[0001] 本发明属于DNA提取技术领域，尤其涉及一种低微生物量组织样品中微生物DNA的提取方法及其应用。

[0002] 微生物的起源可以追溯到3.7亿年以前，他们的进化及多样化远远早于动物。自前寒武纪以来，微生物在塑造我们的星球方面就发挥了关键作用。我们生活在一个微生物的世界，微生物促进了人类的起源和进化。微生物存在于人类所有与外界相通的器官中，包括皮肤、眼睛、鼻腔、口腔、肺、生殖道和泌尿道，且其在胃肠道中具有最庞大的密度和多样性。肠道微生物组，作为人类组成的功能性和非消耗性部分，在人类健康和疾病中发挥着重要作用。肠道微生物参与人体多种生理过程，包括神经发育、免疫、消化及代谢。然而近期有多项研究结果表明，除肠道微生物外，还有其它生态位的微生物也参与了人体免疫系统和疾病的发展。

[0003] 肿瘤微环境是一个对微生物极具吸引力的生态位。大约一个世纪以前，托马斯‑格罗弗宣称细菌可以从肿瘤中分离出来，细菌疫苗对肿瘤有效。然而，格罗弗的研究结果并不能被其他研究人员所重复，其提出的癌症细菌学说被拒绝。经过几十年的研究与探索，Nejman等人在人体癌组织细胞内发现了细菌(Nejman,D.et al.The human tumor 
microbiome is composed of tumor type‑specific intracellular bacteria.Science 
368,973‑980,doi:10.1126/science.aay9189(2020).)，癌症细菌学说再次兴起。尽管瘤内微生物的最终作用仍未完全确定，但随着下一代测序技术的进步与发展，获得全面的瘤内微生物群多样性和功能性描述的谱图已成为可能。

[0004] 除肿瘤外，微生物还存在于其它未与外环境直接相通的肠外组织中。有研究发现，共生菌可以越过肠道屏障，进入肠系膜淋巴结和肝脏，而肝脏则作为进一步的“防火墙”控制细菌的全身传播(Macpherson,A.J.&Uhr,T.Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria.Science 303,1662‑1665,doi:10.1126/science.1091334(2004).；Balmer,M.L.et al.The Liver May Act as a 
Firewall Mediating Mutualism Between the Host and Its Gut Commensal 
Microbiota.Science Translational Medicine 6,237ra266‑237ra266,doi:doi:
10.1126/scitranslmed.3008618(2014).；Spadoni,I.et al.A gut‑vascular barrier controls the systemic dissemination ofbacteria.Science350,830‑834,doi:doi:
10.1126/science.aad0135(2015))。有人提出这种机制只在人体发生肠道或血管病变、先天性免疫功能缺失、或化疗时出现(Fung,T.C.et al.Lymphoid‑Tissue‑Resident 
Commensal Bacteria Promote Members of the IL‑10 Cytokine Family to Establish Mutualism.Immunity 44,634‑646,doi:10.1016/j.immuni.2016.02.019(2016).；Slack,E.et al.Innate and adaptive immunity cooperate flexibly to maintain host‑
microbiota mutualism.Science 325,617‑620,doi:10.1126/science.1172747(2009).；
Sonnenberg,G.F.et al.Innate lymphoid cells promote anatomical containment of lymphoid‑resident commensal bacteria.Science 336,1321‑1325,doi:10.1126/
science.1222551(2012).)。S.Manfredo等人在患有自身免疫疾病的小鼠的肠系膜淋巴结和肝脏中检测到了Enterococcus gallinarum特异性DNA，而在健康小鼠中未检测到
(Manfredo Vieira,S.et al.Translocation of a gut pathobiont drives 
autoimmunity in mice and humans.Science 359,1156‑1161,doi:10.1126/
science.aar7201(2018).)。然而，最新研究提出，特定种类的共生菌可能存在于健康哺乳动物的胃肠道相关淋巴组织中(Fung,T.C.et al.Lymphoid‑Tissue‑Resident Commensal Bacteria Promote  Members of  the IL‑10Cytokine  Family to Establish 
Mutualism.Immunity 44,634‑646,doi:10.1016/j.immuni.2016.02.019(2016).)。

