[0001] 本发明涉及一种外泌体及外泌体RNA串联富集鉴定方法，涉及生物技术及分析化学领域。

[0002] 核糖核酸(RNA)作为遗传信息的传递者，也是精准药物治疗中有吸引力的靶点。RNA包括编码蛋白的编码RNA(mRNA)和非编码RNA(ncRNA)；ncRNA虽然不编码蛋白质，但调控着生理和发育进程，同时在多种疾病的发生发展中扮演着关键调节因子；因此RNA也成为了潜在的疾病诊断标志物，为疑难杂症提供新的治疗方向。外泌体是由大多数真核细胞分泌的纳米级(30‑200nm)细胞外囊泡，包含可以在细胞之间传递和交联的蛋白质、RNA和DNA等生物分子；作为细胞间通信和信号转导的重要中介，在一系列生理和病理过程中发挥关键作用。研究发现，外泌体RNA(exoRNA)种类分布不同于体液，其中仅有少量甚至没有核糖体RNA，但包含大量的mRNA和ncRNA(miRNA、lncRNA等)。由于外泌体的囊泡结构可以保护RNA免受体液中的酶降解，因此，外泌体中各类RNA的含量相对于体液RNA更稳定，浓度更高，它们的病理生理作用正在各种疾病中被解码。有研究表明，exoRNA能够影响肿瘤的发生发展、转移、侵袭及肿瘤微环境，使得exoRNA成为极具应用前景的临床诊断分子标志物。获得质量好、完整性高的RNA是进行RNA下游相关分析和研究的前提。目前，RNA的提取方法主要包括乙醇沉淀法、基于苯酚、基于柱以及基于苯酚和柱组合的方法。这些方法存在提取时间长、步骤繁琐、成本高、有毒性等不足。发展快速、高效、经济绿色的RNA提取方法对于RNA的深度发掘具有重要生物学意义。同时已有研究表明现有的分离方法在exoRNA产量、纯度和大小模式分布方面存在广泛差异，还会影响小RNA的组成比、miRNA的含量和数量等。由于外泌体生物来源样品量少，外泌体含量少，相应exoRNA丰度低，因此exoRNA研究的关键在于外泌体的高效快速富集及RNA的特异性分离富集。基于此，亟需发展新的富集策略。

[0003] 本发明的目的是利用TiO2‑磷酸基团的特异性相互作用，提供一种外泌体及外泌体exoRNA串联富集鉴定的新策略。

[0004] 本发明通过将TiO2微球与生物样本共同孵育以捕获其中的外泌体，加入裂解/结合缓冲液裂解外泌体使其释放内容物；释放的RNA进一步结合到TiO2上，完成体液外泌体及exoRNA的串联富集，最终通过测序技术对富集的RNA进行解析。本发明能够快速高效地从生物样本中共同提取外泌体及exoRNA。

[0005] 本发明所提供的外泌体及外泌体exoRNA串联富集鉴定方法(流程图1所示)，包括如下步骤：

[0006] 1)将TiO2微球与生物样本共同孵育以捕获生物样本中的外泌体，清洗去除非特异性吸附，得到表面附着有外泌体的TiO2微球；

[0007] 2)加入裂解/结合缓冲液裂解外泌体使其释放内容物，继续孵育，使外泌体释放的RNA结合到TiO2上，清洗去除非特异性吸附，完成生物样本中exoRNA的富集，最后加入洗脱液将RNA洗脱下来，离心收集上清液即可进行测序分析。

[0008] 上述方法步骤1)中，所述生物样本可为血液、尿液、羊水等包含外泌体的样本，具体可为血清；

[0009] 所述生物样本与TiO2微球共同孵育前，还需进行预处理。

[0010] 所述生物样本为血清，所述预处理的操作为：取血清，分别在4℃条件下，经3000×g离心30分钟，12000×g离心30分钟后，收集上清，即为预处理后的血清样本。

