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一种能够提取细胞基因组超长片段的 试剂盒及其使用方法

热词	dna 基因组基因吸附 tris 细胞超长片段混匀试剂盒
专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202410347527.5	申请日	2024-03-26
公开(公告)号	CN118222563A	公开(公告)日	2024-06-21
申请人	四川大学华西医院;	申请人类型	企业
发明人	谢丹; 李洋;	第一发明人	谢丹
权利人	四川大学华西医院	权利人类型	企业
当前权利人	四川大学华西医院	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：四川省	城市	当前专利权人所在城市：四川省成都市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：四川省成都市武侯区国学巷37号	邮编	当前专利权人邮编：610000
主IPC国际分类	C12N15/10	所有IPC国际分类	C12N15/10
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	6	专利文献类型	A
专利代理机构	北京慧思勤行专利代理事务所	专利代理人	肖月华;
摘要	本发明提供了一种能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒及其使用方法，以玻璃珠作为DNA 吸附珠，针对性调整裂解液和缓冲溶液的成分和浓度，在高pH和高盐缓冲液中，玻璃表面的二氧化硅可带有负电荷，而DNA分子的磷酸基团也带有负电荷。高盐环境下的阳离子就会以盐桥的方式将二者联接在一起，使得DNA吸附于珠子表面；当缓冲液中的盐浓度较低时，离子强度减小，离子强度的减小减弱了DNA与珠子表面之间的静电吸引力。因此，在低盐浓度下，吸附在珠子表面的DNA相对较容易被洗脱。采用此试剂盒提取细胞基因组，能够保证基因组DNA的完整性和高纯度性，减少机械损伤。
权利要求	1.一种能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：核准备溶液：物质A：10±2mM的Tris‑HCl，10±2mM的NaCl，3±1mM的MgCl2，1±0.5mM的EDTA，0.1‑2％NP‑40，水；物质B：核糖核酸酶A；物质A和物质B的重量比为330：10～12；核裂解液：物质C：10±2mM的Tris‑HCl，10±2mM的NaCl，1±0.5mM的EDTA，0.5‑2％SDS，水；物质D：蛋白酶K；物质C和物质D的体积比为330：20～24；降水增强剂：0.2‑1M的NaCl； DNA分子沉淀剂：质量浓度为40‑60％的异丙醇；洗涤缓冲液：质量浓度为60％～70％的乙醇；洗脱缓冲液：10±2mM的Tris‑HCl，1±0.5mM的EDTA，水。 2.根据权利要求1所述的能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒，其特征在于，还包括DNA吸附珠，所述DAN吸附珠的主要成分是二氧化硅。 3.根据权利要求1所述的能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒，其特征在于，试剂盒中，Tris‑HCl的pH为7.5～8。 4.根据权利要求1‑3任意一项所述的能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：核准备溶液：物质A：10mM的Tris‑HCl，10mM的NaCl，3mM的MgCl2，1mM的EDTA，0.1‑2％NP‑ 40，水；物质B：核糖核酸酶A；物质A和物质B的重量比为330：11；核裂解液：物质C：10mM的Tris‑HCl，10mM的NaCl，1mM的EDTA，0.5‑2％SDS，水；物质D：蛋白酶K；物质C和物质D的体积比为330：22；降水增强剂：0.2‑1M的NaCl； DNA分子沉淀剂：质量浓度为40‑60％的异丙醇；洗涤缓冲液：质量浓度为60％～70％的乙醇；洗脱缓冲液：10mM的Tris‑HCl，1mM的EDTA，水。 5.一种利用如权利要求1‑4任意一项所述的试剂盒提取细胞基因组超长片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、向菌液中加入核准备溶液，用移液枪上下吹打混匀，之后室温下进行静置孵育；步骤2、继续向菌液中加入核裂解液，混匀，50‑60℃下进行孵育；步骤3、加入降水增强剂，翻转混匀；步骤4、加入DNA吸附珠，然后加入DNA分子沉淀剂异丙醇，在垂直旋转混均仪器上进行孵育处理，之后除去多余的液体；步骤5、加入洗涤缓冲液，翻转混匀多次，除去多余的液体；步骤6、准备Monarch Collection Tube II，上面放置DNA吸附珠收集管，将步骤5得到的DNA吸附珠倒入收集管中，盖上盖子，离心1‑2s；步骤7、将DNA吸附珠倒入新的收集管内，加入洗脱缓冲液，50‑60℃孵育处理；步骤8、收集孵育后的含DNA的缓冲溶液，离心，混匀，加入洗脱缓冲溶液，35‑40℃条件下进行孵育，混匀，得到含有DNA的清夜。 6.根据权利要求5所述的提取细胞基因组超长片段的方法，其特征在于，所述步骤1中，菌液采用以下方法制备得到的：培养细胞，选择合适的细胞数量，将细胞连同培养液一起转移到EP管中，离心，去除培养基，得到菌液。
