一种PCR管及其应用于靶标核酸分子的检测方法
| 热词 | pcr 核酸 隔离 纤维素 缺口 磁性 纤维 磁铁 清洗 裂解 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202310173522.0 | 申请日 | 2023-02-27 |
| 公开(公告)号 | CN116445258A | 公开(公告)日 | 2023-07-18 |
| 申请人 | 重庆大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 李刚; 罗昱; 石子轩; | 第一发明人 | 李刚 |
| 权利人 | 重庆大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 重庆大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：重庆市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：重庆市沙坪坝区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：重庆市沙坪坝区沙正街174号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：400044 |
| 主IPC国际分类 | C12M1/24 | 所有IPC国际分类 | C12M1/24 ; C12Q1/686 ; B01L3/14 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 5 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 广州嘉权专利商标事务所有限公司 | 专利代理人 | 刘文卓; |
| 摘要 | 本 发明 用于核酸检测技术领域，特别涉及一种PCR管及其应用于靶标核酸分子的检测方法，PCR管包括管体；第一隔离 块 ，设在管体内，第一隔离块上设有第一缺口；第二隔离块，设在管体内，第二隔离块位于第一隔离块下方，第二隔离块上设有第二缺口；细胞裂解液，细胞裂解液中包含 磁性 纤维 素微球；清洗缓冲液，设在第一隔离块与第二隔离块之间；PCR反应 试剂 。这种PCR管能减少清洗步骤和时间和全封闭核酸扩增检测。一种PCR管应用于靶标核酸分子的检测方法，样品液加至管体；利用磁 铁 带动磁性 纤维素 微球进入清洗缓冲液中；利用 磁铁 带动磁性纤维素微球进入PCR反应试剂中；PCR管放入PCR扩增仪中扩增反应，利用对应 荧光 探针照射管体，观察PCR反应试剂中是否发射荧光。 | ||
| 权利要求 | 1.一种PCR管，其特征在于：包括 |
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| 说明书全文 | 一种PCR管及其应用于靶标核酸分子的检测方法技术领域[0001] 本发明用于核酸检测技术领域，特别是涉及一种PCR管及其应用于靶标核酸分子的检测方法。 背景技术[0002] 现有的基于PCR(Polymerase Chain Reaction)的核酸检测技术在基础生物学研究、疾病诊断、司法鉴定、食品安全等众多领域具有重要应用价值。典型的PCR核酸检测过程通常包括样本前处理、核酸提取和PCR扩增检测等多个步骤。其中核酸提取是PCR检测过程中非常关键的一步，需要完成核酸分子的捕获吸附、清洗纯化等操作，其质量和效率直接影响检测结果。目前常规的核酸提取方法主要包括硅胶膜离心柱法和二氧化硅磁珠法，因磁珠法更易于实现自动化，故目前商业化的核酸提取仪均采用基于二氧化硅包覆的磁珠实现核酸提取，这种基于二氧化硅磁珠的核酸提取方法往往涉及多个洗涤、洗脱步骤，整个流程操作较为复杂、耗时较长，对环境及操作人员要求较高。