[0005] 目前，动物组织微生物图谱尚不清晰，破译动物组织微生物群将有助于识别宿主和细菌之间的分子串扰，但是尚缺少一种能够有效的从低微生物量组织样品中提取微生物DNA的方法。

[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种低微生物量组织样品中微生物DNA的提取方法及其应用。

[0007] 本发明提供了一种低微生物量组织样品中微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：

[0008] 1)将组织样品与裂解液混合、研磨后，用蛋白酶K处理，获得裂解后的组织液；

[0009] 2)将所述裂解后的组织液用RNA酶处理后，进行第一离心，收集第一上清液；

[0010] 3)将所述第一上清液与缓冲液SP混合进行第二离心，收集上清，获得第二上清液；

[0011] 4)将所述第二上清液与氯仿混合进行第三离心，收集上清，获得第三上清液；

[0012] 5)将乙醇与所述第三上清液混合，获得沉淀，漂洗所述沉淀获得包括微生物DNA的DNA提取产物。

[0013] 优选的，所述组织样品为动物组织样品。

[0014] 优选的，步骤1)所述组织样品与裂解液混合的比例为10～40g：150～250μL；所述研磨通过钢珠实现。

[0015] 优选的，所述第一离心、第二离心的转速独立为10000～14000rpm，所述第一离心、第二离心的时间独立为2～4min。

[0016] 优选的，所述第三离心的转速独立为10000～14000rpm，所述第三离心的时间4～6min。

[0017] 优选的，所述第二上清液与氯仿混合的体积比例为(3～4)：2。

[0018] 优选的，步骤1)所述蛋白酶K的浓度为8～12mg/mL，所述蛋白酶K处理的温度为53～57℃，所述蛋白酶K处理的时间为2.5～3.5h。

[0019] 优选的，所述RNA酶的浓度为8～12mg/mL，所述RNA酶的处理时间为8～12min。

[0020] 优选的，步骤5)所述乙醇为无水乙醇，漂洗所述沉淀用试剂为70～80％v/v的乙醇溶液。

[0021] 本发明还提供了所述的提取方法在研究组织微生物与动物健康中的应用。

[0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明所述方法能够实现有效的提取低微生物量样品组织中的微生物DNA，利用本发明所述的提取方法提取了健康小鼠各个组织(四头肌、股骨、性腺器官、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、胸腺、心脏、肺、脑)的微生物基因组DNA。同时通过PCR定性及qPCR定量手段证明了小鼠各内部实体组织中存在细菌DNA，其载量4
约为每mg组织含10个16S rRNA基因拷贝。本发明研究结果表明微生物不仅存在于肠道中，还存在于健康小鼠各个未与外界直接相通的组织器官中，为探究组织微生物在动物健康与疾病中的作用奠定了基础，为发现并设计靶向疾病的新型生物标志物提高了可能性。
附图说明

[0023] 图1为小鼠组织DNA PCR琼脂糖凝胶电泳图，泳道从左至右依次为1：四头肌；2：股骨；3：性腺器官；4：脾脏；5：胰腺；6：肾脏；7：肝脏；8：胸腺；M：Marker；9：心脏；10：肺；11：脑；12：盲肠粪便；C1：操作处理阴性对照；C2：背景阴性对照；右侧图示为Marker标准条带。

[0024] 图2为qPCR定量标准曲线，其中，X轴为每μL溶液中含有细菌16S rRNA基因拷贝数，Y轴为扩增循环阈值，用GraphPad Prism 9.0做线性分析并拟合曲线。