说明书全文	一种能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒及其使用方法技术领域 [0001] 本发明涉及了细胞基因组的提取技术领域，具体涉及了一种能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒及其使用方法。背景技术 [0002] 基因组超长片段是基因组中相对较长的DNA片段，其长度通常远远超过传统测序技术能够覆盖的范围，这些片段的长度可以达到几千至数十万碱基对，甚至更长。相对于传统的短读长测序技术，如纳米孔测序，能够生成数百至数千碱基对的片段，超长片段提供了更为全面、详细的基因组信息。纳米孔测序技术在基因组超长片段的应用中展现了巨大的潜力，但也面临一系列技术挑战。纳米孔测序平台对基因组DNA的要求较为苛刻，需要确保样品中的基因组DNA具有足够的完整性和高质量。因此，基因组超长片段的提取和保存过程中避免对基因组DNA造成不必要的损伤是十分重要的工序。 [0003] 基因组DNA提取是生物学研究中应用非常广泛的分子生物学实验操作，它为基因测序、PCR扩增、基因编辑和分子标记等实验提供关键的原始材料，支持生物多样性研究、进化分析和疾病诊断。现有的基因组DNA提取技术基本都会使用酚氯仿进行抽提，然后配合高速离心，这对基因组DNA的完整性必然会造成一定的破坏，无法保证基因组DNA足够的完整性，提取产物质量较低。 [0004] 因此，研究出一种无需使用酚氯仿，且能保证基因组DNA足够完整性的提取细胞基因组超长片段的方法具有十分重要的意义。发明内容 [0005] 本发明的目的在于：针对现有技术细胞基因组DNA超长片段的提取过程存在无法保证基因组DNA足够的完整性，提取产物质量较低的问题，提供一种提取细胞基因组超长片段的试剂盒及其使用方法，以玻璃珠作为DNA吸附珠，针对性调整裂解液和缓冲溶液的成分和浓度，在高pH和高盐缓冲液中，玻璃表面的二氧化硅可带有负电荷，而DNA分子的磷酸基团也带有负电荷。高盐环境下的阳离子就会以盐桥的方式将二者联接在一起，使得DNA吸附于珠子表面；当缓冲液中的盐浓度较低时，离子强度减小，离子强度的减小减弱了DNA与珠子表面之间的静电吸引力。因此，在低盐浓度下，吸附在珠子表面的DNA相对较容易被洗脱。采用此试剂盒提取细胞基因组，能够保证基因组DNA的完整性和高纯度性，减少机械损伤。 [0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为： [0007] 一种能够提取细胞基因组超长片段的试剂盒，包括以下组分： [0008] 核准备溶液：物质A：10±2mM的Tris‑HCl，10±2mM的NaCl，3±1mM的MgCl2，1±0.5mM的EDTA，0.1‑2％NP‑40，水；物质B：核糖核酸酶A；物质A和物质B的重量比为330：10～ 12； [0009] 核裂解液：物质C：10±2mM的Tris‑HCl，10±2mM的NaCl，1±0.5mM的EDTA，0.5‑2％SDS，水；物质D：蛋白酶K；物质C和物质D的体积比为330：20～24； [0010] 降水增强剂：0.2‑1M的NaCl； [0011] DNA分子沉淀剂：质量浓度为40‑60％的异丙醇； [0012] 洗涤缓冲液：质量浓度为60％～70％的乙醇； [0013] 洗脱缓冲液：10±2mM的Tris‑HCl，1±0.5mM的EDTA，水。 [0014] 本发明提供的细胞基因组的提取试剂盒，以玻璃珠作为DNA吸附珠，针对性调整裂解液和缓冲溶液的成分和浓度，在高pH和高盐缓冲液中，玻璃表面的二氧化硅可带有负电荷，而DNA分子的磷酸基团也带有负电荷。高盐环境下的阳离子就会以盐桥的方式将二者联接在一起，使得DNA吸附于珠子表面；当缓冲液中的盐浓度较低时，离子强度减小，离子强度的减小减弱了DNA与珠子表面之间的静电吸引力。因此，在低盐浓度下，吸附在珠子表面的DNA相对较容易被洗脱。采用此试剂盒提取细胞基因组，能够保证基因组DNA的完整性和高纯度性，减少机械损伤。 [0015] 进一步的，还包括DNA吸附珠，所述DAN吸附珠的主要成分是二氧化硅。 [0016] 进一步的，试剂盒中，Tris‑HCl的pH为7.5～8。 [0017] 进一步的，包括以下组分： [0018] 核准备溶液：物质A：10mM的Tris‑HCl，10mM的NaCl，3mM的MgCl2，1mM的EDTA，0.1‑2％NP‑40，水；物质B：核糖核酸酶A；物质A和物质B的重量比为330：11； [0019] 核裂解液：物质C：10mM的Tris‑HCl，10mM的NaCl，1mM的EDTA，0.5‑2％SDS，水；物质D：蛋白酶K；物质C和物质D的体积比为330：22； [0020] 降水增强剂：0.2‑1M的NaCl； [0021] DNA分子沉淀剂：质量浓度为40‑60％的异丙醇； [0022] 洗涤缓冲液：质量浓度为60％～70％的乙醇； [0023] 洗脱缓冲液：10mM的Tris‑HCl，1mM的EDTA，水。 [0024] 本发明的另一目的是为了提供上述试剂盒的使用方法。 [0025] 一种利用上述的试剂盒提取细胞基因组超长片段的方法，包括以下步骤： [0026] 步骤1、向菌液中加入核准备溶液，用移液枪上下吹打混匀，之后室温下进行静置孵育； [0027] 步骤2、继续向菌液中加入核裂解液，混匀，50‑60℃下进行孵育； [0028] 步骤3、加入降水增强剂，翻转混匀； [0029] 步骤4、加入DNA吸附珠，然后加入DNA分子沉淀剂异丙醇，在垂直旋转混均仪器上进行孵育处理，之后除去多余的液体； [0030] 步骤5、加入洗涤缓冲液，翻转混匀多次，除去多余的液体； [0031] 步骤6、准备Monarch Collection Tube II，上面放置DNA吸附珠收集管，将步骤5得到的DNA吸附珠倒入收集管中，盖上盖子，离心1‑2s； [0032] 步骤7、将DNA吸附珠倒入新的收集管内，加入洗脱缓冲液，50‑60℃孵育处理； [0033] 步骤8、收集孵育后的含DNA的缓冲溶液，离心，混匀，加入洗脱缓冲溶液，35‑40℃条件下进行孵育，混匀，得到含有DNA的清夜。 [0034] 进一步的，所述步骤1中，菌液采用以下方法制备得到的：培养细胞，选择合适的细胞数量，将细胞连同培养液一起转移到EP管中，离心，去除培养基，得到菌液。 [0035] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是： [0036] 本发明提供的细胞基因组的提取试剂盒，以玻璃珠作为DNA吸附珠，针对性调整裂解液和缓冲溶液的成分和浓度，在高pH和高盐缓冲液中，玻璃表面的二氧化硅可带有负电荷，而DNA分子的磷酸基团也带有负电荷。高盐环境下的阳离子就会以盐桥的方式将二者联接在一起，使得DNA吸附于珠子表面；当缓冲液中的盐浓度较低时，离子强度减小，离子强度的减小减弱了DNA与珠子表面之间的静电吸引力。因此，在低盐浓度下，吸附在珠子表面的DNA相对较容易被洗脱。采用此试剂盒提取细胞基因组，能够保证基因组DNA的完整性和高纯度性，减少机械损伤。附图说明 [0037] 图1是不同转速条件下离心，基因DAN片段的损伤情况图。具体实施方式 [0038] 下面结合附图，对本发明作详细的说明。 [0039] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0040] 实施例1 [0041] 配制母液 [0042] 母液包含物质情况如表1所示。 [0043] 表1 [0044]试剂摩尔质量配制浓度配制体积称取质量 Tris‑HCl(pH7.5) 121.14g/mol 100mM 100mL 1.2110g Tris‑HCl(pH8) 121.14g/mol 100mM 100mL 1.2110g NaCl 58.5g/mol 500mM 50mL 1.4625g MgCl2 95.2110g/mol 30mM 50mL 0.1428g EDTA 292.24g/mol 10mM 50mL 0.1461g SDS 288.379g/mol 10％ 50mL 0.5g [0045] 若要配制1L pH为8.0的1mol/L Tris‑HCI母液(M＝121g/mol)，首先加入121g Tris到1L烧杯中,加入600mL超纯水溶解后，用浓盐酸调节pH至8.0左右，然后加水定容至1L。 [0046] 1％的SDS即将1g SDS(十二烷基硫酸钠)溶解在100ml水中(离子水) [0047] 配制工作液(以1mL体积为例) [0048] NUCLEI PREP BUFFER，具体如表2所示。 [0049] 表2 [0050]试剂配制浓度工作浓度吸取体积 Tris‑HCl(pH7.5) 100mM 10mM 100μL NaCl 500mM 10mM 20μL MgCl2 30mM 3mM 100μL EDTA 10mM 1mM 100μL NP‑40 0.5％ 50μL ddH2O 550μL [0051] NUCLEI LYSIS BUFFER，如表3所示。 [0052] 表3 [0053]试剂配制浓度工作浓度吸取体积 Tris‑HCl(pH8) 100mM 10mM 100μL NaCl 500mM 10mM 200μL EDTA 10mM 1mM 100μL SDS 10％ 1％ 100μL ddH2O 500μL [0054] PRECIPITATION ENHANCER：NaCL:0.5M。 [0055] WASH BUFFER：70％乙醇。 [0056] ELUTION BUFFER，如表4所示。 [0057] 表4 [0058] 试剂配制浓度工作浓度吸取体积Tris‑HCl(pH8) 100mM 10mM 100μL EDTA 10mM 1mM 100μL ddH2O 800μL [0059] DNA吸附珠 [0060] 实验用玻璃珠，用自来水冲洗干净后，用75％乙醇清洗晾干即可使用。 [0061] 使用方法 [0062] Part 1Cell Lysis [0063] 1)培养细胞，选择合适的细胞数量。将细胞连同培养液一起转移到2mL EP管中，800g，离心3min。离心结束后去除培养基。 [0064] for cells: [0065] 标准量：5X 105to 1X 107。 [0066] 少量：1X 105to≤5X 105。 [0067] 2)制备Nuclei Prep solution andNuclei Lysis Solutions。 [0068] A：Nuclei Prep solution如表5所示。 [0069] 表5 [0070] [0071] B：Nuclei Lysis Solutions，如表6所示。 [0072] 表6 [0073] [0074] [0075] 向每个2mL EP管中加入150μL(少量：50μL)Nuclei Prep solution，用移液枪上下吹打混匀10次，小心不要产生气泡。随后室温下孵育2min。 [0076] 继续向离心管中加入150μL(少量：50μL)Nuclei Lysis Solutions，盖上EP管盖子，手动翻转混匀10次，避免产生气泡，不要使用移液枪。 [0077] 使用金属浴在56℃孵育10min，期间手动翻转混匀3‑4次。此步骤完成后，样品可以放在4℃冰箱保存过夜。 [0078] 10min孵育完成后，加入75μL(low input：25μL)Precipitation Enhancer，翻转混匀8‑10次。 [0079] Part 2HMW gDNABinding and Elution [0080] 使用干净的镊子向每个样品加入两颗DNA吸附珠。 [0081] 加入275μL(少量：100μL)异丙醇，盖上盖子，在垂直旋转混匀仪器上，10rpm孵育4min。如果细胞数量＞5x10^6，则孵育时间延长至8min。 [0082] 孵育完成后可见一层薄膜吸附在DNA吸附珠上，倾斜离心管，用移液枪将DNA吸附珠和液体隔开，用移液枪吸除多余液体。避免移液枪吸到基因组DNA。 [0083] 加入500μL gDNA wash buffer，盖上EP管盖子，翻转混匀2‑3次。如第(3)步描述，去除gDNA wash buffer。 [0084] 重复步骤3‑4一次。 [0085] 准备Monarch Collection Tube II，上面放置DNA吸附珠收集管，做好标记。将第(5)步的DNA吸附珠倒入收集管中，盖上EP管盖子。 [0086] 用桌面小型离心机离心1s。 [0087] 取下收集管，将DNA吸附珠倒入一个新的EP管中。如果DNA与DNA吸附珠结合不牢固，可以将收集管与1.5mL EP管结合，用Elution buffer溶解沾在收集管上的DNA。 [0088] 立即加入100μL(如果细胞数量＞2x10^6，加入200μL)Elution buffer II，56℃孵育5min，期间手动翻转3‑4次。 [0089] 孵育完成后，准备收集套管，套在1.5mL EP管上，倒入(9)步孵育好的基因组DNA，DNA溶解在Elution buffer中。 [0090] 离心完成后，去除收集管，用移液枪上下混匀5‑10次。此时的溶液是比较粘稠的，为了使DNA充分溶解确保所有gDNA都溶解，在标准组最后加入了共500μL的elution buffer，在少量组最后加入了共300μL的elution buffer。37℃孵育30min‑2h，用移液枪上下混匀5‑10次，最后肉眼看不见残留。样品存放在4℃。为了使HMW DNA溶解程度更大，37℃孵育2h，用移液枪上下混匀5‑10次，重复2‑3次。DNA溶液在4℃可以保存几个星期，‑20℃可以保存较长时间。 [0091] 我们的试剂盒提取的基因组DNA结果如图1所示，具体的，泳道1‑5为使用自己的试剂盒进行的不同批次基因组DNA提取结果，泳道6，7为传统方法的提取结果，Marker：4.9‑120kb经过多批次实验验证，可以看到，长片段保存较为完整，甚至还能得到片段高度完整且一致的提取结果，如泳道1，2。 [0092] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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