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一种提取土壤宏基因组DNA的方法及其应用

热词 离心 dna 混匀 磁力 溶液 土壤 裂解 样品 漂洗 涡旋
专利类型 发明公开 法律事件 公开; 实质审查;
专利有效性 实质审查 当前状态 实质审查
申请号 CN202310259870.X 申请日 2023-03-17
公开(公告)号 CN116144647A 公开(公告)日 2023-05-23
申请人 上海美吉生物医药科技有限公司; 申请人类型 企业
发明人 梁婷婷; 董亚晨; 第一发明人 梁婷婷
权利人 上海美吉生物医药科技有限公司 权利人类型 企业
当前权利人 上海美吉生物医药科技有限公司 当前权利人类型 企业
省份 当前专利权人所在省份:上海市 城市 当前专利权人所在城市:上海市浦东新区
具体地址 当前专利权人所在详细地址:上海市浦东新区康新公路3399弄3号 邮编 当前专利权人邮编:201321
主IPC国际分类 C12N15/10 所有IPC国际分类 C12N15/10C12Q1/6806
专利引用数量 0 专利被引用数量 0
专利权利要求数量 10 专利文献类型 A
专利代理机构 北京品源专利代理有限公司 专利代理人 赵颖;
摘要 本 发明 公开了一种提取 土壤 宏基因组DNA的方法及其应用。所述方法包括:将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与蛋白酶K、裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有 醋酸 盐和 氯化钠 。本发明的方法提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA 质量 的要求,该方法提取的DNA可以获得较多大 片段 、纯度和核酸总量都较高,此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点,适合大规模的推广和应用。
权利要求

1.一种提取土壤宏基因组DNA的方法,其特征在于,所述方法包括:
将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与蛋白酶K、裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,使用蛋白杂质去除液进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有醋酸盐和氯化钠
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸或醋酸铵中任意一种;
优选地,所述沉淀液中醋酸盐的浓度为100‑5000mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述除杂纯化处理具体包括:
向最终上清液中加入核酸结合液和羟基磁珠溶液进行核酸吸附,用漂洗液漂洗磁珠,用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液;
向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化,收集磁珠,用漂洗液漂洗磁珠,用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA。
4.根据权利要求1‑3中任一项所述的方法,其特征在于,所述提取缓冲液含有Tris‑HCl、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠和氯化钠;
优选地,所述提取缓冲液中Tris‑HCl的浓度为50‑500mM,pH为7.0‑8.5;
优选地,所述提取缓冲液中乙二胺四乙酸二钠的浓度为80‑400mM;
优选地,所述提取缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为50‑500mM;
优选地,所述提取缓冲液中氯化钠的浓度为500‑3000mM。
5.根据权利要求1‑4中任一项所述的方法,其特征在于,所述裂解液A含有CTAB、乙二胺四乙酸二钠和氯化钠;所述裂解液B含有SDS;
优选地,所述裂解液A中CTAB的质量浓度为0.1‑8%;
优选地,所述裂解液A中乙二胺四乙酸二钠的浓度为80‑400mM;
优选地,所述裂解液A中氯化钠的浓度为500‑2000mM;
优选地,所述裂解液B中SDS的质量浓度为1‑30%。
6.根据权利要求1‑5中任一项所述的方法,其特征在于,所述蛋白杂质去除液含有苯酚、氯仿和异戊醇;
优选地,所述蛋白杂质去除液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
7.根据权利要求1‑6中任一项所述的方法,其特征在于,所述核酸结合液包括异丙醇;
所述异丙醇与最终上清液的体积比为(0.5‑1):1。
8.根据权利要求1‑7中任一项所述的方法,其特征在于,所述漂洗液包括体积分数为
70‑85%的乙醇;所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯;所述含有RNA酶的超纯水中RNA酶的质量百分比为0.5‑3%;所述第二洗脱液包括超纯水,pH为6.5‑8.0。
9.根据权利要求1‑8中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法具体包括以下步骤:
(1)将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,使用蛋白杂质去除液进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有醋酸盐和氯化钠;所述沉淀液中醋酸盐的浓度为100‑5000mM;
(2)向最终上清液中加入核酸结合液和羟基磁珠溶液进行核酸吸附,用漂洗液漂洗磁珠,用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液;
(3)向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化,收集磁珠,用漂洗液漂洗磁珠,用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA;
所述漂洗液包括体积分数为70‑85%的乙醇;所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯水;所述含有RNA酶的超纯水中RNA酶的质量百分比为0.5‑3%;所述第二洗脱液为超纯水,pH为6.5‑8.0。
10.权利要求1‑9中任一项所述的方法在提取土壤DNA中的应用;
优选地,所述土壤包括灌木土、玉米田土、稻田土、香蕉根际土、绿化地土、杏土、菜地土、海滩土或茶园土中的任意一种或至少两种的组合。

