一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法
| 热词 | 核酸 裂解 提取 试剂盒 试剂 洗脱液 洗脱 洗涤液 5g tris | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202310273784.4 | 申请日 | 2023-03-16 |
| 公开(公告)号 | CN116769767A | 公开(公告)日 | 2023-09-19 |
| 申请人 | 山东博科生物产业有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 寇增强; 刘珂珂; 李林林; 董雯; | 第一发明人 | 寇增强 |
| 权利人 | 山东博科生物产业有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 山东博科生物产业有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：山东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：山东省济南市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：山东省济南市章丘区明水经济开发区(经十东路与明埠路交界山东博科产业园) | 邮编 | 当前专利权人邮编：250200 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 ; C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 8 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 济南圣达知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 张晓鹏; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种核酸提取 试剂 盒 及核酸提取方法，包括裂解液、 磁珠 和洗脱液，其中，裂解液的组成成分有：Tris缓冲液20～100mmol/L，pH值5.5～7.5；NaCl 5～10g/L；十二烷基 硫酸 钠2～10g/L；异硫氰酸胍5～10g/L；EDTA 5～10g/L；BSA 1～5g/L；极美115 2～5g/L；NP‑40 2～5g/L；吐温20 5～10g/L；磁珠为超顺 磁性 海藻酸钠纳米磁珠；洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液50～100mmol/L，pH值为7.0～7.5； 乙醇 60％～80％；洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液50～100mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L； 溶剂 为纯化 水 。该试剂盒具有简单有效、快速方便、耗时短、核酸提取效率高等优势，可满足大批量样本的提取要求。 | ||
| 权利要求 | 1.一种核酸提取试剂盒，其特征在于：包括裂解液、磁珠、洗涤液和洗脱液，其中，裂解液的组成成分有：Tris缓冲液20～100mmol/L，pH值5.5～7.5；NaCl 5～10g/L；十二烷基硫酸钠2～10g/L；异硫氰酸胍5～10g/L；EDTA 5～10g/L；BSA 1～5g/L；极美115 2～ |
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| 说明书全文 | 一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法技术领域背景技术[0002] 这里的陈述仅提供与本发明相关的背景技术，而不必然地构成现有技术。 [0003] 核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，是生命最基本的物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸与蛋白质形成核蛋白。核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞内都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤包括：裂解细胞；去除与核酸结合的蛋白质和多糖、脂类等生物大分子；去除其他不需要的核酸分子；沉淀核酸纯化核酸；去除盐类等杂质。工序较为繁琐，耗时长。随着近年来分子生物学的飞速发展，PCR检测技术应用越来越广泛，核酸提取的工作量飞速增加，所以传统的核酸提取方式已经不能满足大量疾病检测的需求。 [0004] 而且，现有的细胞裂解液中一般包含蛋白酶K，蛋白酶K在运输时需要低温，容易导致运输的不便性。 [0005] 此外，目前常用的裂解方式有三种：物理方式、化学方式和生物方式。其中，物理方式能够充分裂解细胞，但是可能会造成DNA的断裂。化学方式如碱裂解、CTAB裂解等会引入有毒性的有机溶剂、操作复杂且提取效率低。而利用纳米磁珠可在磁性载体表面修饰特定功能基团，从而实现对核酸的可逆性吸附，但是目前磁珠法的提取试剂盒中仍加入了有机溶剂，有机溶剂容易在制备的核酸中残留，进行PCR反应时，容易抑制反应的进行，不利于后续的PCR反应。 