[0011] 所述TiO2微球的粒径可为25nm‑20μm，具体可为5μm、20μm、<100nm，更具体可为5μm。

[0012] 所述生物样本为血清，TiO2微球与血清的配比可为：0.5mg：0.5mL；

[0013] 所述孵育为4℃震荡孵育，孵育的时间可为5‑10min，具体可为5min；

[0014] 所述清洗采用120～160mM NaCl/Tris‑HCl(pH＝7.4)缓冲液进行，所述清洗可进行多次，具体可为三次；

[0015] 清洗用缓冲液与生物样本的配比可为：200μL：0.5mL‑1mL；

[0016] 步骤2)的操作为：向所得表面附着有外泌体的TiO2微球中加入裂解/结合缓冲液，孵育10min，裂解外泌体使其释放RNA，并使释放的RNA与TiO2微球充分结合，加入1.5倍体积(相对于裂解/结合缓冲液的体积)的乙醇，混匀，进一步沉淀析出溶液中的RNA；低速离心弃去上清液；三轮清洗液洗涤沉淀，去除盐酸胍、异硫氰酸胍及蛋白质污染；低速离心弃上清后，将沉淀部分挥发残留乙醇；加入洗脱液和RNA酶抑制剂洗脱RNA，收集RNA溶液，将RNA洗脱液pH调节至中性，加DNaseⅠ处理去除DNA污染，实现血清外泌体及RNA的串联富集。

[0017] 其中，所述裂解/结合缓冲液为：3M异硫氰酸胍/2M盐酸胍/0.1％β‑巯基乙醇/10％乙二醇(pH＝4.1)；每500μL‑1mL血清加入50μL的裂解/结合缓冲液；

[0018] 所述清洗液分别为含60％、80％、90％乙醇的1M异硫氰酸胍溶液；每500μL‑1mL血清加入200μL的清洗液；

[0019] 所述洗脱液为：20mM Tris‑EDTA(pH＝8.0)。

[0020] 每500μL‑1mL血清加入20μL的洗脱液。

[0021] 本发明首先提供了TiO2微球富集细胞RNA的方法，具体为常量细胞RNA的提取和微量细胞RNA的提取，证明TiO2提取复杂生物样本中RNA的可行性，包括如下步骤：

[0022] 细胞培养至浓度约为80％，收集细胞后进行裂解，加入TiO2微球进行富集，孵育完成后，再加入乙醇混匀，细胞中的RNA结合到TiO2微球上，经清洗，离心收集沉淀，即可得到附着有RNA的TiO2微球，最后经洗脱缓冲液洗脱得到RNA溶液。

[0023] 上述提取方法中，所述细胞为HeLa细胞，常量可为5～6×106个，具体可为5×1065 5
个；微量可为1～2×10个，具体可为1×10个；

[0024] 上述提取方法中，裂解细胞的裂解/结合缓冲液为：3M异硫氰酸胍/2M盐酸胍/0.1％β‑巯基乙醇+10％乙二醇(pH＝4.1)，清洗所用清洗液分别为含60％、80％、90％乙醇的1M异硫氰酸胍溶液，所述洗脱缓冲液为：20mM Tris‑EDTA(pH＝8.0)；

[0025] 上述提取方法中，裂解常量HeLa细胞时裂解/结合缓冲液用量可为400～500μL，具体可为500μL；清洗液的用量可为500μL～1000μL，具体可为500μL；洗脱RNA时洗脱缓冲液用量可为50～100μL，具体可为50μL；

[0026] 上述提取方法中，裂解微量HeLa细胞时裂解/结合缓冲液用量可为50～200μL，具体可为100μL；清洗液的用量可为100μL～300μL，具体可为200μL；洗脱RNA时洗脱缓冲液用量可为10～30μL，具体可为20μL；

[0027] 上述提取方法中，所述富集常量HeLa细胞时，TiO2微球用量可为2mg～5mg，具体可为2mg；富集微量HeLa细胞时，TiO2微球用量可为0.05mg～0.5mg，具体可为0.05mg；

[0028] 上述提取方法中，所述裂解HeLa细胞释放RNA并与TiO2孵育的时间可为5～10min，具体可为10min，所述洗脱RNA的时间可为5～10min，具体可为5min；

[0029] 上述提取方法中，所述离心条件可为：3000g离心3min或6000g离心3min；

[0030] 上述所述方法还优化考察了TiO2用量、乙醇用量、孵育时间、孵育温度以及不同粒径的TiO2微球对RNA产量的影响。确定了最佳TiO2用量为2mg，乙醇的最佳用量为富集体系的1.5倍，孵育时间为5～10分钟；孵育温度为室温；TiO2粒径为5μm；

[0031] 上述提取方法中，所述洗脱RNA后，还需用0.1％HCl调节洗脱液pH至中性，并加DNaseⅠ处理去除DNA污染；

[0032] 上述所述缓冲液均使用DEPC处理水配制。

[0033] 本发明进一步优化了TiO2微球富集生物样本中外泌体的条件。其按照包括如下步骤的方法优化：

[0034] 取预处理后的生物样本与TiO2混合，4℃震荡孵育，使外泌体充分结合到TiO2微球上，清洗去除非特异性吸附，离心得到表面附有外泌体的TiO2微球，收集沉淀即可。

