEG6000的浓度为10％(W/V)，MgCl2的浓度为0.2M。 [0073] (6)第一漂洗液(Buffer W1) [0074] 本例Buffer W1的缓冲液为10mM的Tris‑HCl缓冲液，其中含有乙醇75％(V/V)，0.2M MgCl2。 [0075] 配制工艺：用量筒量取无水乙醇和10mM Tris‑HCl缓冲液，按乙醇和Tris‑HCl的体积比为3:1混合，制成乙醇浓度为75％(V/V)的乙醇溶液，称取MgCl2于容器中，加入乙醇溶液溶解完全后定容至目标体积，使MgCl2的浓度为0.2M。 [0076] (7)第二漂洗液(Buffer W2) [0077] 本例Buffer W2的缓冲液为10mM的Tris‑HCl缓冲液，其中含有乙醇75％(V/V)，EDTA 1mM。 [0078] 配制工艺：用量筒量取无水乙醇和10mM Tris‑HCl缓冲液，按乙醇和Tris‑HCl的体积比为3:1混合，制成乙醇浓度为75％(V/V)的乙醇溶液，称取EDTA于容器中，加入乙醇溶剂溶解完全后定容至目标体积，使EDTA的浓度为1mM。 [0079] (8)Buffer TE [0080] 本例Buffer TE的缓冲液为10mM pH8.0的Tris‑HCl，其中含有EDTA 1mM。 [0081] 配制工艺：称取所需的EDTA于容器中，加入Tris‑HCl缓冲液溶解完全后定容至目标体积，使EDTA的浓度为1mM。 [0082] 2.硅柱法核酸提取操作流程 [0083] (1)称取20‑200mg人粪于1.5mL EP管中，加入100‑1000μL Buffer PT，涡旋混匀5min。 [0084] (2)5000rpm离心5min，尽可能弃去上清，留下沉淀。 [0085] (3)向EP管加入400μL的Buffer L1，37℃水浴裂解10min。 [0086] (4)从水浴锅取出EP管，向管内加入100μL的Buffer L2，水浴60℃酶解10min。 [0087] (5)从水浴锅取出EP管，向管内加入1000μL的Buffer B，上下颠倒10‑20次，12000rpm离心5min。收集管加入吸附柱后，将离心后的澄清液体加入柱中，尽量不要吸到上层和下层的沉淀。 [0088] (6)12000rpm离心2min，取出吸附柱，弃去收集管内的废液，吸附柱重新套入收集管内。 [0089] (7)加入600μL Buffer Wp于吸附柱内，12000rpm离心2min，取出吸附柱，弃去收集管内的废液，吸附柱重新套入收集管内。 [0090] (8)加入600μL Buffer W1于吸附柱内，12000rpm离心2min，取出吸附柱，弃去收集管内的废液，吸附柱重新套入收集管内。 [0091] (9)加入600μL Buffer W2于吸附柱内，12000rpm离心2min，取出吸附柱，弃去收集管内的废液，吸附柱重新套入收集管内。 [0092] (10)12000rpm离心2min，取出吸附柱放入新的EP管内，晾干5Min。 [0093] (11)向吸附柱内加入100μL Buffer TE，静置2min。 [0094] (12)12000rpm离心1min，弃去吸附柱，EP管中的溶液即粪便样品的核酸样品，‑20℃低温保存备用。 [0095] 3.粪便样品处理液优化试验 [0096] 在“1.基础配方”的基础上，测试甘油添加量对核酸提取的影响，具体的，本例分别配制了甘油添加量为0％(V/V)、1％(V/V)、10％(V/V)、25％(V/V)的Buffer PT，其余与“1.基础配方”相同。 [0097] 按照“2.硅柱法核酸提取操作流程”，本例称取200mg人粪进行核酸提取。 [0098] 采用Nanodrop测量提取的核酸的浓度，并计算各组核酸A260/280、A260/230。 [0099] 采用特异性引物Fae‑F、Fae‑R和特异性探针fae‑p对各组核酸进行qPCR检测，测定其FAE靶标的CT值；采用特异性引物Bado‑F、Bado‑R和特异性探针Bado‑p对各组核酸进行qPCR检测，测定其Bado靶标的CT值；采用特异性引物Cop‑F、Cop‑R和特异性探针Cop‑p对各组核酸进行qPCR检测，测定其Cop靶标的CT值；采用特异性引物Ecoli‑F、Ecoli‑R和特异性探针Ecoli‑p对各组核酸进行qPCR检测，测定其Ecoli靶标的CT值；以各靶标的检测结果表征提取核酸的质量。