[0025] 图3为小鼠组织16S rRNA基因拷贝数，图示展示了每mg样品所含细菌16S rRNA基因拷贝数，从左至右依次为四头肌(Quadriceps muscle)、股骨(Femur)、性腺器官
(Reproductive organ)、脾脏(Spleen)、胰腺(Pancreas)、肾脏(Kidney)、肝脏(Liver)、胸腺(Thymus)、心脏(Heart)、肺(Lung)、脑(Brain)、盲肠粪便(Cecal faeces)、操作处理阴性对照组(Negative control)、qPCR背景阴性对照组(qPCR‑water)。

[0026] 本发明提供了一种低微生物量组织样品中微生物DNA的提取方法，包括以下步骤：1)将组织样品与裂解液混合、研磨后，用蛋白酶K处理，获得裂解后的组织液；2)将所述裂解后的组织液用RNA酶处理后，进行第一离心，收集第一上清液；3)将所述第一上清液与缓冲液SP混合进行第二离心，收集上清，获得第二上清液；4)将所述第二上清液与氯仿混合进行第三离心，收集上清，获得第三上清液；5)将乙醇与所述第三上清液混合，获得沉淀，漂洗所述沉淀获得包括微生物DNA的DNA提取产物。

[0027] 在本发明中，将组织样品与裂解液混合、研磨后，用蛋白酶K处理，获得裂解后的组织液。在本发明中，所述组织样品优选为动物组织样品，进一步优选为人或小鼠组织样品，在本发明的一个具体实施过程中，所述组织样品包括四头肌、股骨、性腺器官(卵巢、输卵管、睾丸和附睾)、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、胸腺、心脏、肺、脑。在本发明中，所述裂解液优选为市售的组织裂解液，进一步优选为购自北京索莱宝科技有限公司的裂解液BufferA，货号D1700。在本发明中，所述组织样品与裂解液混合的比例优选为10～40mg：150～250μL，更优选为20～30mg：180～220μL；在本发明中，所述研磨优选的通过钢珠实现，具体的将钢珠置于混合液中进行研磨；所述钢珠的直径优选为3mm；在本发明中，所述研磨的频率优选为25～35Hz，更优选为28～32Hz，最优选为30Hz；每一次研磨的时间优选为20～40s，更优选为25～35s，最优选为30s；所述研磨的次数优选为2～4次，更优选为3次；在本发明具体实施过程中，所述研磨采用高通量组织研磨仪(Xinyi‑48，宁波新艺超声设备有限公司)实现；所述研磨的作用是使组织DNA充分释放。

[0028] 在本发明中，所述蛋白酶K的浓度优选为8～12mg/mL，更优选为9～11mg/mL；所述蛋白酶K处理的温度优选为53～57℃，更优选为54～56℃；所述蛋白酶K处理的时间优选为2.5～3.5h，更优选为2.8～3.2h。在本发明中，所述蛋白酶K处理优选的在水浴锅中进行，所述蛋白酶K处理的作用是使与蛋白质结合的DNA进一步释放。

[0029] 在本发明中，将所述裂解后的组织液用RNA酶处理后，进行第一离心，收集第一上清液。在本发明中，所述RNA酶的浓度优选为8～12mg/mL，更优选为9～11mg/mL，所述RNA酶的处理时间优选为8～12min，更优选为9～11min；所述RNA酶处理优选为静置处理，所述RNA处理的作用为使RNA降解，减少RNA对后续实验的影响。在本发明中，所述第一离心的转速优选为10000～14000rpm，更优选为11000～13000rpm，所述第一离心的时间优选为2～4min，更优选为3min。本发明对所述第一离心的温度没有特殊要求，室温即可。在本发明中，所述第一离心的目的是使残留组织碎片沉积；在本发明中，优选的采用移液枪吸取的方式收集第一上清液。