说明书全文

一种提取土壤宏基因组DNA的方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域,涉及一种提取土壤宏基因组DNA的方法及其应用。

背景技术

[0002] 土壤宏基因组学技术是近年来发展比较迅速的一种新方法,这种方法从土壤环境样本中直接提取微生物基因组DNA即宏基因组。其特点是:采取非培养方法,避开微生物菌种分离培养这一技术难关,从研究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实,直接在基因平上研究、开发和利用无法培养的微生物资源,为人类开发利用自然环境中微生物基因资源开辟了新的途径。所以,完整性好、高纯度、高总量的DNA获得,成为开展土壤宏基因组学的关键要点。
[0003] 目前在提取土壤宏基因组过程中,常常使用物理方法来破碎厚壁或者多层细胞壁,如化锆珠法和热酚法,但这些方法会产生相对原位裂解法更短的核酸片段。即便是原位裂解法,仍然会破坏核酸,限制测序读长,特别是对于难以裂解的革兰氏阳性菌。市面上普遍使用的离心柱法试剂盒,虽然简单快速易用,但在许多时候也会导致无法得到10kb以上的大片段核酸。虽然这些方法可以针对某一种生物进行优化,但土壤环境样本种类繁杂,成分非常复杂,含有大量腐殖酸、酚类物质和重金属离子,这些物质不但影响抽提过程中的各种试剂,导致抽提失败,并且会吸附DNA分子,导致抽提质量下降,影响后续实验操作。因此,发明一种高效提取土壤宏基因组高质量DNA的方法,对各种土壤环境样本的宏基因组学研究显得十分必要。
[0004] CN104560955A公开了一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法,所述方法包括:土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎,杂蛋白的抽除,DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除,DNA洗脱步骤,与传统方法相比,此方法提供独有的去蛋白液和漂洗液去除杂质,能够快速提取到土壤微生物基因组DNA,不仅节省了大量提取时间,同时简化了实验步骤,但是此方法效率低,难以与核酸纯化工作站结合使用。
[0005] 综上所述,目前提取土壤基因组DNA的方法存在操作复杂,效率低,难以有效去除腐殖质、脂类、多糖等杂质,不能满足三代测序平台对DNA质量的要求等问题。如何提供一种高效便捷实用的提取土壤宏基因组DNA的方法,获得高质量和高纯度的DNA,满足三代测序平台对DNA质量的要求,已成为目前分子生物学技术领域亟待解决的问题之一。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种提取土壤宏基因组DNA的方法及其应用,解决了目前提取土壤基因组DNA的方法存在的操作复杂,效率低,难以有效去除腐殖质、脂类、多糖等杂质等问题,达到了高效率获得高质量和高纯度的DNA,满足三代测序平台对DNA质量的要求的效果。
[0007] 为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
[0008] 第一方面,本发明提供了一种提取土壤宏基因组DNA的方法,所述方法包括:
[0009] 将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与蛋白酶K、裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,使用蛋白杂质去除液进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有醋酸盐和氯化钠
[0010] 本发明提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求,该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高,此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点,适合大规模的推广和应用。
[0011] 所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸或醋酸铵中任意一种。
[0012] 优选地,所述沉淀液中醋酸盐的浓度为100‑5000mM。
[0013] 上述100‑5000中的具体点值可以选择100、300、500、700、900、1000、1500、2500、3500、4500、5000等。
[0014] 优选地,所述除杂纯化处理具体包括:
[0015] 向最终上清液中加入核酸结合液和羟基磁珠溶液进行核酸吸附,用漂洗液漂洗磁珠,用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液,向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化,收集磁珠,用漂洗液漂洗磁珠,用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA。
[0016] 优选地,所述提取缓冲液含有Tris‑HCl、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠和氯化钠。
[0017] 优选地,所述提取缓冲液中Tris‑HCl的浓度为50‑500mM,pH为7.0‑8.5。
[0018] 上述50‑500中的具体点值可以选择50、55、60、100、200、300、350、360、400、480、490、500等。
[0019] 上述7.0‑8.5中的具体点值可以选择7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5等。
[0020] 优选地,所述提取缓冲液中乙二胺四乙酸二钠的浓度为80‑400mM。
[0021] 上述80‑400中的具体点值可以选择80、90、100、120、200、300、340、360、380、390、400等。
[0022] 优选地,所述提取缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为50‑500mM。
[0023] 上述50‑500中的具体点值可以选择50、90、100、120、200、300、340、360、380、390、400、500等。
[0024] 优选地,所述提取缓冲液中氯化钠的浓度为500‑3000mM。
[0025] 上述500‑3000中的具体点值可以选择500、700、900、1000、1500、2500、2600、2700、2800、2900、3000等。