发明内容[0006] 针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种核酸提取试剂盒及核酸提取方法。该试剂盒具有简单有效、快速方便、耗时短、核酸提取效率高等优势，可满足大批量样本的提取要求。 [0007] 为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现： [0008] 第一方面，本发明提供一种核酸提取试剂盒，包括裂解液、磁珠、洗涤液和洗脱液，其中， [0009] 裂解液的组成成分有：Tris缓冲液20～100mmol/L，pH值5.5～7.5；NaCl 5～10g/L；十二烷基硫酸钠2～10g/L；异硫氰酸胍5～10g/L；EDTA 5～10g/L；BSA 1～5g/L；极美115 2～5g/L；NP‑40 2～5g/L；吐温20 5～10g/L； [0010] 磁珠为超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠； [0011] 通过乳化方法将超顺磁性Fe3O4纳米粒子直接包覆于交联的海藻酸钠中，便可以得到粒径大小为25‑30nm超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠，然后用环氧乙烷和戊二醛对磁性海藻酸钠进行活化修饰，使其表面分别带有环氧功能基和醛基功能基，因此该活化载体在不同的pH值下可通过共价偶联法来固定核酸和释放核酸。 [0012] 洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液50～100mmol/L，pH值为7.0～7.5；乙醇60％～80％，％指的是体积百分数； [0013] 洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液50～100mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L；溶剂为纯化水。 [0014] 裂解液可使蛋白质变性，能速速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白的二级结构受到破坏所以使其与核酸分离。所以裂解液的作用便是将核酸从细胞内给释放出来。裂解的细胞内除了核酸以外还有不少的盐类，需要用洗涤液对核酸进行沉淀，不然对后续的实验结果会造成一定的干扰。洗脱液可以将核酸从磁珠上洗脱下来。 [0015] 裂解液中，Tris‑HCL缓冲液可以提供一个较为合适的裂解环境，NaCL对维持核酸结构的稳定起着较为重要的作用，EDTA可以抑制样品中的核酸酶对核酸的破坏，对维持其稳定具有较为重要的作用，十二烷基硫酸钠、异硫氰酸胍和NP‑40可以使蛋白质变性、破坏细胞膜结构从而将蛋白和核酸分离，这样在裂解体系里便可以得到游离的核酸，这些原材料相互协作，可以去除杂质，给核酸提供一个较为稳定的环境。 [0017] 洗涤液中，乙醇如果加入过少则会清洗不干净会出现杂质，如果加入乙醇过多，乙醇不挥发不彻底会对后面的扩增产生一定的抑制作用。 [0018] 第二方面，本发明提供采用所述核酸提取试剂盒进行的核酸提取方法，包括如下步骤： [0020] 将搅拌套转移至洗涤液中，将杂质清除； [0021] 然后在洗脱液中将DNA进行纯化，得到核酸样本。 [0023] 在一些实施例中，震荡混匀的时间为8‑12s，优选为10s。 [0024] 具体的操作过程如下： [0025] (1)取出裂解液、洗涤液和洗脱液三块试剂板，轻甩2‑3次，将挂在孔壁上的液体甩至试剂板底部。 [0027] (3)在板位1(裂解液)中加入200μL样品 [0028] (4)将三块试剂板和搅拌套放入核酸提取仪的对应位置 [0029] (5)选择核酸提取程序并运行 [0030] (6)程序运行结束后，取出试剂板和搅拌套，洗脱液中为提取好的核酸样本。 [0031] 上述本发明的一种或多种实施例取得的有益效果如下： [0032] 1、本发明的核酸提取试剂盒可以快速的从拭子、血清、唾液等样本中分离纯化核酸样本，而且整个过程只有裂解、洗涤和洗脱三个步骤，相比较起来更快高效快速节省时间；该核酸提取试剂盒的裂解液中不包含蛋白酶K，由于蛋白酶K在运输时需要低温，需要减少了运输的不便性。 [0033] 2、本发明的核酸提取试剂盒的裂解液中不含有毒试剂，能使核酸充分释放，得到的核酸浓度和纯度较高，成本低且无污染。 [0035] 洗脱液不含任何有机溶剂，提取的核酸溶液能够直接应用于后续的PCR扩增反应，极大的简化了实验步骤，缩短了时间成本和物料成本。能够满足医院和检测机构对核酸提取效率和质量的要求。 [0038] 图1为本发明第一对照组的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线； [0039] 图2为本发明实施例1的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线； [0040] 图3为本发明实施例2的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线； [0041] 图4为本发明实施例3的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线； [0042] 图5为本发明实施例4的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线； [0043] 图6为本发明实施例5的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线； [0044] 图7为本发明实施例6的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线； [0045] 图8为第二对照组的磁珠法核酸提取试剂盒提取的核酸扩增曲线。 