[0035] 上述提取方法中，考察了0.5mg TiO2分别富集不同体积(100μL、200μL、500μL)血清样本中的外泌体，以及不同TiO2用量(1mg，2mg，5mg，10mg)分别富集1mL血清中的外泌体，并通过蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)对外泌体特异性蛋白CD63进行表征和半量化；

[0036] 上述提取方法中，所述方法还包括洗脱外泌体用于形态和粒径表征的步骤，首先采用NaCl/Tris‑HCl(pH＝7.4)缓冲液洗涤上述沉淀，洗涤次数可为3～5次，具体可为5次，每次体积可为0.1mL～1mL，具体可为500μL。最后用洗脱液将所述吸附在TiO2表面的外泌体洗脱下来。

[0037] 上述提取方法中，所述洗涤步骤可使用120～160mM NaCl/Tris‑HCl(pH＝7.4)缓冲液，具体可为150mM；所述洗脱液可为8～10％(质量浓度)NH3·H2O，具体可为10％。

[0038] 本发明还考察了TiO2微球分步富集血清外泌体及exoRNA的效果。其按照包括如下步骤的方法优化：

[0039] TiO2微球与血清孵育，与上述“TiO2微球富集血清外泌体”步骤一致。将TiO2微球上附着的完整外泌体洗脱下来，用盐酸调节pH至中性，然后转移至30KD FASP超滤管中，清洗除去氨水并浓缩体积。将外泌体转移至离心管，与裂解/结合缓冲液、TiO2混合孵育，使外泌体释放RNA并与TiO2微球结合，加入洗脱液洗涤，离心收集上清，即得到exoRNA溶液。

[0040] 上述提取方法中，所述盐酸可为0.1～0.5M，具体可为0.1M；

[0041] 上述提取方法中，TiO2微球与血清之比为5mg：1mL；

[0042] 上述提取方法中，TiO2微球与血清外泌体之比为0.05mg：1mL。

[0043] 本发明提供一种外泌体及exoRNA串联富集鉴定的新策略。利用TiO2‑磷酸基团的特异性相互作用实现，将TiO2微球与生物样本共同孵育以捕获生物样本中的外泌体。经清洗去除非特异性吸附后，得到表面附有外泌体的TiO2，直接加入裂解/结合缓冲液，裂解外泌体以释放其内容物。继续孵育，使外泌体释放的RNA结合到TiO2上，经三轮清洗去除非特异性吸附，完成生物样本exoRNA的富集，最后加入洗脱液将RNA洗脱下来，离心收集上清液，即得exoRNA溶液。通过本发明能够快速高效地从生物样品中共同提取外泌体及exoRNA。

[0044] 与现有外泌体和exoRNA富集鉴定方法相比，本发明具有如下有益效果：

[0045] 1)本发明利用外泌体磷脂双分子层表面裸露的磷酸根/RNA磷酸基团与金属氧化物TiO2之间的螯合作用，结合静电吸附作用，实现外泌体及exoRNA的高特异性串联富集与鉴定。

[0046] 2)相较于酚提取法及柱提取法，本发明提取RNA的特异性更强，同时减少有毒有害试剂的使用，绿色环保；相较于试剂盒提取法，本发明成本低，更加适用于大队列样本中外泌体及exoRNA的富集鉴定。

[0047] 3)本发明中进一步优化了常量和微量细胞中基于TiO2的RNA提取方法，为不同样本量RNA的提取提供了新的选择；exoRNA富集的前提是特异性富集外泌体，因此本发明也优化了在串联富集时外泌体的最佳富集条件，与后续exoRNA的富集能更好的衔接，以此得到高质量、高纯度的exoRNA。

[0048] 4)本发明先利用TiO2特异性富集出外泌体，使用富集RNA的裂解液在线裂解外泌体后可直接串联富集得到exoRNA；TiO2与磷酸根间的螯合是可逆反应，其在酸性条件下结合，碱性条件解离；利用这一特点，可以快速、无损的回收释放RNA，更好应用于下游分析。