FAE靶标的特异性引物和探针为Seq ID No.1至3所示序列，Bado靶标的特异性引物和探针为Seq ID No.4至6所示序列，Cop靶标的特异性引物和探针为Seq ID No.7至9所示序列，Ecoli靶标的特异性引物和探针为Seq IDNo.10至12所示序列。 [0100] Fae‑F，Seq ID No.1：5'‑ACTAGGTGTTGGAGGATTGAC‑3' [0101] Fae‑R，Seq ID No.2：5'‑AGACTTGGTAAGGTTCTTCGC‑3' [0102] fae‑p，Seq ID No.3：5'‑CCCTTCAGTGCCGCAGTTAACACAATA‑3' [0103] Bado‑F，Seq ID No.4：5'‑TTTTGACTGGGAGCAAGC‑3' [0104] Bado‑R，Seq ID No.5：5'‑AAGCGATGGACTTTCACAC‑3' [0105] Bado‑p，Seq ID No.6：5'‑CACCGGCTAACTACGTGCCAGC‑3' [0106] Cop‑F，Seq ID No.7：5'‑TACCTGACTAAGAAGCACC‑3' [0107] Cop‑R，Seq ID No.8：5'‑ATAACGCTTGCACCATACG‑3' [0108] Cop‑p，Seq ID No.9：5'‑AATACGTGCCAGCAGCCGCGGT‑3' [0109] Ecoli‑F，Seq ID No.10：5'‑ACGATTGATTATGAGGTCGAG‑3' [0110] Ecoli‑R，Seq ID No.11：5'‑TTGTTCTGTGAGCACCTG‑3' [0111] Ecoli‑p，Seq ID No.12：5'‑CGAAACGCGCTTCACTACCGCA‑3' [0112] 本例PCR采用10×Superstart Premix plus‑UNG(Probe qPCR)(宝锐生物公司，产品型号M0071)，PCR反应体系为：50×taq酶0.4μL，10×缓冲液2μL，10×MgCl2 2μL，10μM上下游引物各0.4μL，10μM探针0.4μL，核酸模板2μL，补充灭菌去离子水至20μL。 [0114] 4.裂解液优化试验 [0115] 在“1.基础配方”的基础上，测试溶菌酶添加量对核酸提取的影响，具体的，本例分别配制了溶菌酶浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1、2mg/mL的第一裂解液，其余与“1.基础配方”相同。 [0116] 按照“2.硅柱法核酸提取操作流程”，本例称取200mg人粪进行核酸提取。 [0117] 采用Nanodrop测量提取的核酸的浓度，并计算各组核酸A260/280、A260/230。并采用“3.粪便样品处理液优化试验”相同的方法对提取的核酸进行FAE、Bado、Cop和Ecoli四个靶标的CT值测定。与此同时，还增加检测了human靶标β‑actin基因，采用特异性引物human‑F、human‑R和特异性探针human‑p对各组核酸进行qPCR检测，测定其human靶标的CT值；human靶标的特异性引物和探针为Seq ID No.13至15所示序列。 [0118] human‑F，Seq ID No.13：5'‑CCCAGCCATGTACGTTGCTA‑3' [0119] human‑R，Seq ID No.14：5'‑TCACCGGAGTCCATCACGAT‑3' [0120] human‑p，Seq ID No.15：5'‑ACGCCTCTGGCCGTACCACTGG‑3' [0121] human靶标的PCR反应体系和条件与“3.粪便样品处理液优化试验”相同。 [0122] 5.结合液的缓冲液优化试验 [0123] 在“1.基础配方”的基础上，本例分别测试了不同pH值，50或116mM CA(柠檬酸)‑NaOH缓冲液的结合液对核酸提取的影响。