[0030] 本发明获得所述第一上清液后，将所述第一上清液与缓冲液SP混合进行第二离心，收集上清，获得第二上清液。在本发明中，所述缓冲液SP优选的购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号为B518233；所述第一上清液与缓冲液SP混合的体积比优选为1：
(0.8～1.2)，更优选为1:1；在本发明中，所述沉淀优选的在冰浴中进行，所述沉淀的时间优选为8～12min，更进一步优选为9～11min。在本发明中，所述缓冲液SP的目的是去除蛋白等杂质，减轻PCR抑制效果。在本发明中，所述第二离心的转速优选为10000～14000rpm，更优选为11000～13000rpm，所述第二离心的时间优选为2～4min，更优选为3min。本发明对所述第二离心的温度没有特殊要求，室温即可。

[0031] 本发明在获得所述第二上清液后，将所述第二上清液与氯仿混合进行第三离心，收集上清，获得第三上清液。在本发明中，所述第二上清液与氯仿混合的体积比例为优选为2～4：2，更优选为2.5～3.5:2。在本发明中，第二上清液与氯仿混合的作用为再次除去样品中的PCR抑制因子。在本发明中，所述第三离心的转速优选为10000～14000rpm，更优选为
11000～13000rpm，所述第三离心的时间优选为4～6min，更优选为5min。本发明对所述第三离心的温度没有特殊要求，室温即可。

[0032] 本发明在获得所述第三上清液后，将乙醇与所述第三上清液混合，获得沉淀，即为包括微生物DNA的DNA提取产物。在本发明中，所述乙醇优选为无水乙醇，在本发明中，所述乙醇与第三上清液混合后，优选的上下颠倒5～8次使之充分混匀，载室温放置2～3min；然后收集沉淀；收集沉淀优选的采用离心的方式，所述离心的转速优选为9000～11000rpm，更优选为9500～10500rpm；所述离心的时间优选为4～6min，更优选为5min；本发明在所述离心后弃上清，收集沉淀。本发明在获得沉淀后，优选的还包括漂洗沉淀的步骤，漂洗沉淀用试剂优选为70～80％v/v的乙醇溶液，更优选为72～78％v/v的乙醇溶液；所述漂洗的时间为1～3min；所述漂洗后还包括离心的步骤，所述离心的转速优选为9000～11000rpm，更优选为9500～10500rpm；所述离心的时间优选为1～3min，更优选为2min；所述离心后弃上清；所述漂洗优选的进行1～3次，更优选的进行两次。本发明在所述离心后优选的倒置5～
10min挥发乙醇，获得DNA。在本发明中，提取获得的DNA优选的溶于无菌水中，并测定其浓度及质量。在本发明中，所述DNA提取液优选的保存‑20℃直至进一步处理。

[0033] 本发明还提供了所述的提取方法在研究组织微生物与动物健康中的应用。利用本发明所述方法提取获得的组织样品中的微生物基因组DNA，揭示动物组织微生物的全身性分布，能够有助于识别宿主和细菌之间的分子串，从而为理解稳态和病理机制以及确定新的治疗策略奠定基础。

[0034] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0035] 实施例1

[0036] 样品采集

[0037] 本试验所用CD‑1(ICR)小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK(京)2016‑0006)，小鼠饲养于SPF级实验动物中心。小鼠饲养条件为：室温25±2℃，湿度50±5％，光暗周期12/12h，独立通气笼饲养，5只/盒，所有小鼠自由走动、进食和饮水。选择8周龄小鼠用于试验，包括两只雌性小鼠、两只雄性小鼠。小鼠购入后立即断颈处死，用
75％v/v乙醇溶液擦拭全身，于超净工作台中解剖。取四头肌、股骨、性腺器官(雌鼠取卵巢和输卵管；雄鼠取睾丸和附睾)、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、胸腺、心脏、肺、脑共11项组织，将各个组织放入无菌研磨管中，液氮速冻后迅速转移至‑80℃冰箱保存直至进一步处理。解剖过程中于解剖台旁设无菌处理的开盖研磨管(内含100μL无菌水)作阴性对照，同时取盲肠粪便作阳性对照。所有样品取材时一式四份。