[0049] 5)生物样本外泌体生物来源样品量少，外泌体含量少，相应exoRNA丰度低。本发明操作简单，耗时短、成本低，相较于其他方法具有明显的优势。从外泌体富集，到exoRNA的释放，再到exoRNA的富集，整个过程仅需30min；同时裂解液中包含多种抑制RNase活性的成分，保证得到高质量exoRNA。附图说明

[0050] 图1为本发明TiO2串联富集血清外泌体及exoRNA的流程图。

[0051] 图2为在不同条件下富集5×106个HeLa细胞中的RNA(n＝3)。图2A为商业化试剂盒及不同用量的TiO2提取的RNA产量，对照组1：Ultrapure RNAKit，对照组2：miRNeasy Micro Kit。不同乙醇用量与TiO2结合(图2B)及不同孵育时间(图2C)时RNA的产量。

[0052] 图3为不同粒径TiO2微球、TiO2纤维富集得到的HeLa细胞(5×106)RNA。

[0053] 图4为不同方法提取的HeLa细胞(5×106)RNA的表征。Agilent 2100Bioanalyzer(RNA 6000Pico )和琼脂糖凝胶电泳分别对TiO2(A)、Ultrapure RNAKit(B)、miRNeasy Micro Kit(C)提取的RNA进行分析，Agilent 2100Bioanalyzer(Small RNAChips)对TiO2(D)、Ultrapure RNAKit(E)和miRNeasy Micro Kit(F)提取的RNA进行分析。

[0054] 图5为不同裂解/结合缓冲液用量(A)及不同TiO2用量(B)对HeLa细胞(1×105个)RNA产量的影响(n＝3)。

[0055] 图6为CD63蛋白的免疫印迹试验：(A)为0.5mg TiO2提取100μl(S100)、200μl(S200)、500μl(S500)血清中外泌体的CD63蛋白，(B)为10mg(S10)、5mg(S5)、2mg(S2)、1mg(S1)TiO2富集1mL血清中外泌体的CD63蛋白。

[0056] 图7为0.5mg TiO2串联富集0.5mL血清中的exoRNA产量(左)和2mg TiO2串联富集1mL血清中的exoRNA产量(右)(n＝3)。

[0057] 图8A为0.5mg TiO2富集500μL血清外泌体的TEM表征结果，图8B为0.5mg TiO2富集500μL血清外泌体的NTA表征结果。

[0058] 图9为人血清外泌体RNA(A)及外泌体miRNA(B)的种类分布。

[0059] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

[0060] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0061] 下述实施例中所用试剂尽可能使用RNase‑free的溶液，或者使用RNase‑free的溶剂(如DEPC处理的水)配制，所使用的材料尽可能使用RNase‑free规格，或者使用DEPC处理；如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0062] 实施例1、建立TiO2串联富集血清外泌体及exoRNA的新策略

[0063] 一、TiO2微球富集模型RNA

[0064] 首先将超纯RNA提取试剂盒提取的HeLa细胞RNA作为模型RNA样本，初步评估了TiO2在RNA富集中的可行性。使用3mg TiO2对30μg模型RNA进行富集回收。

[0065] 步骤1、模型RNA样本的提取

[0066] 使用超纯RNA提取试剂盒，Ultrapure RNAKit(康为世纪生物科技有限公司，6
CW0581S)提取HeLa细胞RNA作为模型RNA。首先将收集的细胞(约5×10 个)室温解冻，向解冻后的细胞中加入1mL TRIzon Reagent，裂解细胞样本，室温放置5min以分离蛋白核酸复合物；然后向离心管中加入200uL氯仿，剧烈摇晃15s，室温放置2min；4℃，12000rpm离心
10min，此时样品分为三层，将上层水相吸出，转移到一个新的RNase‑Free离心管中，RNA主要存在于水相溶液中；接着在水相溶液中加入相同体积的70％乙醇，上下颠倒混匀；将该溶液转移到已装入收集管的吸附柱(Spin Columns RM)中，直至全部转入；12000rpm离心20s，弃去收集管中的废液，重新将吸附柱放在收集管中；并向吸附柱中加入700μL Buffer RW1，
12000rpm离心20s，弃废液，重新将吸附柱放回收集管中；再向吸附柱中加入500μLBufferRW2，经12000rpm离心20s，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，并将该步骤重复一遍；12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于超净台，使柱中残留的乙醇彻底挥发；最后将吸附柱置于一个新的无RNase的离心管中，向柱中间加入30μL RNase‑Free Water，室温下放置1min，使RNase‑Free Water与柱上RNA充分接触，12000rpm离心1min后，收集RNA洗脱液。经NanoDrop定量，共提取到91.5μg RNA。