[0026] 优选地,所述裂解液A含有CTAB、乙二胺四乙酸二钠和氯化钠,所述裂解液B含有SDS。
[0027] 优选地,所述裂解液A中CTAB的质量浓度为0.1‑8%。
[0028] 上述0.1‑8中的具体点值可以选择0.1、0.6、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3、5、7、8等。
[0029] 优选地,所述裂解液A中乙二胺四乙酸二钠的浓度为80‑400mM。
[0030] 上述80‑400中的具体点值可以选择80、90、100、120、200、300、340、360、380、390、400等。
[0031] 优选地,所述裂解液A中氯化钠的浓度为500‑2000mM。
[0032] 上述500‑2000中的具体点值可以选择500、700、900、1000、1200、1500、1600、1700、1800、1900、2000等。
[0033] 优选地,所述裂解液B中SDS的质量浓度为1‑30%。
[0034] 上述1‑30中的具体点值可以选择1、6、9、10、15、17、18、20、25、26、27、28、29、30等。
[0035] 优选地,所述蛋白杂质去除液含有苯酚、氯仿和异戊醇。
[0036] 优选地,所述蛋白杂质去除液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。
[0037] 优选地,所述核酸结合液包括异丙醇,所述异丙醇与最终上清液的体积比为(0.5‑1):1。
[0038] 上述0.5‑1中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
[0039] 优选地,所述漂洗液包括体积分数为70‑85%的乙醇,所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯水,所述含有RNA酶的超纯水中RNA酶的质量百分比为0.5‑3%,所述第二洗脱液包括超纯水,pH为6.5‑8.0。
[0040] 上述70‑85中的具体点值可以选择70、75、77、78、79、80、81、82、83、85等。
[0041] 上述0.5‑3中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3等。
[0042] 上述10‑50中的具体点值可以选择10、20、30、40、45、50等。
[0043] 上述6.5‑8.0中的具体点值可以选择6.5、7、7.5、8等。
[0044] 作为优选的技术方案,所述提取土壤宏基因组DNA的方法的具体步骤包括:
[0045] (1)将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,使用蛋白杂质去除液进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有醋酸盐和氯化钠;所述沉淀液中醋酸盐的浓度为100‑5000mM;
[0046] (2)向最终上清液中加入核酸结合液和羟基磁珠溶液进行核酸吸附,用漂洗液漂洗磁珠,用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液;
[0047] (3)向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化,收集磁珠,用漂洗液漂洗磁珠,用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA;
[0048] 所述漂洗液包括体积分数为70‑85%的乙醇;所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯水;所述含有RNA酶的超纯水中RNA酶的质量百分比为0.5‑3%;所述第二洗脱液为超纯水,pH为6.5‑8.0。
[0049] 上述70‑85中的具体点值可以选择70、75、77、78、79、80、81、82、83、85等。
[0050] 上述0.5‑3中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3等。
[0051] 上述10‑50中的具体点值可以选择10、20、30、40、45、50等。
[0052] 上述6.5‑8.0中的具体点值可以选择6.5、7、7.5、8等。
[0053] 第二方面,本发明提供了第一方面所述的方法在提取土壤DNA中的应用。
[0054] 优选地,所述土壤包括灌木土、玉米田土、稻田土、香蕉根际土、绿化地土、杏土、菜地土、海滩土或茶园土中的任意一种或至少两种的组合。
[0055] 与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
[0056] (1)本发明提供的方法所含沉淀液,可以有效去除腐殖质,脂类,多糖等杂质,减少对DNA提取过程的干扰,能够满足各种土壤类型,能有效的富集DNA,去除腐殖质的污染,此外,操作简单,不但可以手动操作完成,而且可以用于核酸纯化自动化工作站完成;
[0057] (2)本发明所述的DNA提取方法是自行研制的DNA提取缓冲液、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB和SDS在不同温度下孵育,进一步裂解细胞并使蛋白变性;
[0058] (3)本发明提供的方法采用磁珠进行纯化,相比于陶瓷珠、珠和玻璃珠破碎的方法,本发明方法能在破碎细胞的同时保留相对完整的DNA大片段,可以与核酸纯化工作站结合使用,有效提高DNA的提取效率;
[0059] (4)本发明提供的方法经二次纯化,提取的土壤DNA片段可以达到23K,OD260/230>1.8,OD260/230>1.6,并且Nanodrop/Qubit<2,符合三代测序平台对DNA质量的要求。附图说明
[0060] 图1为实施例1获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图;
[0061] 图2为对比例1获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图;
[0062] 图3为实施例2‑9获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图;
[0063] 图4为对比例2‑9获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图;
[0064] 图5为实施例10‑12获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图。