虽然自动化的核酸提取仪大大降低了实验人员的工作强度，但是往往价格较为昂贵，普通实验室、社区医院和小型诊所难以承受；同时，这种基于大型仪器设备的核酸提取方法也无法应用于现场即时检测。 [0003] 另外，目前实验室、医院检验科的核酸提取和PCR扩增检测两个步骤往往是分离的，操作过程中需要多次样品管开盖，以进行试样转移、试剂添加等操作，这种开盖操作极易引起气溶胶污染，且检测致病性细菌或病毒时，这种开盖操作也使得操作人员存在一定的安全风险。 发明内容[0004] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种PCR管及其应用于靶标核酸分子的检测方法，所采用的技术方案如下。 [0005] 一种PCR管，包括 [0006] 管体，所述管体上设有管盖； [0007] 第一隔离块，所述第一隔离块设在所述管体内部，所述第一隔离块上设有第一缺口； [0008] 第二隔离块，所述第二隔离块设在所述管体内部，所述第二隔离块位于所述第一隔离块的下方并与所述第一隔离块相互间隔，所述第二隔离块上设有第二缺口； [0010] 清洗缓冲液，所述清洗缓冲液设在所述第一隔离块与所述第二隔离块之间； [0011] PCR反应试剂，所述PCR反应试剂设在所述第二隔离块下方。 [0012] 本发明实施例的PCR管至少具有如下有益效果：细胞裂解液用于实现待测样品的细胞裂解，以释放其中的核酸分子，磁性纤维素微球在细胞裂解液中可快速吸附核酸，而在清洗缓冲液中短暂清洗时，不会被洗脱，当吸附核酸的磁性纤维素微球转移至PCR反应试剂中后，其中的dNTP会促进吸附的核酸从磁性纤维素微球上释放至溶液中，无需通过调整缓冲液的pH值或盐浓度的方式释放核酸，避免了繁琐的洗脱过程，大大简化了核酸提取过程的实验操作，可以简便、快速地实现PCR检测过程中核酸分离提取和PCR扩增检测一体化、全程封闭式操作，整个过程不依赖昂贵的核酸提取仪，大大减少了清洗步骤和时间，且无需核酸洗脱步骤，也无需样品液或试剂转移操作。 [0013] 根据本发明的另一些实施例的PCR管，所述细胞裂解液与所述清洗缓冲液之间通过隔离油隔开，所述清洗缓冲液与所述PCR反应试剂之间通过隔离油隔开。 [0014] 根据本发明的另一些实施例的PCR管，所述第一缺口和所述第二缺口错开设置。 [0016] 根据本发明的另一些实施例的PCR管，所述磁性纤维素微球的表面为多孔结构。 [0017] 根据本发明的另一些实施例的PCR管，待检测样品为哺乳动物细胞、植物细胞或细菌样本时，所述细胞裂解液为包含硫氰酸胍盐、溶菌酶、蛋白酶K、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠和RNAse酶的其一种或多种的溶液。 [0021] 一种PCR管应用于靶标核酸分子的检测方法，采用上述任任意一项所述PCR管，包括以下步骤： [0022] 打开管盖，将样品液加至管体的细胞裂解液中，盖上管盖，轻微摇晃管体并温育； [0023] 将一块磁铁放置于管体旁靠近第一缺口的一侧，通过磁铁吸引细胞裂解液中的磁性纤维素微球，使得磁性纤维素微球集中至第一缺口的管壁处，移动磁铁，利用磁铁带动磁性纤维素微球从第一缺口进入清洗缓冲液中，然后移去磁铁，轻微摇晃管体，使磁性纤维素微球在清洗缓冲液中分散； [0024] 将磁铁放置于管体旁靠近第二缺口的一侧，吸引清洗缓冲液中的磁性纤维素微球集中至第二缺口的管壁处，移动磁铁，利用磁铁带动磁性纤维素微球从第二缺口进入PCR反应试剂中，然后移去磁铁，摇晃管体，使磁性纤维素微球在PCR反应试剂中分散； [0025] 将PCR管放入PCR扩增仪中进行热循环扩增反应，待扩增反应结束后，利用对应荧光探针激发波长的单色光照射管体，通过观察管体PCR反应试剂中是否发射荧光，判别样品液中是否存在靶标核酸分子。 [0027] 图1是本发明一个实施例的PCR管的结构示意图； [0028] 图2是图1所示实施例中第一隔离块和第二隔离块的结构示意图； [0029] 图3是组装本发明一个实施例中PCR管的流程图； [0030] 图4是本发明一个实施例中靶标核酸分子的检测方法的流程示意图。 具体实施方式[0031] 以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。 [0032] 在本发明实施例的描述中，如果涉及到方位描述，例如“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。 [0033] 在本发明实施例的描述中，如果某一特征被称为“设置”、“固定”、“连接”、“安装”在另一个特征，它可以直接设置、固定、连接在另一个特征上，也可以间接地设置、固定、连接、安装在另一个特征上。在本发明实施例的描述中，如果涉及到“若干”，其含义是一个以上，如果涉及到“多个”，其含义是两个以上，如果涉及到“大于”、“小于”、“超过”，均应理解为不包括本数，如果涉及到“以上”、“以下”、“以内”，均应理解为包括本数。如果涉及到“第一”、“第二”，应当理解为用于区分技术特征，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。 [0034] 现有的基于PCR(Polymerase Chain Reaction)的核酸检测技术在基础生物学研究、疾病诊断、司法鉴定、食品安全等众多领域具有重要应用价值。典型的PCR核酸检测过程通常包括样本前处理、核酸提取和PCR扩增检测等多个步骤。其中核酸提取是PCR检测过程中非常关键的一步，需要完成核酸分子的捕获吸附、清洗纯化等操作，其质量和效率直接影响检测结果。目前常规的核酸提取方法主要包括硅胶膜离心柱法和二氧化硅磁珠法，因磁珠法更易于实现自动化，故目前商业化的核酸提取仪均采用基于二氧化硅包覆的磁珠实现核酸提取，这种基于二氧化硅磁珠的核酸提取方法往往涉及多个洗涤、洗脱步骤，整个流程操作较为复杂、耗时较长，对环境及操作人员要求较高。虽然自动化的核酸提取仪大大降低了实验人员的工作强度，但是往往价格较为昂贵，普通实验室、社区医院和小型诊所难以承受，同时，这种基于大型仪器设备的核酸提取方法也无法应用于现场即时检测。虽然自动化的核酸提取仪大大降低了实验人员的工作强度，但是往往价格较为昂贵，普通实验室、社区医院和小型诊所难以承受；同时，这种基于大型仪器设备的核酸提取方法也无法应用于现场即时检测。 [0035] 另外，目前实验室、医院检验科的核酸提取和PCR扩增检测两个步骤往往是分离的，操作过程中需要多次样品管开盖，以进行试样转移、试剂添加等操作，这种开盖操作极易引起气溶胶污染，且检测致病性细菌或病毒时，这种开盖操作也使得操作人员存在一定的安全风险。 [0036] 参见图1至图4，本发明提供了一种PCR管，包括管体1、第一隔离块2、第二隔离块3、细胞裂解液4、清洗缓冲液5和PCR反应试剂6，管体1上设有管盖7，第一隔离块2设在管体1内部，第一隔离块2上设有第一缺口8，第二隔离块3设在管体1内部，第二隔离块3位于第一隔离块2的下方并与第一隔离块2相互间隔，第二隔离块3上设有第二缺口9，细胞裂解液4设在第一隔离块2上方，细胞裂解液4中包含磁性纤维素微球10，清洗缓冲液5设在第一隔离块2与第二隔离块3之间，PCR反应试剂6设在第二隔离块3下方。 [0037] 细胞裂解液4用于实现待测样品的细胞裂解，以释放其中的核酸分子，磁性纤维素微球10在细胞裂解液4中可快速吸附核酸，而在清洗缓冲液5中短暂清洗时，不会被洗脱，当吸附核酸的磁性纤维素微球10转移至PCR反应试剂6中后，其中的dNTP会促进吸附的核酸从磁性纤维素微球10上释放至溶液中，无需通过调整缓冲液的pH值或盐浓度的方式释放核酸，避免了繁琐的洗脱过程，大大简化了核酸提取过程的实验操作，可以简便、快速地实现PCR检测过程中核酸分离提取和PCR扩增检测一体化、全程封闭式操作，整个过程不依赖昂贵的核酸提取仪，大大减少了清洗步骤和时间，且无需核酸洗脱步骤，也无需样品液或试剂转移操作。 [0038] 其中，第一隔离块2和第二隔离块3均为通过倒模或注塑工艺制成的圆柱形或圆台形弹性隔离块，第一缺口8和第二缺口9均为开设在隔离块侧边的半开口锥体形状，缺口横截面直径介于1～2毫米，当隔离块放入管体1中时，其锥形缺口的横截面积较大的一侧向上。 [0039] 在一些实施例中，第一缺口8和第二缺口9错开设置。 [0040] 具体的，第一缺口8朝向管体1的左侧，第二缺口9朝向管体1的右侧，延长第一缺口8和第二缺口9之间的液体流通路径。 [0041] 在一些实施例中，磁性纤维素微球10为包含四氧化三铁微纳颗粒或铁粉的纤维素颗粒。 [0042] 具体的，磁性纤维素微球10由混合四氧化三铁微纳颗粒或铁粉的纤维素溶液经油相乳化、再生析出、洗涤、冷冻干燥工艺流程制得，磁性纤维素微球10的直径为5～100μm之间。 [0043] 在一些实施例中，磁性纤维素微球10的表面为多孔结构。 [0044] 由于纤维素材料对核酸分子具有较强的特异性吸附能力，且所制备的磁性纤维素微球10为多孔结构，具有极大的有效吸附表面积，因此磁性纤维素微球10的核酸吸附能力较强，且磁性纤维素微球10捕获核酸分子的动力学过程具有吸附快、释放慢的特点。 [0045] 为了防止细胞裂解液4、清洗缓冲液5和PCR反应试剂6三者混合，在一些实施例中，细胞裂解液4与清洗缓冲液5之间通过隔离油11隔开，清洗缓冲液5与PCR反应试剂6之间通过隔离油11隔开。这样利用油相和水相互不相溶的特点以及油/水界面张力作用，可以实现细胞裂解液4、清洗缓冲液5和PCR反应试剂6稳定的物理分隔和分层存储。 [0046] 在一些实施例中，隔离油11为氟化油、矿物油、硅油或者植物油中的一种或多种。 [0047] 在一些实施例中，清洗缓冲液5为包含表面活性剂的三羟甲基氨基甲烷的溶液或包含盐酸胍、硝基葡萄糖、异丙醇其中一种或多种的溶液或质量分数为50％或70％的乙醇溶液或纯水。这样可以可快速洗脱磁性纤维素微球10表面非特异性吸附的蛋白质、盐或其它杂质。 [0048] 在一些实施例中，待检测样品为哺乳动物细胞、植物细胞或细菌样本时，细胞裂解液4为包含硫氰酸胍盐、溶菌酶、蛋白酶K、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠和RNAse酶中其一种或多种的溶液。 [0049] 在一些实施例中，PCR反应试剂6为包含扩增引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、荧光探针或荧光染料、PCR反应缓冲液的混合液。 [0050] 本申请的PCR管的组装流程如下： [0051] 如图3(a)所示，取一高温消毒的200μL PCR管，并向管中滴加20～30μL PCR反应试剂6； [0052] 如图3(b)所示，用镊子取预制并高温消毒的第二隔离块3塞入已加入PCR反应试剂6的PCR管中，使第二隔离块3底部与PCR反应试剂6上表面接触，并轻轻挤压第二隔离块3，通过第二隔离块3的第二缺口9排出PCR反应试剂6与第二隔离块3之间的空气； [0053] 如图3(c)所示，向管中滴加30μL隔离油11，使其淹没第二隔离块3； [0054] 如图3(d)所示，向管中缓慢滴加30μL清洗缓冲液5； [0055] 如图3(e)所示，用镊子取预制并高温消毒的第一隔离块2塞入上述已加入清洗缓冲液5的管体1中，使第一隔离块2底部与清洗缓冲液5上表面接触，并轻轻挤压第一隔离块2，通过第一隔离块2的第一缺口8排出清洗缓冲液5与第一隔离块2之间的空气； [0056] 