[0038] 小鼠组织DNA提取

[0039] 小鼠组织属于低微生物量样品，其中含有大量PCR抑制因子，如肌肉中的肌红蛋白、胶原蛋白，肾脏中的免疫球蛋白等，使得DNA提取质量下降，影响后续实验进展。本发明开发了一种有效的低微生物量组织DNA提取方法，同时最大程度的规避操作过程中可能存在的微生物污染，以便进行后续的PCR定性及qPCR定量实验。

[0040] 称取组织样品25mg，加入200μL裂解液Buffer A(D1700，北京索莱宝科技有限公司)及一颗3mm钢珠，于30Hz研磨30s重复3次，使组织DNA充分释放。随后加入20μL 10mg/mL蛋白酶K(P816054，上海麦克林生化科技有限公司)于55℃水浴锅中水浴3h，使那些与蛋白质结合的DNA进一步释放。再加入10μL 10mg/mL Rnase A(9001‑99‑4，北京酷来搏科技有限公司)静置10min，使RNA降解以便减少对后续实验的影响。

[0041] 各组织DNA充分释放后，通过多次不同条件下离心操作纯化组织DNA。首先样品于12,000rpm下室温离心3min，使残留组织碎片沉积；随后吸取含组织DNA的上清液200～300μL至干净的离心管中，并加入等体积Buffer SP(B518233，生工生物工程(上海)股份有限公司)冰浴10min，用以沉淀蛋白等杂质减轻PCR抑制效果；再次12,000rpm下室温离心3min并转移上清至干净离心管中；接着各样品分别加入200μL氯仿，充分混匀后12,000rpm离心
5min，再次除去样品中的PCR抑制因子。最后吸取上层水相至干净的离心管中，用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，颠倒5～8次使之充分混匀，室温放置2～3min；室温10,000rpm离心5min，弃上清。再加入1ml的75％v/v乙醇溶液漂洗DNA沉淀，然后室温10,000rpm离心5min，弃上清，再重复上述漂洗步骤一次，进而获得纯净的组织DNA样品，溶于100μL的ddH2O。

[0042] 提取的DNA溶于100μL无菌水中并用分光光度计(NanoDrop2000，赛默飞世尔科技公司)测定其浓度及质量。解剖时设的阴性对照同样重复以上操作。实验所用所有试剂(除氯仿)均经过0.22μm滤膜做滤菌处理，所有开盖操作均在无菌操作台中完成。DNA提取液存于‑20℃直至进一步处理。

[0043] 小鼠组织微生物PCR定性

[0044] 利用PCR技术辅助琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠组织中是否存在微生物DNA。用引物F(5′‑TCCTACGGGAGGCAGCAGT‑3′，SEQ ID NO.1)和R(5′‑GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT‑3′，SEQ  ID NO.1)扩增细菌16S  rRNA基因的V3‑V4区。在ABI  9700 PCR仪(Applied 
Biosystems,Inc.,USA)上进行扩增。PCR扩增体系为：2xTaq Plus MasterMix 12.5μL
(P211，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，引物(5μM)各1μL，2ng/μL BSA 3μL(9048‑46‑
8，上海麦克林生化科技有限公司)，上一步骤提取获得的模板DNA 30ng，加ddH2O至25μL。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃终延伸7min。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，电泳条件为170V，30min。
每次实验同时补充以无菌水为模板的背景阴性对照组。