[0067] 步骤2、TiO2富集模型RNA

[0068] 称取3mg TiO2，分别使用洗脱缓冲液(20mM Tris‑EDTA，pH＝8.0)和裂解/结合缓冲液(3M异硫氰酸胍/2M盐酸胍/0.1％β‑巯基乙醇+10％乙二醇，pH＝4.1)清洗2次，去除杂质。将上述步骤1中Ultrapure RNAKit提取的HeLa细胞RNA作为模型RNA样本。取30μg模型RNA与200μL裂解/结合缓冲液、3mg TiO2混合。将该离心管于4℃震荡孵育10min使RNA充分结合到TiO2微球上，3000×g离心3min弃去上清液。分别使用500μL含60％、80％、90％乙醇的1M异硫氰酸胍溶液依次清洗TiO2沉淀以去除胍盐污染及非特异性结合成分。最后一次清洗后，6000×g离心3min，移去上清液。将离心管开盖置于超净台，使残留乙醇溶液挥发干净。最后加入20μL洗脱缓冲液，同时加入RNase抑制剂防止RNA发生降解，充分洗脱TiO2微球表面的RNA。经过6000×g离心3min后收集上清。结果经NanoDrop 2000测定，RNA回收率为36.2％，A260/A230＝2.05。EDTA购自北京化学试剂有限公司(HG3‑985‑76)；异硫氰酸胍购自中国北京兰博利德生物技术有限公司(593‑84‑0)；盐酸胍购自国药集团化学试剂有限公司(30095516)。

[0069] 二、TiO2富集常量HeLa细胞RNA的条件优化

[0070] 步骤1、考察TiO2用量对RNA产量的影响

[0071] 进一步使用TiO2微球富集HeLa细胞RNA，以证实TiO2对复杂生物样本中RNA富集的选择性和实用性。分别称取0.5mg、1mg、2mg、5mg、10mg TiO2微球，分别使用洗脱缓冲液和结6
合缓冲液润洗2次，去除杂质。在每份HeLa细胞(约5×10个)中各加入500μL裂解/结合缓冲液，移液枪吹打数次，裂解HeLa细胞，使其释放内容物。将TiO2微球分别转移至裂解后的细胞中，吹打混匀，随后将其置于室温，旋转孵育5min富集裂解液中的RNA，室温3000×g离心
3min，将TiO2微球沉淀至离心管底部，移除上清液。500μL含60％、80％、90％乙醇的1M异硫氰酸胍溶液各清洗沉淀一遍，每轮清洗均通过3000×g离心3min去除上清液。最后，加入50μL洗脱缓冲液，同时加入RNA酶抑制剂(中国北京兰博利德生物技术有限公司，R2000)，保证其在洗脱缓冲液中的终浓度为1U。置于室温旋转孵育5min，使TiO2微球上吸附的RNA释放。
室温6000×g离心3min收集上清液，加DNaseⅠ处理10min，即得到HeLa细胞RNA溶液，NanoDrop定量分析。结果如图2A所示，2mg和5mg TiO2用于HeLa细胞RNA富集时，分别可提取到27.83±1.03和26.67±1.31μg RNA。远低于商业化试剂盒miRNeasyMicro Kit(128.84±
5.36μg)和Ultrapure RNAKit(92.5±0.75μg)。说明TiO2可以捕获复杂生物样本中的RNA，但富集方法需要进一步的优化。

[0072] 步骤2、考察乙醇对RNA产量的影响

[0073] 上述条件下，暂将TiO2用量确定为2mg。由于乙醇沉淀RNA是从水相溶液中回收RNA的标准方法，可定量回收任意大小的RNA。因此在TiO2与HeLa细胞裂解液孵育后，分别考察了加入0倍(0μL)、1倍(500μL)、1.5倍(750μL)体积的100％乙醇对最终RNA产量的影响。此外，还设立了对照组：只用乙醇提取HeLa细胞RNA，除不加TiO2以外，其他条件均与TiO2微球富集HeLa细胞RNA保持一致，判断单独使用乙醇对RNA提取的效果。富集到的RNA溶液分别使用NanoDrop定量分析。结果如图2B所示，不添加乙醇及添1倍体积(500μL)乙醇时RNA的产量分别为29.6±9.3μg和83.5±8.73μg，而孵育后添加1.5倍体积(750μL)乙醇时，RNA产量提高最为显著(130.9±8.34μg)，比商业Ultrapure RNAKit提取的HeLa细胞RNA产量(92.5±0.75μg)高41.5％，比不加乙醇只用TiO2富集RNA时的产量(29.6±9.30μg)高342.2％，只用乙醇的对照组仅捕获到了65.6±13.82μg RNA，这一结果表明TiO2和乙醇在RNA的高效快速提取中均发挥着重要作用。

