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一种电转缓冲液、电转化方法及其应用

热词	转化电击质粒细胞菌体缓冲 endolysin holin 培养 em4
专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202410042619.2	申请日	2024-01-10
公开(公告)号	CN117867001A	公开(公告)日	2024-04-12
申请人	北京大学深圳研究院;	申请人类型	科研院所
发明人	黄艺; 白歆奕; 张广豹; 张梦君;	第一发明人	黄艺
权利人	北京大学深圳研究院	权利人类型	科研院所
当前权利人	北京大学深圳研究院	当前权利人类型	科研院所
省份	当前专利权人所在省份：广东省	城市	当前专利权人所在城市：广东省深圳市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：广东省深圳市高新技术产业园区南区深港产学研基地大楼东座五楼	邮编	当前专利权人邮编：518000
主IPC国际分类	C12N15/74	所有IPC国际分类	C12N15/74 ; C12N1/21 ; C12R1/01
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	深圳鼎合诚知识产权代理有限公司	专利代理人	孙婧; 彭家恩;
摘要	本发明公开了一种电转缓冲液、电转化方法及其应用。具体的，本发明提供的电转缓冲液包括可溶性糖和pH值大于等于4且小于等于6的无机盐。通过在普里斯特氏菌电转化过程中添加本发明提供的电转缓冲液，可最大限度降低细胞死亡率，同时确保高效的核酸递送，使转化效率增长22倍。本发明方法适用于目的质粒的快速转化，操作方便快捷，解决了现有技术中巨大普里斯特氏菌转化困难的问题，为巨大普里斯特氏菌的菌种改造提供技术支持。同时，本发明所获得的菌体能够应用于噬菌体裂解酶等外源基因诱导表达等研究，拓展巨大普里斯特氏菌的生物学应用。
权利要求	1.一种电转缓冲液，其特征在于，所述电转缓冲液包括：可溶性糖和pH值大于等于4且小于等于6的无机盐。 2.根据权利要求1所述的电转缓冲液，其特征在于，所述可溶性糖包括单糖和双糖中的至少一种；优选的，所述可溶性糖为蔗糖；优选的，所述可溶性糖的浓度为0.05M至1.25M。 3.根据权利要求1所述的电转缓冲液，其特征在于，所述无机盐为磷酸的酸式盐；优选的，所述磷酸的酸式盐为磷酸二氢钠；优选的，所述无机盐的浓度为0.05mM至2.45mM。 4.根据权利要求1所述的电转缓冲液，其特征在于，所述电转缓冲液还包括甘油。 5.一种电转化方法，其特征在于，所述电转化方法中采用如权利要求1‑4中任一项所述的电转缓冲液。 6.如权利要求1‑4所述的电转缓冲液或如权利要求5所述的电转化方法在工程菌制备中的应用。 7.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述工程菌为普里斯特氏菌；优选的，所述普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌；优选的，所述巨大普里斯特氏菌为保藏编号为CCTCC M 2022789的巨大普里斯特氏菌MIBE00004。 8.一种普里斯特氏菌电转化方法，包括：取普里斯特氏菌感受态细胞，加入质粒DNA，冰浴后加入如权利要求1‑4中任一项所述的电转化缓冲液，冰浴后转入预冷的电击杯中进行电击。 9.