[0045] 小鼠组织微生物qPCR定量

[0046] 用已知浓度的含有单拷贝大肠杆菌16S rRNA基因(1542bp)的pKMV质粒做标准品8 7 6 5
(于北京六合华大基因科技有限公司合成)，分别以浓度为1×10、1×10 、1×10、1×10 、1
4 3 2 1 0
×10、1×10、1×10、1×10 、1×10靶标基因拷贝数/μL的稀释液为模板进行qPCR定量实
验，根据扩增循环阈值(Cycle threshold，Ct)构建qPCR定量标准曲线。用GraphPad Prism 
9.0做线性分析并拟合曲线。使用针对细菌16S rRNA基因V3‑V4区的引物对样品进行qPCR定量：上游引物F  5 ′‑TCCTACGGGAGGCAGCAGT‑3′，下游引物R  5 ′‑
GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT‑3′。qPCR反应体系为：TaqPro Universal SYBR qPCR 
Master Mix 10μL，引物(10μM)各0.4μL，加模板溶液至20μL。qPCR反应程序为：95℃30s；95℃10s、60℃30s，40个循环；随后体系从65℃升温至95℃，绘制熔解曲线用以评估qPCR产物特异性。使用SYBR qPCR(Q712，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)技术在实时定量PCR仪(CFX96，Bio‑Rad)上进行四次重复。用Bio‑Rad CFX Manager 3.1(Hercules，CA，USA)分析qPCR数据。

[0047] 按上述体系对样品DNA做16S rRNA基因拷贝的qPCR定量实验，其中样品DNA稀释100倍至1～30ng/μL(其中，四头肌、股骨、胸腺、心脏、肺、脑的基因组DNA稀释至1～10ng/μL，性腺器官、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏的基因组DNA浓度稀释至10～30ng/μL)后作为模板进行qPCR。以上述标准曲线为依据计算得到DNA提取液中细菌16S rRNA基因拷贝数量，并根据质量换算得到每mg样品中细菌16S rRNA基因拷贝数量。每次实验同时补充以无菌水为模板的背景阴性对照组。每个样品重复四次测定。

[0048] 数据分析

[0049] 数据比较时分别用Shapiro‑Wilk检验和Bartlett's检验来检查数据分布的正态性和方差齐性。若数据正态分布且方差齐，则采用单因素方差分析(one‑way analysis of variance,ANOVA)及Tukey事后检验以评估组间差异的统计学意义。当数据非正态分布或非方差齐时，采用Kruskal‑Wallis检验和Tukey事后检验对数据进行分析。P<0.05为差异显著。所有统计分析均采用SPSS 26进行。

[0050] 实验结果

[0051] DNA样品质量检测

[0052] 共提取了4只小鼠11组器官(四头肌、股骨、性腺器官、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、胸腺、心脏、肺、脑)的基因组DNA，一式四份(n＝4*11*4)。同时包括阳性对照组盲肠粪便(n＝4*4)、操作处理阴性对照组(n＝4*4)。用分光光度计(NanoDrop2000，赛默飞世尔科技公司)测定DNA样品浓度及质量，其中四头肌、股骨、胸腺、心脏、肺、脑的基因组DNA浓度约为100～
1000ng/μL，性腺器官、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏的基因组DNA浓度约为1000～3000ng/μL，而阳性对照盲肠粪便的基因组DNA浓度约为200ng/μL，阴性对照组DNA浓度接近0ng/μL。这表明组织中DNA被充分释放，DNA提取效果较好，且DNA提取过程中污染控制较为有效。此外，除阴性对照外，所有样品的OD260/OD230在2.0～2.2，OD260/OD280接近1.8。这表明，DNA样品中及DNA提取液所引入的蛋白质、苯酚、乙醇、氯仿、NaCl等杂质在DNA纯化过程中被除去。体现了DNA提取及纯化过程的高效性。