[0074] 步骤3、孵育时间对RNA产量的影响

[0075] 进一步对TiO2与HeLa细胞的孵育时间(1min、5min、10min、30min、1h)进行了考察。结果如图2C所示，孵育5min时，RNA产量为134.4±14.29μg，孵育10min时RNA的产量约为
128.8±4.16μg，明显优于其它孵育时间。因此，将TiO2富集HeLa细胞RNA的最佳孵育时间确定为5‑10min，具体为10min。

[0076] 步骤4、孵育温度对RNA产量的影响

[0077] 对TiO2与HeLa细胞RNA的孵育温度(室温，4℃)进行了考察。结果发现当TiO2富集提取HeLa细胞RNA的整个过程(包括孵育、洗脱和离心)均在室温环境中进行时，RNA产率比4℃环境富集RNA时提高13％。

[0078] 步骤5、优化上述条件后考察不同TiO2粒径对RNA产量的影响

[0079] 分别称取2mg不同粒径的TiO2微球及商业Titanium dioxide milled nanofibers(美国Sigma‑Aldrich，13463‑67‑7)，使用洗脱缓冲液和结合缓冲液各润洗2次，去除杂质。分别富集HeLa细胞RNA(该步骤富集过程与步骤1一致)。结果如图3所示，5μmTiO2微球富集RNA效果最佳。

[0080] 步骤6、对不同方法提取的HeLa细胞RNA进行表征

[0081] 分别使用TiO2富集方法(实验方法)、Ultrapure RNAKit(对照组1)以及miRNeasy Micro Kit(德国QIAGEN，217084)(对照组2)提取HeLa细胞RNA，将获得的RNA进行琼脂糖(美国Thermo Fisher Scientific,75510‑019)凝胶电泳。结果如图4A,B,C(右)所示，三种方法均有效地检测到18S和28S核糖体RNA条带，均未受到DNA的污染。TiO2与miRNeasy Micro Kit两种方法提取的RNA还存在一个小于150nt的低分子量RNA。进一步使用安捷伦2100生物分析仪对三种方法富集的HeLa细胞RNA进行分析。首先通过RNA 6000Pico 分别对TiO2、Ultrapure RNA Kit和miRNeasy Micro Kit提取的较大分子量范围(25‑4000nt)的RNA进行检测。结果如图4A,B,C(左)所示，三种方法均可提取18S和28S核糖体RNA。TiO2富集法获得的RNA，其RNA Integrity Number(RIN)值为9.6，28S/18S核糖体亚基的比值为2.0。Ultrapure RNAKit提取的RNA的RIN值为9.2，28S/18S核糖体亚基的比值为2.3，miRNeasy Micro Kit提取的RNA的RIN值为10，28S/18S核糖体亚基的比值为1.4。结果表明所提取的RNA的完整性较好，无降解发生。进一步使用Small RNA Chips考察了更小的RNA范围：20‑
150nt。结果如图4D，E，F所示，TiO2微球富集的HeLa细胞RNA的类型与Ultrapure RNAKit相似，但是RNA丰度不同。TiO2微球对小RNA的富集效果略优于Ultrapure RNAKit。miRNeasy Micro Kit(50)可获得更丰富的RNA种类，尺寸分布优于TiO2和商业Ultrapure RNAKit。此外，生物分析仪还量化了使用TiO2微球获得的总小RNA浓度为12127pg/μL，高于Ultrapure RNAKit(8061.2pg/μL)和miRNeasy Micro Kit(9372.5pg/μL)。基于TiO2微球富集的方法既可以富集高达4700nt的RNA，也可富集低于500nt的低分子量RNA。

[0082] 三、TiO2微球串联富集血清外泌体及exoRNA

[0083] 外泌体体积小且在生物体液中含量超低。从5×106个HeLa细胞中提取RNA的富集条件无法回收含量更低和分子量更小的exoRNA。因此，我们需要建立并优化血清外泌体及其RNA的最佳串联富集方法。优化过程主要考虑以下两点：第一，TiO2从血清中富集提取外泌体的最佳条件；第二，TiO2从血清外泌体中提取RNA的最佳条件。