如权利要求8所述的电转化方法，其特征在于，所述感受态细胞的制备包括以下步骤：a、将普里斯特氏菌在固体培养基平板上划线培养；b、挑取单克隆接种于液体培养基，置于37℃摇床过夜培养；c、转接过夜培养物至液体培养基，置于37℃摇床培养；d、分装培养物至无菌离心管，冰浴后4℃离心收集菌体；e、将d步骤后收集的菌体用无菌水进行重悬，再冰浴离心收集菌体，此步骤重复若干次；f、将e步骤后收集的菌体用甘油溶液进行重悬，冰浴后离心收集菌体，此步骤重复若干次；g、将f步骤后收集的菌体用甘油溶液进行重悬，分装保存，得到普里斯特氏菌感受态细胞；任选的，所述电击后，迅速于电击杯中加入液体培养基，充分混匀后转移至无菌离心管，置于37℃摇床孵育；将孵育后的转化细胞培养液涂布于含载体抗性的抗生素筛选平板上，37℃倒置培养；优选的，所述普里斯特氏菌为巨大普里斯特氏菌；优选的，所述巨大普里斯特氏菌为保藏编号为CCTCC M 2022789的巨大普里斯特氏菌MIBE00004。 10.一种通过如权利要求5或8所述的电转化方法制备得到的工程菌，所述工程菌为包含有噬菌体裂解系统基因的巨大普里斯特氏菌。
说明书全文	一种电转缓冲液、电转化方法及其应用技术领域 [0001] 本发明属基因工程技术领域，涉及一种电转缓冲液、电转化方法及其应用。背景技术 [0002] 2020年，通过系统发育学和比较基因组分析对17个不同的芽孢杆菌属进行进一步的划分，普里斯特氏菌(Priestia)属成为了芽孢杆菌科新属。在最新的分类表中普里斯特氏菌属下划分有10个子类群，其中巨大普里斯特氏菌(Priestia megaterium)便是其中之一。巨大普里斯特氏菌，是一种好氧革兰氏阳性菌，具有对环境友好、对粮食作物安全、对人畜无害等优点，广泛应用于解磷固氮、生物防治、水体净化等领域，是极具应用价值的微生物资源。巨大普里斯特氏菌生长迅速、生物合成及代谢途径丰富，可作为细胞工厂进行生物发酵，表现出良好的生产潜力。 [0003] 用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的细菌类细胞株系一般称为“工程菌”(基因工程菌)。通过这种改造，得到的“工程菌”在实际使用领域具有更大应用价值。但这种改造根据不同的改造菌种(受体细菌，受体菌)而呈现出不同的难度。细菌转化是构建“工程菌”的重要方式。受体细菌通过直接吸收来自供体细菌或人工重组的含有特定基因的DNA片段，从而获得了相应遗传性状，这种现象称为细菌转化。常用的转化细菌的方法包括化学转化、电转化、热激转化等。其中，电转化则是利用电场作用，使DNA分子穿过细胞膜进入细胞内。这一技术能够大大提高细胞对外源DNA的吸收效率，是常用的细胞转染方法之一。在实际操作中，首先将目标细胞与外源DNA置于缓冲液中，然后施加脉冲电场，使细胞膜暂时变得通透，从而促进DNA进入细胞。 [0004] 目前，现有技术中普里斯特氏菌的遗传转化比较困难，极大地限制了普里斯特氏菌的生物学应用。因此，开发新方法来提升普里斯特氏菌的质粒转化效率，对于推进普里斯特氏菌的工程改造进程具有重要的意义。发明内容 [0005] 针对上述问题，本发明在对普里斯特氏菌及其电转化方法的深入研究和探索中，得到了一种全新的电转缓冲液，以及基于该电转缓冲液的电转化方法及其应用。 [0006] 第一方面，本发明提供了一种电转缓冲液，该电转缓冲液的主要成分包括：可溶性糖和pH值大于等于4且小于等于6的无机盐。 [0007] 进一步的，该电转缓冲液还包括甘油。 [0008] 第二方面，本发明提供了一种电转化方法，该电转化方法中采用第一方面的电转缓冲液。 [0009] 第三方面，本发明提供了第一方面的电转缓冲液和第二方面的电转化方法在工程菌制备中的应用。 [0010] 在本发明的一种具体实施方式中，上述工程菌为普里斯特氏菌。 [0011] 第四方面，本发明提供了一种普里斯特氏菌电转化方法，包括：取普里斯特氏菌感受态细胞，加入质粒DNA，冰浴后加入第一方面提供的电转化缓冲液，冰浴后转入预冷的电击杯中进行电击。 [0012] 进一步的，在本发明的一种具体实施方式中，上述普里斯特氏菌感受态细胞的制备包括以下步骤：a、将普里斯特氏菌在固体培养基平板上划线培养；b、挑取单克隆接种于液体培养基，置于37℃摇床过夜培养；c、转接过夜培养物至液体培养基，置于37℃摇床培养；d、分装培养物至无菌离心管，冰浴后4℃离心收集菌体；e、将d步骤后收集的菌体用无菌水进行重悬，再冰浴离心收集菌体，此步骤重复若干次；f、将e步骤后收集的菌体用甘油溶液进行重悬，冰浴后离心收集菌体，此步骤重复若干次；g、将f步骤后收集的菌体用甘油溶液进行重悬，分装保存，得到普里斯特氏菌感受态细胞。 [0013] 在本发明的一种具体实施方式中，上述普里斯特氏菌电转化方法中，在电击后，迅速于电击杯中加入液体培养基，充分混匀后转移至无菌离心管，置于37℃摇床孵育；将孵育后的转化细胞培养液涂布于含载体抗性的抗生素筛选平板上，37℃倒置培养。 [0014] 第五方面，本发明提供了一种通过上述方法制备得到的工程菌，该工程菌为包含有噬菌体裂解系统基因的巨大普里斯特氏菌。 [0015] 本发明的有益效果在于：本发明提供的电转化缓冲液不同于现有技术中常见的电转缓冲液，该缓冲液在电击时能最大限度降低细胞死亡率，同时确保高效的核酸递送，尤其是在普里斯特氏菌的电转化中使转化效率增长22倍，解决了现有技术中普里斯特氏菌转化困难的问题。 [0016] 本发明提供的电转缓冲液、电转化方法，为菌种改造提供了全新的技术支持，将其应用于工程菌领域所获得的菌体能够应用于例如噬菌体裂解酶等外源基因诱导表达等研究，大大拓展普里斯特氏菌的生物学应用。附图说明 [0017] 图1为实施例1中不同电转化缓冲液种类的对比实验：电转化缓冲液选用EM0至EM4溶液，其他条件为：200ng质粒，OD600为0.8，电击强度为9kV/cm； [0018] 图2为实施例1中不同质粒浓度的影响，质粒浓度为50ng至800ng，其它条件为：OD600为0.8，电击强度为9kV/cm，电转化缓冲液选用EM4溶液； [0019] 图3为实施例1中不同细胞浓度的影响，选用处于不同浓度的细胞制备感受态，细胞浓度为OD600为0.50至1.10，其它条件为：200ng质粒，电击强度为9kV/cm，电转化缓冲液选用EM4溶液； [0020] 图4为实施例1中不同电击强度的影响，电击强度为7kV/cm至15kV/cm，其它条件为：200ng质粒，OD600为0.8，电转化缓冲液选用EM4溶液； [0021] 图5为实施例2中重组质粒pWH1520‑holin‑endolysin的质粒图谱； [0022] 图6为实施例2中电转化后获得的巨大普里斯特氏菌MIBE00004克隆子的噬菌体裂解酶基因表达效果表征。具体实施方式 [0023] 现有技术中，电转化感受态细胞在工程菌制备中是一种非常重要且常见的方法。其基本的原理是利用瞬时的电场作用使细胞膜通透性增加，从而使DNA能够进入细胞内部。这一技术能够大大提高细胞对外源DNA的吸收效率。在实际操作中，首先将目标细胞与外源DNA置于缓冲液中，然后施加脉冲电场，使细胞膜暂时变得通透，从而促进DNA进入细胞。本发明在研究中发现，普里斯特氏菌的遗传转化非常困难，以电转化方法为例，不论如何调整电转化的具体实验条件，使用常规的电转缓冲液，例如SMG缓冲液、SG缓冲液、MG缓冲液、Gly缓冲液等，其转化效率都很差，无法满足应用需求。 [0024] 基于上述问题，本发明在研究过程中开发出了一种新的电转缓冲液，大大提高了普里斯特氏菌的转化效率。具体的，本发明提供的电转缓冲液的成分除常规的无菌水(或去离子水)以外，还包括可溶性糖和无机盐，该无机盐的pH值的范围为4～6。 [0025] 适用于本发明的可溶性糖可以是单糖，也可以是双糖，或两者的混合。在本发明的一种具体实施方式中，上述可溶性糖采用了蔗糖。该可溶性糖在电转缓冲液中的浓度(摩尔浓度)大致为0.05M至1.25M范围内。 [0026] 适用于本发明的无机盐优选磷酸的酸式盐，例如磷酸二氢钠。该无机盐在电转缓冲液中的浓度(摩尔浓度)大致为0.05mM至2.45mM范围内。 [0027] 同时，在上述电转缓冲液中还可包括甘油。应理解，甘油作为感受态细胞制备和保存中常用的试剂，若该感受态细胞在电击前所处的试剂中已有甘油，则在电击中采用的缓冲液中也可不添加甘油。甘油的浓度可参考常规的电转缓冲液中的甘油浓度进行设置，例如10％。 [0028] 基于上述电转缓冲液，本发明进一步提供了一种电转化方法。在本发明的一种具体实施方式中，以巨大普里斯特氏菌MIBE00004(保藏编号为CCTCC M2022789)为例，对电转化的具体步骤以及不同实验条件下的电转结果进行了细致的描述。本发明方法适用于目的质粒的快速转化，操作方便快捷。在最佳条件下，目的质粒的转化效率可达110CFU/μg DNA。进一步的，基于上述电转缓冲液和电转化方法，在本发明的一种具体实施方式中还提供了一种包含有噬菌体裂解系统基因的巨大普里斯特氏菌。这些具体的实施方式充分展示了本发明提供的电转缓冲液以及电转化方法在普里斯特氏菌的工程菌制备中的应用前景。由此，本发明提供的巨大普里斯特氏菌转化体系，解决了现有技术中巨大普里斯特氏菌转化困难的问题，为巨大普里斯特氏菌的菌种改造提供技术支持。 [0029] 下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。 [0030] 实施例1：穿梭质粒的电转化和不同条件下的转化效率检测 [0031] 1、感受态细胞的制备： [0032] 本例中使用巨大普里斯特氏菌MIBE00004作为目标菌株来制备感受态 [0033] 细胞。其制备方法具体包括： [0034] a、将巨大普里斯特氏菌MIBE00004菌种在SOC固体培养基平板上划线培养，37℃培养24h。 [0035] b、挑取单克隆接种于SOC液体培养基，置于37℃摇床220rpm过夜培养。 [0036] c、转接过夜培养物至100mL SOC液体培养基，置于37℃摇床220rpm培养至OD600为0.50至1.10。 [0037] d、分装培养物至50mL无菌离心管，冰浴20min，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。 [0038] e、将收集的菌体用5mL 4℃保藏的无菌水进行重悬，冰浴10min，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体，此步骤重复2次。 [0039] f、将收集的菌体用5mL 4℃保藏的30％甘油溶液进行重悬，冰浴10min，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体，此步骤重复2次。 [0040] g、将收集的菌体用1mL 4℃保藏的30％甘油溶液进行重悬，分装到无菌离心管中，100μL/管，‑80℃可保存，即可得到巨大普里斯特氏菌MIBE00004感受态细胞。若保存6个月建议现配现用备用。 [0041] 在上述巨大普里斯特氏菌MIBE00004感受态细胞的制备方法中，本例中SOC固体培养基的成分为胰蛋白胨2％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.05％、KCl 2.5mM、MgCl2 10mM、MgSO4 10mM、D‑葡萄糖20mM、琼脂粉1.5％。SOC液体培养基的成分为胰蛋白胨2％、酵母提取物 0.5％、NaCl 0.05％、KCl 2.5mM、MgCl2 10mM、MgSO4 10mM、D‑葡萄糖20mM。 [0042] 需要特别说明的是，在本发明中利用无菌水和甘油溶液在4℃下经重悬－离心方法处理生长旺盛的细胞，来制备巨大普里斯特氏菌MIBE00004感受态细胞。 [0043] 2、目的质粒的电转化：本例中使用Bio‑Rad Micropulser电转化仪，其中电击杯电极间距为0.2cm。