[0053] 组织微生物PCR定性

[0054] 将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪得到如下胶图(图1)。PCR检测使用引物F和R扩增细菌16S rRNA V3‑V4可变区，不同菌种的V3‑V4区大小在478bp左右。图1中展示了一只SPF级雌性CD‑1(ICR)小鼠各个组织DNA 16S rRNA V3‑V4区PCR扩增结果。琼脂糖凝胶电泳图泳道从左至右依次为1：四头肌；2：股骨；3：性腺器官；4：脾脏；5：胰腺；6：肾脏；7：肝脏；8：胸腺；M：Marker；9：心脏；10：肺；11：脑；12：盲肠粪便；C1：操作处理阴性对照；C2：背景阴性对照。右侧图示为Marker标准条带。图1中操作处理阴性对照组和背景阴性对照组均无明显条带，说明了DNA提取过程中污染控制的有效性。粪便阳性对照条带在
500bp左右，符合一般细菌V3‑V4区大小。各个组织中均有符合要求的目标条带，但其亮度远低于粪便组，这体现了小鼠组织的低微生物量性。PCR结果表明，健康小鼠的四头肌、股骨、性腺器官、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、胸腺、心脏、肺、脑组织中均存在微生物DNA，其负荷量远低于肠道微生物。

[0055] 组织微生物qPCR定量

[0056] 通过梯度稀释的标准质粒模板构建细菌16S rRNA基因拷贝数qPCR定量体系的标准曲线(图2)。图2中X轴为每μL溶液中含有细菌16S rRNA基因拷贝数，Y轴为扩增循环阈值；
2
细菌16S rRNA基因拷贝数标准曲线公式为Y＝‑3.3003^X+35.511，R ＝0.9967，扩增效率为
100.92％，检测灵敏度为每个qPCR反应体系最低检出27个细菌16S rRNA基因拷贝。

[0057] 小鼠各组织细菌qPCR定量结果见图3，图3展示了每mg样品所含细菌16S rRNA基因拷贝数。从左至右依次为四头肌(Quadriceps muscle)、股骨(Femur)、性腺器官(Reproductive organ)、脾脏(Spleen)、胰腺(Pancreas)、肾脏(Kidney)、肝脏(Liver)、胸腺(Thymus)、心脏(Heart)、肺(Lung)、脑(Brain)、盲肠粪便(Cecal faeces)、操作处理阴性对照组(Negative control)、qPCR背景阴性对照组(qPCR‑water)。

[0058] 操作处理阴性对照组、qPCR背景阴性对照组中每mg样品细菌16S rRNA基因拷贝数1 4
约为10，而组织组中细菌16S rRNA基因拷贝数约为10 ，是对照组的3倍以上。这表明样品污染对组织细菌定量检测的影响很小，再次说明了实验操作时污染控制的有效性。盲肠粪便
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(阳性对照组)每mg样品细菌16S rRNA基因拷贝数约为10 ，远高于组织组，这与PCR扩增条带结果一致，即组织微生物负荷量远低于肠道微生物。此外，各个组织组之间细菌16S rRNA基因拷贝数无显著性差异(P>0.05，ANOVA)，这表明小鼠内部实体组织的细菌载量较为相
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近。F.Anhê等人报道异常肥胖患者肝脏组织的细菌16S rRNA基因拷贝数在10左右(Anhê,
F.F.et al.Type 2diabetes influences bacterial tissue compartmentalisation in human obesity.Nature Metabolism 2,233‑242(2020).)，与本研究中小鼠肝脏组织细菌载量基本一致。体现了以小鼠作为模式生物研究其组织微生物对调查人类全面微生物组的指导与借鉴意义。

[0059] 由上述实施例可知，本发明提供的有效的低微生物量组织DNA提取方法能够实现提取组织中微生物DNA的目的，本发明利用这种技术提取了健康小鼠各个组织(四头肌、股骨、性腺器官、脾脏、胰腺、肾脏、肝脏、胸腺、心脏、肺、脑)的基因组DNA。同时通过PCR定性及
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qPCR定量手段证明了小鼠各内部实体组织中存在细菌DNA，其载量约为每mg组织含10 个
16S rRNA基因拷贝。本发明的实验结果表明微生物不仅存在于肠道中，还存在于健康小鼠各个未与外界直接相通的组织器官中，为探究组织微生物在人类健康与疾病中的作用奠定了基础，为发现并设计靶向疾病的新型生物标志物提高了可能性。

[0060] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。