[0084] 步骤1、优化TiO2富集微量HeLa细胞RNA的条件

[0085] 鉴于体液外泌体中RNA的丰度极低，改变不同实验条件对exoRNA进行富集时，获得的RNA产量变化幅度极小，难以检测，故很难确定富集条件的优化程度。因此，本发明首先对5
5μm TiO2微球富集微量HeLa细胞(1×10个)RNA的条件进行了优化。首先使用0.5mg TiO2富
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集1×10个HeLa细胞中的RNA，考察不同的裂解/结合缓冲液用量(50μL、100μL、200μL、400μL)对RNA产量的影响。结果如图5A所示，裂解/结合缓冲液的用量为100μL时，HeLa细胞的RNA产量(0.88±0.08μg)最佳。将清洗缓冲液和洗脱缓冲液的用量分别减少到200μL和20μL，发现提取的HeLa细胞RNA产量有所提高。进一步考察了不同的TiO2用量(0.01mg、0.05mg、
0.25mg、1mg)对HeLa细胞RNA产量的影响，使用100μL裂解/结合缓冲液，200μL清洗缓冲液，
20μL洗脱缓冲液，其它富集步骤与上述方法一致。结果如图5B所示，0.05mg TiO2提取的HeLa细胞RNA产量(1.92±0.64μg)比0.5mg TiO2提取的HeLa细胞RNA产量(0.88±0.08μg)提高118.2％。这一结果表明过量的TiO2可能影响了微量RNA的充分洗脱，或者造成了较大的空间位阻，影响RNA从TiO2中的释放。此外，过量的裂解/结合缓冲液使微量的RNA分散在较大体系中，降低了与TiO2结合的效率，无法富集到更多的RNA。

[0086] 步骤2、考察血清外泌体的最佳富集条件

[0087] 1)考察富集血清外泌体的最佳血清用量

[0088] 在TiO2串联富集血清外泌体及RNA的策略中，外泌体的富集效率及完整性也会对RNA的产量造成直接影响。通过蛋白质免疫印迹实验对TiO2富集的血清外泌体特异性蛋白CD63进行半定量研究，从而对TiO2微球富集获得的血清外泌体进行相对量。我们将不同体积(100μL、200μL、500μL)的血清样本分别与0.5mg TiO2共同孵育，富集血清外泌体。PBS清洗后，得到附着有外泌体的TiO2微球，直接加入裂解液(8M UA)裂解外泌体使蛋白质释放。SDS‑PAGE对外泌体中的蛋白质进行分离后，通过Western Blot对所富集的外泌体标志性蛋白CD63进行表征。结果如图6A所示，0.5mg TiO2并没有从100μL和200μL人血清中富集到足够的外泌体。0.5mg TiO2从500μL血清中富集的外泌体，其标志性蛋白CD63呈现出微弱的条带，提示0.5mg TiO2不是富集外泌体的最佳用量。

[0089] 2)考察富集血清外泌体的最佳TiO2用量

[0090] 增加TiO2用量至1mg，2mg，5mg，10mg后，分别富集1mL血清中的外泌体。通过Western Blot对所富集的外泌体标志性蛋白CD63进行表征。通过image J软件对外泌体特异性蛋白CD63条带进行灰度定量。结果如图6B所示，5mg TiO2提取得到的外泌体蛋白CD63最多，其次为2mg TiO2。然而，根据上述步骤1“TiO2微球富集微量HeLa细胞RNA”的结果发现，当细胞越少时，TiO2用量也相应减少，RNA的产量才更高。过量的TiO2会影响RNA的释放。因此，尽管5mg TiO2为富集1mL血清外泌体的最佳TiO2用量，但并非是富集1mL血清exoRNA的最佳TiO2用量。

[0091] 步骤3、TiO2分步富集血清外泌体及exoRNA

[0092] 综合上述实验结果，富集1mL血清外泌体的TiO2用量及富集1mL血清外泌体中RNA的最佳TiO2用量差异较大，无法在最佳富集条件下实现外泌体与RNA的串联富集。因此，我们使用了TiO2微球分步富集血清外泌体及RNA，首先使用5mg TiO2富集血清外泌体，之后将完整外泌体洗脱下来，再用0.05mg TiO2富集该外泌体中的RNA。结果未鉴定到RNA浓度。可能由于实验步骤过于繁琐导致了外泌体的损失。