具体的，本例分别配制了pH6.2 50mM CA‑NaCA的Buffer B、pH5.2 50mM CA‑NaCA的Buffer B、pH4.750mM CA‑NaCA的Buffer B、pH4.0 50mM CA‑NaCA的Buffer B、pH3.5 50mM CA‑NaCA的Buffer B、pH1.7 50mM CA‑NaCA的Buffer B、pH6.8 116mM CA‑NaCA的Buffer B、pH5.0 116mM CA‑NaCA的Buffer B、pH4.7 116mM CA‑NaCA的Buffer B和pH4.2 116mM CA‑NaCA的Buffer B，其余与“1.基础配方”相同。 [0124] 按照“2.硅柱法核酸提取操作流程”，本例称取200mg人粪进行核酸提取。 [0125] 采用Nanodrop测量提取的核酸的浓度，并计算各组核酸A260/280、A260/230。并采用“3.粪便样品处理液优化试验”相同的方法对提取的核酸进行FAE、Bado、Cop和Ecoli四个靶标的CT值测定。 [0126] 6.结合液的盐种类筛选试验 [0127] 在“1.基础配方”的基础上，本例分别测试了不同盐种类的结合液对核酸提取的影响。具体的，分别采用3M KCL、6M盐酸胍、4M NaCl、4M MgCl2替换结合液中的4M的硫酸铵，制备获得不同盐的结合液，其余与“1.基础配方”相同。 [0128] 按照“2.硅柱法核酸提取操作流程”，本例称取200mg人粪进行核酸提取。 [0129] 采用Nanodrop测量提取的核酸的浓度，并计算各组核酸A260/280、A260/230。并采用“3.粪便样品处理液优化试验”相同的方法对提取的核酸进行FAE、Bado、Cop和Ecoli四个靶标的CT值测定。采用“4.裂解液优化试验”相同的方法对提取的核酸进行human靶标β‑actin基因的CT值测定。 [0130] 7.结合液的盐浓度优化试验 [0131] 在“1.基础配方”的基础上，本例分别测试了不同硫酸铵浓度的结合液对核酸提取的影响。具体的，分别制备了2.5、3、3.5、4、4.5、5M硫酸铵的结合液，其余与“1.基础配方”相同。 [0132] 按照“2.硅柱法核酸提取操作流程”，本例称取200mg人粪进行核酸提取。 [0133] 采用Nanodrop测量提取的核酸的浓度，并计算各组核酸A260/280、A260/230。并采用“3.粪便样品处理液优化试验”相同的方法对提取的核酸进行FAE、Bado、Cop和Ecoli四个靶标的CT值测定。 [0134] 8.无机盐漂洗液优化试验 [0135] 在“1.基础配方”的基础上，本例分别测试了不同PEG6000用量的无机盐漂洗液对核酸提取的影响。具体的，分别制备了PEG6000用量为5、10、15、20％(W/V)的无机盐漂洗液，其余与“1.基础配方”相同。 [0136] 按照“2.硅柱法核酸提取操作流程”，本例称取200mg人粪进行核酸提取。 [0137] 采用Nanodrop测量提取的核酸的浓度，并计算各组核酸A260/280、A260/230。并采用“3.粪便样品处理液优化试验”相同的方法对提取的核酸进行FAE靶标的CT值测定。 [0138] 9.优化方案的核酸提取性能对比试验 [0139] 根据以上优化的方案提取粪便核酸，并采用三个市售购买获得的粪便核酸提取试剂盒作为对照，分别标记为竞品1、竞品2和竞品3。对本例优化方案和三个竞品提取的核酸进行1％琼脂糖凝胶电泳，并采用“3.粪便样品处理液优化试验”相同的方法对提取的核酸进行FAE靶标的CT值测定。 [0140] 二、结果和分析 [0141] 1.粪便样品处理液优化试验结果 [0142] 添加不同用量甘油的粪便样品处理液提取的核酸，其浓度、A260/280、A260/230测试结果如表1所示，ABI测定结果如图1所示。 [0143] 表1不同甘油含量粪便样品处理液提取的核酸 [0144]甘油用量 DNA浓度 A260/280 A260/230 0％(V/V) 28.12 2.104666667 2.06 1％(V/V) 25.85 2.101666667 2.141666667 10％(V/V) 43.81 2.116666667 2.068 25％(V/V) 37.57 2.144333333 2.062333333 [0145] 表1和图1的结果显示，添加甘油对提升粪便样本核酸的浓度和纯度有帮助，甘油的用量可以为1‑25％(V/V)，优选为10‑25％(V/V)，本例最终确定的优选方案中甘油用量为10％(V/V)。 [0146] 至于粪便样品处理液中的其他组分，一般来说三羟甲基氨基甲烷的浓度为10‑50mmol/L，NaCl浓度为0.1‑0.2mol/L，二硫苏糖醇浓度为0.01‑0.02mol/L，都能够满足使用需求。 [0147] 2.裂解液优化试验结果 [0148] 添加不同用量溶菌酶的第一裂解液提取的核酸，其浓度、A260/280、A260/230测试结果如表2所示，ABI测定结果如图2所示。 [0149] 表2不同溶菌酶含量第一裂解液提取的核酸 [0150] 溶菌酶用量 DNA浓度 A260/280 A260/2300.05mg/mL 41.26933333 1.724666667 1.118 0.1mg/mL 42.95366667 1.692 1.071333333 0.25mg/mL 41.462 1.647666667 0.968 0.5mg/mL 40.69 1.644 0.889666667 1mg/mL 37.21666667 1.523666667 0.656333333 2mg/mL 32.23333333 1.414 0.483333333 [0151] 表2和图2的结果显示，随着溶菌酶浓度降低，核酸浓度纯度反而提高，过多的溶菌酶意味着过多的蛋白质杂质需要被去除，因此，溶菌酶浓度0.05‑2mg/mL都能够不同程度的提高核酸浓度和纯度，评估各个实验指标后优选采用溶菌酶的浓度为0.05‑0.2mg/mL，本例最终优化的方案中决定使用0.1mg/L的浓度。 [0152] 至于第一裂解液中的其他组分，一般来说Tris‑HCl缓冲液10‑20mmol/L，葡萄糖浓度9‑18g/L，SDS浓度1‑2％(W/V)，蜗牛酶浓度0.1‑0.3mg/mL，葡萄糖酸锌浓度1‑3mmol/L，都能够满足使用需求。第二裂解液中Tris‑HCl缓冲液10‑20mmol/L，蛋白酶K浓度0.1‑1mg/mL，CaCl2浓度5‑15mmol/L，都能够满足使用需求。 [0153] 3.结合液的缓冲液优化试验结果 [0154] 不同pH值的50或116mM CA(柠檬酸)‑NaOH缓冲液的结合液提取的核酸的检测结果如图3所示。 [0155] 图3的结果显示，提高缓冲液浓度不利于核酸提取，因此，优选采用50mM CA(柠檬酸)‑NaOH缓冲液，至于pH值优选为3.5‑4.0。 [0156] 4.结合液的盐种类筛选试验结果 [0157] 添加不同种类盐的结合液提取的核酸，其浓度、A260/280、A260/230测试结果如表3所示，ABI测定结果如图4和图5所示。 [0158] 表3不同种类盐结合液提取的核酸 [0159]盐种类和用量 DNA浓度 A260/280 A260/230 3M KCL 105.6483333 1.565333333 0.650666667 6M盐酸胍 205.547 1.901333333 1.195333333 4M NaCl 70.38966667 1.343333333 0.449666667 4M MgCl2 99.203 1.997 1.7785 [0160] 表3、图4和图5的结果显示，较纯的DNA，其OD260/280应在1.8‑2.0附近，OD260/230应在2.0‑2.3这个范围，MgCl2虽然提取浓度和靶标QPCR结果不出众，但加入结合液后离心沉淀分布情况的独特现象，有利于除杂质和色素，提出的核酸纯度高于其他组而选择该盐，后续实验硫酸铵能产生同样的现象进而很好地除杂，在这基础上靶标扩增CT值远低于MgCl2，因此，盐的使用更替为硫酸铵。 [0161] 5.结合液的盐浓度优化试验结果 [0162] 不同硫酸铵浓度的结合液提取的核酸的测试结果如图6所示。 [0163] 图6的结果显示，E.coli和B.ado靶标的CT值随着浓度增高而降低，因此，优选的结合液中硫酸铵的浓度为2.5‑4mol/L。 [0164] 6.无机盐漂洗液优化试验结果 [0165] 添加不同用量PEG6000的无机盐漂洗液提取的核酸，其浓度、A260/280、A260/230测试结果如表4所示，ABI测定结果如图7所示。 [0166] 表4不同PEG6000含量无机盐漂洗液提取的核酸 [0167]PEG6000用量 DNA浓度 A260/280 A260/230 5％(W/V) 34.39466667 2.023333333 2.241666667 10％(W/V) 39.38133333 1.937 2.122 15％(W/V) 48.86433333 2.009666667 2.087333333 20％(W/V) 46.271 2.003666667 1.978 [0168] 表4和图7的结果显示，PEG6000浓度下降会伴随核酸损失，但纯度数据OD260/230逐步增加，折中选择10％(W/V)的浓度。 [0169] 7.优化方案及其核酸提取性能对比试验结果 [0170] 本例最终确定的最优的试剂盒方案为： [0171] 粪便样品处理液(Buffer PT) [0172] Tris‑CA(三羟甲基氨基甲烷‑柠檬酸)：50mM tris pH8.0 [0173] NaCl：0.15M [0174] DTT(二硫苏糖醇)：0.02M [0175] 甘油10％(V/V) [0176] 第一裂解液(Buffer L1) [0177] Buffer L1缓冲液为pH 7.5 20mM的Tris‑HCl缓冲液，其中，含有溶菌酶0.1mg/mL，葡萄糖18g/L，SDS2％(W/V)，蜗牛酶0.2mg/mL，葡萄糖酸锌2mM。 [0178] 第二裂解液(Buffer L2) [0179] Buffer L2的缓冲液为pH＝7.5 20mM Tris‑HCl缓冲液，其中含有Proteinase k 1mg/mL，CaCl2 10mM。 [0180] 结合液(Buffer B) [0181] Buffer B的缓冲液为pH＝3.5 50mM CA(柠檬酸)‑NaCA(柠檬酸钠)缓冲液，其中含有4M的硫酸铵。 [0182] 无机盐漂洗液(Buffer Wp) [0183] Buffer Wp的缓冲液为pH＝3.5 50mM CA(柠檬酸)‑NaCA(柠檬酸钠)缓冲液，其中含有PEG6000 10％(W/V)，0.2M MgCl2。 [0184] 第一漂洗液(Buffer W1) [0185] Buffer W1的缓冲液为10mM的Tris‑HCl缓冲液，其中含有乙醇75％(V/V)，0.2M MgCl2。 [0186] 第二漂洗液(Buffer W2) [0187] Buffer W2的缓冲液为10mM的Tris‑HCl缓冲液，其中含有乙醇75％(V/V)，EDTA 1mM。 [0188] Buffer TE [0189] Buffer TE的缓冲液为10mM pH8.0的Tris‑HCl，其中含有EDTA 1mM。 [0190] 按照以上配方和三个市售试剂盒提取核酸，其浓度、A260/280、A260/230测试结果如表5所示，ABI测定结果如图8所示，对核酸进行琼脂糖凝胶电泳的结果如图9所示。 [0191] 表5不同试剂盒提取的核酸 [0192]试剂盒 DNA浓度 A260/280 A260/230 本例优选方案 147.56 1.97 2.15 竞品1 40.66 1.83 1.02 竞品2 154.24 1.88 1.63 竞品3 38.09 2.05 1.07 [0193] 表5、图8和图9的结果显示，本例优选方案提取的核酸浓度和纯度都较高，从图9可以看出，本例优选方案提取的核酸完整性也更好，有出现明显的DNA条带。竞品1和竞品3核酸浓度较低，因此没有明显的条带，竞品2的浓度较高，但是核酸完整性较差，电泳呈弥散带状。 [0194] 以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。 |
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