| 热词 | 土壤 dna 基因组 微生物 基因 生物 提取 样品 质量 内参 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202311839219.6 | 申请日 | 2023-12-28 |
| 公开(公告)号 | CN117821442A | 公开(公告)日 | 2024-04-05 |
| 申请人 | 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心); | 申请人类型 | 科研院所 |
| 发明人 | 李红梅; 魏艳丽; 扈进冬; 杨翰; 杨凯; 吴远征; 王贻莲; 赵忠娟; 李纪顺; | 第一发明人 | 李红梅 |
| 权利人 | 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) | 权利人类型 | 科研院所 |
| 当前权利人 | 山东省科学院生态研究所(山东省科学院中日友好生物技术研究中心) | 当前权利人类型 | 科研院所 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：山东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：山东省济南市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：山东省济南市历城区彩石镇经十东路28789号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：250100 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 ; C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 济南舜源专利事务所有限公司 | 专利代理人 | 辛向东; |
| 摘要 | 本 发明 涉及分子 生物 学技术领域，具体涉及一种大 质量 土壤 样品 微生物 基因组DNA提取方法，包括向提取容器中加入土壤样品、两种不同直径的 研磨 珠和提取缓冲液，混合振荡，得到初步裂解液；加入SDS后加热裂解，得到二次裂解液；离心获取第一上清液，蛋白除杂后再次离心获得第二上清液；加入沉淀 试剂 混匀，获得DNA沉淀物；漂洗后用TE缓冲液进行溶解，纯化后获得土壤微生物基因组DNA。该微生物基因组DNA提取方法适用于大质量的各类土壤样品，能有效去除 腐殖酸 等难去除的杂质，提取率可达到85%，得到的基因组DNA 片段 大、纯度高，可直接进行PCR及高通量测序等分子操作，检测到细菌OTU丰度显著高于小质量土壤样品，更能满足土壤微生物检测的实际需要。 | ||
| 权利要求 | 1.一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，包括： |
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| 说明书全文 | 一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法技术领域[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法。 背景技术[0002] 土壤微生物是土壤中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称，严格意义上应包括细菌、古菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类。它们在土壤中进行氧化、硝化、氨化、固氮、硫化等过程，促进土壤有机质的分解和养分的转化。土壤微生物的研究方法经历了从微生物纯培养、土壤酶活性（BIOLOG微平板分析）、微生物库（如微生物生物量）和流（C和N循环），到微生物生物标记物（FAMEs）、微生物分子生物学技术（从土壤中提取DNA，进行PCR‑DGGE、PCR‑SSCP、RLFP分析等）的发展，揭示了土壤微生物群落丰富的多样性和生态功能。 [0003] 在利用微生物分子生物学技术进行土壤微生物研究时，高质量提取土壤微生物基因组DNA是高通量测序检测土壤中微生物组成的重要前提。然而土壤样品成分复杂，往往导致基因组DNA提取率低、纯度差，尤其是当土壤中含有大量的腐殖酸时，腐殖酸易与DNA结合一同被沉淀下来，影响后续的实验操作，如PCR、高通量测序等。目前提取土壤微生物基因组DNA的方法很多，商品化的试剂盒是主流方法，但是一般试剂盒所能处理的土壤样品量较少，大多为0.25 1.0g。从小质量土壤样品中提取的微生物基因组DNA并不能有效反映土壤~中实际微生物的组成，容易造成部分频率低、丰度小的微生物漏检。 