如图3(f)所示，向管体1中滴加20μL隔离油11，使其淹没第一隔离块2； [0057] 如图3(g)所示，向管体1中缓慢滴加20μL包含磁性纤维素微球10的细胞裂解液4； [0059] 本发明还提供了一种PCR管应用于靶标核酸分子的检测方法，采用上述任意一项PCR管，包括以下步骤： [0060] 打开管盖7，将样品液加至管体1的细胞裂解液4中，盖上管盖7，轻微摇晃管体1并温育； [0061] 将一块磁铁放置于管体1旁靠近第一缺口8的一侧，通过磁铁吸引细胞裂解液4中的磁性纤维素微球10，使得磁性纤维素微球10集中至第一缺口8的管壁处，移动磁铁，利用磁铁带动磁性纤维素微球10从第一缺口8进入清洗缓冲液5中，然后移去磁铁，轻微摇晃管体1，使磁性纤维素微球10在清洗缓冲液5中分散； [0062] 将磁铁放置于管体1旁靠近第二缺口9的一侧，吸引清洗缓冲液5中的磁性纤维素微球10集中至第二缺口9的管壁处，移动磁铁，利用磁铁带动磁性纤维素微球10从第二缺口9进入PCR反应试剂6中，然后移去磁铁，摇晃管体1，使磁性纤维素微球10在PCR反应试剂6中分散； [0063] 将PCR管放入PCR扩增仪中进行热循环扩增反应，待扩增反应结束后，利用对应荧光探针激发波长的单色光照射管体1，通过观察管体1中的PCR反应试剂6是否发射荧光，判别样品液中是否存在靶标核酸分子。 [0064] 具体步骤如下： [0065] (1)如图4(a)所示，取组装好的PCR管，打开管盖7，向其中加入10～20μL待检测的血液样品液，盖上管盖7，轻微晃动PCR管，再将其静置1～5分钟，完成血细胞的裂解和磁性纤维素微球10对核酸的吸附； [0066] (2)如图4(b)所示，取一个磁铁放于管体1外靠近第一缺口8的一侧，使得磁铁将已吸附核酸的磁性纤维素微球10聚集于第一缺口8的管壁旁，再向下缓慢移动磁铁，使得磁铁拉动磁性纤维素微球10突破油水两相之间的界面张力，经隔离油11并从第一缺口8进入清洗缓冲液5中； [0067] (3)如图4(c)所示，待磁性纤维素微球10进入清洗缓冲液5后，移走磁铁，并轻轻摇晃管体1，让磁性纤维素微球10在清洗缓冲液5中散开，然后静置PCR管约10～30秒； [0068] (4)如图4(d)所示，再将磁铁放于管体1外靠近第二缺口9的一侧，使得磁铁将已完成清洗的磁性纤维素微球10聚集于第二缺口9的管壁旁，再向下缓慢移动磁铁，使得磁铁拉动磁性纤维素微球10突破油水两相之间的界面张力，经隔离油11相并从第二缺口9进入PCR反应试剂6中； [0069] (5)如图4(e)所示，移走磁铁，轻轻摇晃PCR管，让磁性纤维素微球10在PCR反应试剂6中散开，然后将PCR管放置于PCR扩增仪上进行热循环扩增(图4(f))； [0070] (6)如图4(g)所示，待PCR热循环反应完成后，取出PCR管，并取一个发光波长对应于PCR反应试剂6中荧光基团吸收波长的激光笔，对准照射PCR管的PCR反应试剂6，同时，另取一对照PCR管，即样品液为纯水，也对其PCR反应试剂6进行如上所述的激光照射(图4(h))，若待测血液样品的PCR管底层发出肉眼可见的荧光，而对照的PCR管底层无可见荧光，则可判断待测血液样本中含有靶标DNA。 [0071] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。 [0072] 这种基于PCR管的靶标核酸分子的检测方法可以快速地实现PCR检测过程中核酸分离提取和PCR扩增检测一体化、全程封闭式操作，整个过程不依赖昂贵的核酸提取仪，大大减少了清洗步骤和时间，且无需核酸洗脱步骤，也无需样品液或试剂转移操作。 |
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