具体实施方式[0046] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。 [0047] 下面结合对比例和实施例对本发明作进一步说明。 [0048] 对比例1 [0049] 一种核酸提取试剂盒包括裂解液、蛋白酶K、核酸吸附物、清洗液和洗脱液。 [0050] 裂解液： [0051] 胍盐·············50％±5％(m/v)； [0052] NaCl·············1％±0.5％(m/v)； [0053] EDTA·············0.2％±0.05(m/v)； [0054] 蛋白酶K···········10mg/ml‑20mg/ml； [0055] 磁珠为Fe3O4，粒径为200nm； [0056] 核酸吸附物： [0057] 异丙醇·············20‑30％； [0058] 清洗液：超纯水。 [0059] 洗脱液：DEPC水。 [0060] 实施例1 [0061] 本实施例的磁珠法核酸提取试剂盒包括：裂解液、磁珠、清洗液和洗脱液，其中： [0062] 裂解液的组成成分有：Tris缓冲液20mmol/L，pH值5.5；NaCl5g/L；十二烷基硫酸钠2g/L；异硫氰酸胍5g/L；EDTA 5g/L；BSA 1g/L；极美115 2g/L；NP‑40 2g/L；吐温20 5g/L； [0063] 磁珠为超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠； [0064] 洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液50mmol/L，pH值为7.0；乙醇60％； [0065] 洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液50mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L；溶剂为纯化水。 [0066] 磁珠法核酸提取试剂盒的使用方法，包括以下几个步骤： [0067] a、将生物样本加入裂解液(包含磁珠)板，震荡混匀10s，瞬时离心，此时裂解出来的核酸吸附在磁珠上了，在结合剂的作用下他们吸附在搅拌套上； [0068] b、将搅拌套移至洗涤液中，该步骤可将蛋白、糖分、RNA等杂质进行清除； [0069] c、然后在洗脱液中将DNA进行纯化，得到的便是核酸样本。 [0070] 所述的生物样本包括唾液、咽拭子、血清、粪便等相关样本。 [0071] 实施例2 [0072] 本实施例的磁珠法核酸提取试剂盒包括：裂解液、磁珠、清洗液和洗脱液其中： [0073] 裂解液的组成成分有：Tris缓冲液40mmol/L，pH值6.0；NaCl7g/L；十二烷基硫酸钠5g/L；异硫氰酸胍6g/L；EDTA 6g/L；BSA 2g/L；极美115 3g/L；NP‑40 3g/L；吐温20 6g/L； [0074] 磁珠为超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠； [0075] 洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液60mmol/L，pH值为7.27；乙醇65％； [0076] 洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液60mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L；溶剂为纯化水。 [0077] 检测方法同实施例1的检测方法。 [0078] 实施例3 [0079] 本实施例的磁珠法核酸提取试剂盒包括：裂解液、磁珠、清洗液和洗脱液其中： [0080] 裂解液的组成成分有：Tris缓冲液60mmol/L，pH值6.5；NaCl7g/L；十二烷基硫酸钠4g/L；异硫氰酸胍7g/L；EDTA 7g/L；BSA 3g/L；极美115 4g/L；NP‑40 3g/L；吐温20 6g/L； [0081] 磁珠为超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠； [0082] 洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液65mmol/L，pH值为7.0；乙醇65％％； [0083] 洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液50～100mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L；溶剂为纯化水。 [0084] 检测方法同实施例1的检测方法。 [0085] 将实施例1‑3提取得到的核酸采用eppendorf D30核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，其中核酸纯度为A260和A280的比值，A260表示核酸在260nm波长下的吸光值，A280表示核酸在280nm波长下的吸光值，结果如表1所示。 [0086] 表1不同实施例所提取的唾液核酸浓度和纯度的结果 [0087]样品来源 浓度(ng/μL) 纯度(A260/A280) 对比例1 43.5 1.83 实施例1 44.2 1.85 实施例2 45.7 1.88 实施例3 46.3 1.90 [0088] 通过表1可以看出，本发明试剂盒与对照组试剂盒提取到的核酸纯度都较好，高质量的核酸A260/A280的比值在1.8～2.0范围，而该发明试剂盒提取的核酸纯度均在1.8～2.0之间，说明该核酸无蛋白质等污染，纯度较高，可供下一步使用。 [0089] 提取完成后，取上述唾液酸DNA作为模板，利用荧光定量PCR仪扩增仪进行扩增检测，对比例1和实施例1‑3的扩增结果如图1所示。 [0090] 通过图1可以看出，对比例1和实施例1‑3扩增的曲线是一致的，且其CT值也接近，说明其浓度是基本一致，所以该发明的试剂盒是完成可以满足提取核酸的要求的。 [0091] 实施例4 [0092] 一种核酸提取试剂盒，包括裂解液、磁珠、洗涤液以及洗脱液； [0093] 裂解液的组成成分有：Tris缓冲液80mmol/L，pH值7.0；NaCl8g/L；十二烷基硫酸钠8g/L；异硫氰酸胍8g/L；EDTA 9g/L；BSA 4g/L；极美115 3g/L；NP‑40 4g/L；吐温20 8g/L； [0094] 磁珠为超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠； [0095] 洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液70mmol/L，pH值为7.2；乙醇75％； [0096] 洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液80mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L；溶剂为纯化水。 [0097] 实施例5 [0098] 一种核酸提取试剂盒，包括裂解液、磁珠、洗涤液以及洗脱液； [0099] 裂解液的组成成分有：Tris缓冲液75mmol/L，pH值6.8；NaCl8.5g/L；十二烷基硫酸钠8g/L；异硫氰酸胍7.5g/L；EDTA 8.5g/L；BSA 3.5g/L；极美115 3.5g/L；NP‑40 3.5g/L；吐温20 8.5g/L； [0100] 磁珠为超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠； [0101] 洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液75mmol/L，pH值为6.8；乙醇68％； [0102] 洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液75mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L；溶剂为纯化水。 [0103] 实施例6 [0104] 一种核酸提取试剂盒，包括裂解液、磁珠、洗涤液以及洗脱液； [0105] 裂解液的组成成分有：Tris缓冲液90mmol/L，pH值7.5；NaCl10g/L；十二烷基硫酸钠10g/L；异硫氰酸胍10g/L；EDTA 10g/L；BSA 5g/L；极美115 5g/L；NP‑40 5g/L；吐温20 10g/L； [0106] 磁珠为超顺磁性海藻酸钠纳米磁珠； [0107] 洗涤液的组成成分有：PBS缓冲液100mmol/L，pH值为7.5；乙醇80％； [0108] 洗脱液的组分成分有：Tris缓冲液100mmol/L，pH值7.5；EGTA 5g/L；叠氮钠0.5g/L；溶剂为纯化水。 [0109] 对比例2 [0110] 一种核酸提取试剂盒包括裂解液、蛋白酶K、核酸吸附物、清洗液和洗脱液。 [0111] 裂解液的组成为： [0112] 胍盐············50％±5％，m/v； [0113] NaCl············1％±0.5％，m/v； [0114] EDTA············0.2％±0.05％，m/v； [0115] 蛋白酶K··········10mg/ml‑20mg/ml； [0116] 磁珠为Fe3O4，粒径为200nm。 [0117] 核酸吸附物为20‑30％的异丙醇； [0118] 清洗液：超纯水； [0119] 洗脱液：DEPC水。 [0120] 采用nanodrop微量分光光度仪测定对比例2和实施例4、实施例5和实施例6提取的唾液中核酸浓度及纯度，纯度为A260/A280的比值，A260表示核酸在260nm处的吸光度值，A280表示核酸在280nm处的吸光度值，测试结果如表2。 [0121] 表2唾液样本中核酸的浓度和纯度 [0122] [0123] 从表2可以看出，实施例4、实施例5和实施例6得到的核酸浓度和纯度均高于对比例2，说明本发明的核酸提取试剂盒能够得到高质量的核酸，相较于实施例4和实施例6，其中实施例5提取的核酸浓度和纯度较高。 [0125] 表3稳定性验证结果 [0126] [0127] [0128] 由表3的数据可知，本发明的核酸提取试剂盒能在避光、无腐蚀性气体存在的条件下稳定保存15个月，而对比例2的试剂盒能够储存12个月，在第13个月时，稳定性急剧下降。 [0129] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 |
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