发明内容[0004] 针对现有土壤微生物基因组DNA的提取方法处理的土壤样本量小、容易造成部分频率低、丰度小的微生物漏检的技术问题，本发明提供一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，能有效去除腐殖酸、多糖等杂质，满足土壤微生物研究的分子生物学实验要求，同时可以处理大质量土壤样本，能获得更高的微生物多样性，避免微生物漏检。 [0005] 一种大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，包括：（1）向提取容器中加入土壤样品、研磨珠和提取缓冲液，混合振荡，得到初步裂解液； （2）加入SDS后加热裂解，得到二次裂解液； （3）离心获取第一上清液，蛋白除杂后再次离心获得第二上清液； （4）加入沉淀试剂混匀，获得DNA沉淀物； （5）漂洗后用TE缓冲液进行溶解，纯化后获得土壤微生物基因组DNA。 [0006] 进一步的，土壤样品为林下土、盐碱土、稻田土、果园土、设施大棚土中的一种。 [0007] 进一步的，步骤（1）中，提取缓冲液包括如下组分：1.0 2.0mol·L‑1NaCl、质量浓度~‑1 ‑1 ‑1 1%~2% CTAB、0.1mol·L EDTA、0.1mol·L Tris‑HCl、0.095mol·L Na2HPO4、0.005mol·L‑1 NaH2PO4，提取缓冲液的pH为8.0~8.5；研磨珠具体为直径1mm的玻璃珠和直径5mm的氧化锆珠。 [0008] 进一步的，步骤（1）中，土壤样品和提取缓冲液的质量体积比为1:1，提取容器与土壤样品的体积质量比为5 10:1，混合振荡具体为37℃、180rpm水平振荡1h。~ [0009] 进一步的，步骤（2）中，SDS的加入量为土壤样品质量的2% 4%，加热裂解具体为65~℃下裂解1.5h。 [0010] 进一步的，步骤（3）中，蛋白除杂具体为：取全部或部分第一上清液，加入等体积的预冷的氯仿，温和颠倒混匀。 [0011] 进一步的，步骤（4）中，沉淀试剂包括质量浓度15% 25%的PEG8000溶液和2.0~ ~‑1 2.5mol·L 的NaCl溶液，PEG8000溶液的加入量为第二上清液体积的1/3，NaCl溶液的加入量为第二上清液体积的1/3。 [0012] 进一步的，步骤（5）中，漂洗使用的漂洗液为体积分数70% 80%的乙醇溶液，纯化使~用纯化试剂盒，优选为QIAGEN公司的DNeasy® Power Clean® Pro Cleanup Kit。 [0013] 进一步的，步骤（1）中，在提取之前，向土壤样品加入内参大肠杆菌，用于后续土壤基因组DNA提取率的检测，所用检测方法为实时荧光定量PCR检测方法。 [0014] 进一步的，向土壤样品加入内参大肠杆菌的方法为：将内参大肠杆菌在氨苄抗性LB平板上活化后，挑取单菌落于氨苄LB试管中，37℃、180rpm振荡过夜，取少量菌液进行显4 微镜计数，以1.0×10 CFU/g土的用量与待提取微生物基因组DNA的土壤样品进行充分混匀，晾干，冻存于‑20℃备用。 [0015] 进一步的，内参大肠杆菌的内参质粒所含目的基因为Spark基因。 [0016] 本发明的有益效果在于：1、本发明提供的大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，适用于大质量的各种类型的土壤样品，能有效去除腐殖酸等难去除的杂质，提取率可达到85%，可获得大片段基因组DNA（＞20Kb），其纯度指标OD260/OD280＞1.8，OD260/OD230＞1.6，可直接进行PCR及高通量测序等分子操作。 [0017] 2、采用本发明提供的大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法，通过对不同质量的土壤样品进行微生物基因组DNA提取、测序分析，发现大质量土壤样品（100g、50g）的细菌OTU丰度显著高于小质量土壤样品（0.25g、1.0g、10g），50 100g的土壤样本更能满足土壤~微生物检测的实际需要。 附图说明 [0018] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0019] 图1为实施例1中不同质量土壤的微生物基因组DNA凝胶电泳图；其中，M为DNALadder条带，1为0.25g土壤样品的微生物基因组DNA条带、2为1.0g土壤样品的微生物基因组DNA条带、3为10.0g土壤样品的微生物基因组DNA条带、4为50.0g土壤样品的微生物基因组DNA条带、5为100.0g土壤样品的微生物基因组DNA条带。 [0020] 图2 为实施例2中不同类型土壤的微生物基因组DNA凝胶电泳图；其中，M为DNALadder条带，1为松树林下土壤样品的微生物基因组DNA条带、2为盐碱土壤样品的微生物基因组DNA条带、3为苹果园土壤样品的微生物基因组DNA条带、4为稻田土壤样品的微生物基因组DNA条带、5为蔬菜大棚土壤样品的微生物基因组DNA条带。 具体实施方式[0021] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。 [0022] 实施例1 不同质量土壤的微生物基因组DNA提取本实施例以小麦田土壤为样品提取微生物基因组DNA。 [0023] 1.试剂成分及配置研磨珠：直径1mm的玻璃珠和直径5mm的氧化锆珠； ‑1 ‑1 提取缓冲液：包括NaCl 1.5mol·L 、CTAB质量浓度2%、EDTA 0.1mol·L 、Tris‑‑1 ‑1 ‑1 HCl 0.1mol·L 、Na2HPO40.095mol·L 、NaH2PO40.005mol·L ，pH为8.0； 蛋白除杂液：氯仿； ‑1 沉淀试剂：质量浓度20%的PEG8000溶液，2.5mol·L 的NaCl溶液； 漂洗液：体积分数75%的乙醇溶液； 溶解液：TE buffer（pH 8.0）； ® ® 纯化试剂盒：DNeasy Power Clean Pro Cleanup Kit，购自QIAGEN公司。 [0024] 2.提取步骤（1）制备内参大肠杆菌：含有内参质粒（Spark基因）的大肠杆菌在氨苄抗性的LB平‑1 板上活化，挑取单菌落接种到LB液体中（氨苄100mg·L ），37℃振荡培养过夜，取少量菌液稀释后镜检计数，同时进行平板活菌计数。 [0025] （2）准备土壤样品：采集的小麦田土壤，除杂，过20目筛，混合均匀，按1.0×4 ‑1 10 CFU·g 土的量喷入内参大肠杆菌，再次充分混合，按四等分法分别取0.25g、1.0g、 10.0g、50.0g、100.0g含有内参大肠杆菌的土壤样品于三角瓶中（三角瓶体积与土壤质量比为5：1），每个质量设置三个重复。 [0026] （3）初步裂解：三角瓶中加入研磨珠，再加入与土壤样品质量相等体积的提取缓冲液，37℃、180rpm水平振荡1h，得到初步裂解液。 [0027] （4）二次裂解：向初步裂解液中，加入土壤样品质量4%的SDS固体粉末后加热，于65℃静置裂解2h，期间每30min振荡一次，每次30s，得到二次裂解液。 [0028] （5）离心除杂：将二次裂解液8000g离心15min，得到第一上清液；取全部第一上清液，加入等体积的预冷的氯仿，温和颠倒混匀30s后，8000g离心15min，去除蛋白等杂质，得到第二上清液。 [0029] （6）向第二上清液中加入质量浓度20%的PEG8000溶液和2.5mol·L‑1的NaCl溶液，PEG8000溶液的加入量为第二上清液体积的1/3，NaCl溶液的加入量为第二上清液体积的1/3，置于4℃沉淀2h，8000g离心30min，倒掉上清，得到DNA沉淀物。 [0030] （7）将DNA沉淀物用2mL漂洗液（体积分数75%的乙醇溶液）进行漂洗，倒掉漂洗液，重复漂洗3次，将沉淀自然晾干，加入TE buffer进行溶解，得到基因组DNA溶液。 [0031] （8）取100µL基因组DNA溶液，用DNeasy® Power Clean® Pro Cleanup Kit进行纯化，按照试剂盒说明书进行操作，得到土壤微生物基因组DNA，‑20℃保存备用。 [0032] 3.土壤微生物基因组DNA提取质量及扩增子测序检测（1）利用NaNoDrop 2000检测土壤微生物基因组DNA的浓度、纯度，采取常规操作。 [0033] （2）0.7%琼脂糖凝胶电泳检测土壤微生物基因组DNA的片段大小，采用常规操作。 [0034] （3）QPCR（内参基因）检测土壤微生物基因组DNA的提取率，具体方法如下：①采用荧光定量PCR法扩增土壤微生物基因组DNA中的内参基因（Spark）； ②荧光定量PCR检测反应体系如下：SYBR Green Mix（2×）10µL，正向引物（10µM） 0.5µL，反向引物（10µM）0.5µL，模板1µL，水7µL，总计20µL；以无模板的水体系为对照； ③荧光定量PCR反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性5s，53℃退火延伸1min， 40个循环；反应后进行熔解曲线、扩增曲线分析，根据CT值以及前期建立的标准曲线计算实际拷贝数和理论拷贝数的比值，即为基因组DNA的提取率。 [0035] （4）16S rDNA扩增子测序分析土壤微生物多样性：将微生物基因组DNA送至微科盟科技集团有限公司，进行16S rDNA扩增子测序分析。 [0036] 其中，琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA片段大小的结果如图1所示，其他检测结果如表1所示。 [0037] 表1不同质量土壤样品的微生物基因组DNA提取效果比较 [0038] 注：小写字母不同表示各处理在0.05水平上的差异显著。 [0039] 如表1所示，不同质量的土壤样品提取到的土壤微生物基因组DNA纯度高，提取量大且提取率高。根据图1凝胶电泳结果显示，采用本发明的提取方法得到的土壤微生物基因组DNA特异性和完整性都很高，得到的DNA片段大（＞20kb），能满足后续各类实验操作。与小质量土壤样品（0.25g、1g、10g）相比，大质量土壤样品（50.0g、100.0g）得到的土壤微生物基因组DNA提取量和提取率有明显提高，表明该提取方法适合大质量土壤样品基因组DNA提取。16S rDNA扩增子测序结果表明，随着土壤样本质量的增加，所测得的细菌OTU数目随之增加，因此，本发明提供的大质量土壤样品微生物基因组DNA提取方法对土壤微生物具有更高的覆盖率，能更好的反映土壤微生物的组成。 [0040] 实施例2 不同类型土壤的微生物基因组DNA提取与实施例1的不同之处在于，使用不同类型土壤作为土壤样品，包括松树林下土、盐碱土、苹果园土、稻田土及蔬菜大棚土，各类型土壤的用量均为100.0g，每种设置4个重复。试剂组成及配置、提取步骤及检测手段同实施例1。 [0041] 结果如表2和图2所示，可以看出利用本方法分别提取大质量的不同种植类型土壤中的微生物基因组DNA，提取率和提取量都很好，除盐碱土外，其他四种种植类型土壤在提取量和提取率上无差异，表明该方法可以对多种土壤进行大质量提取。 [0042] 表2不同类型土壤样品的微生物基因组DNA提取效果比较 [0043] 注：小写字母不同表示各处理在0.05水平上的差异显著。 [0044] 实施例3 小麦田土壤中茎基腐病病原菌—假禾谷镰孢菌的定量检测通过定量检测土壤中假禾谷镰孢菌的孢子数量，结合后期小麦茎基腐病的发病指数和白穗率，验证该方法提取的基因组DNA是否能真实反映土壤中的微生物组成。 [0045] （1）假禾谷镰孢菌定量检测方法如下：①采集小麦茎基腐病发病程度不同的5个点的小麦田土壤，去杂，过20目筛，混合均匀，取土壤样品100g，4个重复，按实施例1中的试剂及提取步骤提取土壤微生物基因组DNA。 [0046] ②根据前期构建的假禾谷镰孢菌的标准质粒梯度稀释后，利用假禾谷镰孢菌特异引物的和Taq Man探针法进行荧光定量PCR，得到标准曲线（由荧光定量软件Bio‑rad IQ5自动生成），根据标准曲线，计算荧光定量PCR扩增的各土壤样品中假禾谷镰孢菌的拷贝数，计算公式如下： [0047] 式中，SQ——荧光定量PCR结果，DNA length——标准质粒的大小， ——使用的土壤微生物基因组DNA体积， ——使用的土壤样品质量。 [0048] 其中，假禾谷镰孢菌特异引物序列如下：Fp_TEF1α.2P：5’‑ACTCGACACGCGCCTGTTACCC‑3’； Fp_TEF1α.2R：5’‑AAAAATTACGACAAAGCCGTAAAAA‑3’。 [0049] （2）小麦白穗率及茎基腐病的调查小麦生长中后期对采集土壤的地块进行白穗率和茎基腐病病害调查。病害分级标准分为四个等级：0级无褐变，1级节间褐变占比0‑25%，2级节间褐变占比25%‑50%，3级节间褐变占比50%‑75%，4级节间褐变占比75%‑100%。病情指数和白穗率按以下公式计算： [0050] 式中，最高级值为分级标准中的最高值； [0051] 上述检测及调查结果如表3所示。 [0052] 对比例1采用常用的商品化试剂盒DNeasy® Power Soil® Kit（QIAGEN）提取实施例3中的土壤样品的微生物基因组DNA，每种土壤样本用量为0.3g，提取步骤按试剂盒说明书进行，然后采用实施例3步骤（1）②的方法中的结果如表3所示。 [0053] 表3 不同提取方法的检测结果比较 [0054] 注：同列数据后小写字母不同表示各组在0.05水平上的差异显著。 [0055] 由表3的数据可以看出，土壤中病原菌的数量与病情指数和白穗率呈正相关，即土壤中病原菌数量越多，该地块的病情指数越高，白穗率也越高。实施例3和对比例1所采用的提取方法，都能体现出不同病情指数地块的土壤中病原菌数量的变化趋势。但采用商品化试剂盒提取的土壤微生物基因组DNA，因土壤样本用量少，检测到的病原菌（假禾谷镰刀菌）数量明显低于实施例3。而采用本发明提供的提取方法制得的土壤微生物基因组DNA，检测到的病原菌数量更高，具有更好的生物意义。 [0056] 尽管通过结合附图并优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。 |
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