本例中采用的电转化方法包括以下步骤： [0044] a、取50μL巨大普里斯特氏菌MIBE00004感受态细胞，加入相应量的质粒DNA(本例中采用的是穿梭质粒pWH1520)，冰浴15min，加入50μL电转化缓冲液，冰浴5min，然后转入预冷的0.2cm电击杯中进行电击； [0045] b、电击结束后，迅速于电击杯中加入1mL SOC液体培养基(同上述感受态细胞制备)，充分混匀后转移至无菌离心管，置于37℃摇床220rpm孵育2h； [0046] c、将孵育后的转化细胞培养液涂布于含载体抗性的抗生素筛选平板上，37℃倒置培养12h至18h，观察克隆生长情况与计算克隆数目。 [0047] 本例中含载体抗性的抗生素筛选平板含四环素10μg/mL。 [0048] A、为说明不同电转缓冲液的效果，本例中采用了5种不同的电转缓冲液进行对照实验。具体如下： [0049] EM0溶液的成分为去离子水。 [0050] EM1溶液的成分为蔗糖0.2M，余量为去离子水。 [0051] EM2溶液的成分为蔗糖0.2M和NaCl 1mM，余量为去离子水。 [0052] EM3溶液的成分为蔗糖0.2M和KH2PO4 1mM，余量为去离子水。 [0053] EM4溶液的成分为蔗糖0.2M和NaH2PO4 1mM，余量为去离子水。 [0054] 如图4所示，在200ng质粒、OD600为0.8、电击强度为9kV/cm的条件下，选用EM4溶液作为电转化缓冲液时，转化效率最高，是加入等量去离子水的对照组的22倍。 [0055] B、在本例中，还进一步通过改变不同实验条件例如质粒浓度、细胞浓度、电击强度，摸索对巨大普里斯特氏菌MIBE00004电转化效率的影响的其他体条件，结果如图2‑4所示。 [0056] 1)质粒浓度对比实验中，除质粒浓度分别采用了50ng、100ng、200ng、400ng和800ng外，其它条件均相同，具体为：OD600为0.8，电击强度为9kV/cm，电转化缓冲液选用EM4溶液，如图2所示，在一定范围内增加质粒浓度可显著提高电转化效率。当质粒浓度从50ng增加到200ng时，相同条件下的电转化效率可从40CFU/μg DNA提升至110CFU/μg DNA。但当继续增加质粒浓度至400ng或800ng时，电转化效率大幅度下降。 [0057] 2)不同浓度的细胞来制备感受态细胞的对比实验，如图3所示，在200ng质粒、电击强度为9kV/cm、电转化缓冲液选用EM4溶液的条件下，不同浓度的细胞制备感受态细胞后的其电转化效率存在差异。当细胞浓度OD600在0.65至0.95时，其电转化效率最高。 [0058] 3)不同电击强度的对比实验中，如图4所示，在200ng质粒、OD600为0.8、电转化缓冲液选用EM4溶液的条件下，电击强度也显著影响电转化效率，过低或过高的电击强度均会影响电转化效率。当电击强度为7kV/cm至11kV/cm时，电转化的效果最好。 [0059] 因此，经过优化，巨大普里斯特氏菌MIBE00004感受态细胞制备与电转化的最佳条件为：100ng至400ng质粒，细胞OD600为0.65至0.95，电击强度为7kV/cm至11kV/cm，电转化缓冲液选用EM4溶液。 [0060] 实施例2：噬菌体裂解酶基因的转化 [0061] 本例以上述实施例1来制备感受态细胞，采用将重组质粒直接电击转化到巨大普里斯特氏菌MIBE00004的方法来实现目的质粒的转化。本例中的目的质粒为重组质粒pWH1520‑holin‑endolysin，其选择穿梭质粒pWH1520作为载体，噬菌体裂解系统基因holin‑endolysin被选为目的基因，编码Holin蛋白和Endolysin蛋白，允许细菌裂解细胞壁实现自裂解。 [0062] 本例使用的Holin蛋白基因来自芽孢杆菌噬菌体vB_BveP‑Goe6vB，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。 [0063] 本例使用的Endolysin蛋白基因来自芽孢杆菌噬菌体vB_BveP‑Goe6vB，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。 [0064] 引物由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反应使用2×Taq Master Mix(Dye Plus)聚合酶(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)扩增。限制性内切酶与T4连接酶均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。质粒DNA的提取与PCR产物纯化均使用试剂盒(北京全式金生物技术股份有限公司)。 [0065] 以芽孢杆菌噬菌体vB_BveP‑Goe6vB基因组为模板，设计引物F和R进行目的基因holin‑endolysin扩增，其核苷酸序列分别为： [0066] 引物F：5’‑ACTAGTATGACAATGATTGCATGGA‑3’(SEQ ID NO.3)； [0067] 引物R：5’‑GGATCCTCAACTTAGTCTAATTGTT‑3’(SEQ ID NO.4)。 [0068] 分别将质粒载体pWH1520和扩增基因holin‑endolysin使用限制性内切酶SpeI、BamHI进行双酶切，回收酶切片段后用T4连接酶进行连接，获得重组质粒pWH1520‑holin‑endolysin(参见图5)。 [0069] 按照实施例1中的最优的电转化条件将重组质粒pWH1520‑holin‑endolysin转化导入巨大普里斯特氏菌MIBE00004，即：200ng质粒，细胞OD600为0.8，电击强度为9kV/cm，电转化缓冲液选用EM4溶液。在四环素抗性平板上筛选后可获得110个克隆/μg DNA。获得的克隆子用于噬菌体裂解酶基因表达效果的表征。 [0070] 挑取克隆子单菌落接种于LB液体培养基，置于37℃摇床220rpm过夜培养。转接过夜培养物至新鲜LB液体培养基，置于37℃摇床220rpm培养至对数期，加入8g/L木糖作为诱导剂，再次置于37℃摇床220rpm诱导培养24h。 [0071] 诱导培养结束后，转移培养物至无菌离心管，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。加入2.5％戊二醛固定液，置于4℃冰箱中固定4h至6h，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。用无菌水重悬菌体，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体，此步骤重复2次。加入不同浓度梯度的乙醇进行脱水，室温静置5min，乙醇浓度梯度依次为30％，50％，70％，90％，95％，100％。每次脱水处理后均需室温8000rpm离心10min，收集菌体。加入叔丁醇，于4℃冰箱静置1h，转移至‑80℃冰箱冷冻过夜。将样品真空干燥24h，获得菌粉。 [0072] 用棉签轻蘸菌粉，在导电胶上刮薄铺平，置于离子溅射仪进行喷金，喷金时间设置为0.5min(镀金的对应厚度为8nm)。利用扫描电子显微镜观察细胞形态，放大倍数设置为1000倍。结果表明，转化重组质粒pWH1520‑holin‑endolysin的实验组中，克隆子细胞明显发生裂解，而未转化重组质粒pWH1520‑holin‑endolysin的对照组，仍保持细胞结构的完整性(参见图6)。 [0073] 以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

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