[0093] 步骤4、TiO2串联富集血清外泌体及exoRNA

[0094] 鉴于以上实验结果，考虑将TiO2用量中和，使其在外泌体富集和RNA富集之间达到相对平衡。共设立了两个实验组：0.5mg TiO2串联富集500μL血清外泌体，2mg TiO2串联富集1000μL血清外泌体。

[0095] 1)血清样本预处理

[0096] 取适量血清，分别在4℃条件下，经3000×g离心30分钟，12000×g离心30分钟后，收集上清，即为预处理后的血清样本。

[0097] 2)血清样本中的外泌体提取

[0098] 取0.5mL和1mL上述预处理后的血清样本，分别与0.5mg和2mg TiO2混合，于4℃中震荡孵育5min，使血清外泌体充分结合到TiO2微球上。用200μL 150mM NaCl/Tris‑HCl(pH＝7.4)缓冲液清洗3次去除非特异性吸附，3轮清洗后，得到表面附有外泌体的TiO2微球。

[0099] 3)TiO2富集血清exoRNA

[0100] 在上述附有外泌体的TiO2微球中加入50μL 3M异硫氰酸胍/2M盐酸胍/0.1％β‑巯基乙醇/10％乙二醇，吹打混匀，裂解外泌体使其释放RNA，并使释放的RNA与TiO2微球充分结合，加入75μL乙醇，颠倒混匀，进一步沉淀析出溶液中的RNA，更利于与TiO2微球结合。低速离心弃去上清液。三轮清洗液(依次为200μL含60％、80％、90％乙醇的1M异硫氰酸胍溶液)洗涤沉淀，去除盐酸胍、异硫氰酸胍及蛋白质污染。低速离心弃上清后，将沉淀部分置于超净台挥发残留乙醇。加入洗脱液(20μL的20mM Tris‑EDTA(pH＝8.0))和适量RNA酶抑制剂洗脱RNA，收集RNA溶液，立即用0.1％盐酸溶液将RNA洗脱液pH调节至中性，避免碱性条件下RNA的降解，DNase I(美国New England Biolabs,M0303)去除RNA溶液中的DNA污染，实现血清外泌体及RNA的串联富集。结果如图7所示，0.5mg TiO2可从500μL血清中提取到64.53±3.41ng exoRNA，2mg TiO2可从1mL血清中提取到59.98±1.56ng exoRNA。在等量血清中，
0.5mg TiO2富集的exoRNA的产量约为2mg TiO2时的2.2倍，进一步证明TiO2过量对RNA释放的影响较大。

[0101] 步骤5、血清外泌体表征

[0102] 为进一步证明TiO2所富集的RNA为exoRNA，实验还对0.5mg TiO2在0.5mL血清中提取的外泌体进行了形态和粒径表征。使用0.5mg TiO2富集500μL血清外泌体后，利用碱性条件下TiO2与磷酸基团的特异性相互作用会被破坏的原理，使用10％NH3·H2O洗脱0.5mg TiO2微球表面粘附的外泌体。分别使用透射电镜(TEM)和纳米颗粒跟踪分析(NTA)仪对外泌体进行表征。TEM结果如图8A所示，外泌体在透射电镜下的形态呈典型的“茶托状”囊泡结构，外泌体粒径约50‑200nm，背景干净，没有杂质。然后通过纳米颗粒跟踪分析仪分析外泌体的粒径，平均粒径约为185.3±2.4nm，如图8B，符合外泌体粒径分布范围30‑200nm。

[0103] 步骤6、Small RNA测序和数据分析

[0104] 将获得的RNA样本，在Illumina NextSeq2000平台上对文库进行测序，共得到53521328个读数，通过接头过滤，质量过滤，得到25762859个读数，再依次与NCBI(ribosome RNA)、UCSC tRNA(tRNA)、mirbase(miRNA及pre‑miRNA)、ENSEMBL(human genome reference)几个数据库进行比对。匹配结果图9A所示，TiO2串联提取血清外泌体及exoRNA的方法提取到包括非编码RNA，microRNA，mRNA，核糖体RNA，tRNA在内的多种exoRNA。血清外泌体中丰度较高的miRNA种类分布如图9B所示。TiO2串联富集方法可从500μL血清外泌体中鉴定到2137902个读数，其中包括48308个非编码RNA，22062个pseudogene，70713个miRNA，
1969490个mRNA，6347个核糖体RNA，9463个TEC，11519个tRNA。

[0105] 以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。