具体实施方式

[0065] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
[0066] 实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0067] 实施例1
[0068] 本实施例以灌木土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0069] 试剂配置
[0070] 提取缓冲液:0.2M Tris‑HCl(pH为8.0)、0.3M乙二胺四乙酸二钠、0.2M磷酸氢二钠、0.25M氯化钠,超纯水定容1L,高温高压灭菌处理。
[0071] 裂解液A:2%CTAB(w/v)、0.15M乙二胺四乙酸二钠、0.2M氯化钠.
[0072] 裂解液B:25%SDS(w/v)。
[0073] 沉淀液:3M醋酸钾,0.5M氯化钠。
[0074] 蛋白杂质去除液:苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(v/v/v)。
[0075] 漂洗液Ⅰ:70%无水乙醇。
[0076] 漂洗液Ⅱ:70%无水乙醇。
[0077] 洗脱液Ⅰ:含1%RNA酶的超纯水(v/v)。
[0078] 洗脱液Ⅱ:超纯水,pH为7.5。
[0079] (1)称取灌木土壤1g于离心管中,加入5mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃条件下漩涡振荡器上振荡30min;
[0080] (2)向样品管中加入20μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A200μL,放置于50℃水浴锅中孵育40min,期间颠倒混匀;
[0081] (3)向样品管中加入裂解液B 200μL,放置于60℃水浴锅中孵育50min,期间颠倒混匀,将样品在4℃15000rpm离心20min,取上清;
[0082] (4)向上清溶液中加入0.5倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置20min;然后在4℃15000rpm离心20min,取上清;
[0083] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置10min;然后4℃15000rpm离心20min,取上清;
[0084] (6)向上清溶液中加入0.7倍体积异丙醇,再加入40μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0085] (7)从磁力架上取下离心管,加入500μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0086] (8)重复(7)操作一次;
[0087] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0088] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于65℃金属浴孵育10min;
[0089] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中。
[0090] (12)向DNA溶液中加入0.5倍体积的羧基磁珠溶液,使用移液枪轻轻吸打充分混匀,25℃孵育20min,使DNA结合到磁珠上;
[0091] (13)将样品置于磁力架上,待溶液澄清后,小心移除上清;
[0092] (14)保持样品始终处于磁力架上,加入500μL漂洗液Ⅱ,漂洗磁珠,25℃孵育10s,小心移除上清;
[0093] (15)重复S13操作一次,共漂洗两次;
[0094] (16)保持样品始终处于磁力架上,25℃下开盖干燥磁珠约10min;
[0095] (17)加入100μL洗脱液Ⅱ,涡旋振荡混匀,25℃静置20min;
[0096] (18)在磁力架上静置10min,待溶液澄清后,小心吸取上清至新的离心管中,即可获得高质量DNA溶液。
[0097] 实施例2
[0098] 本实施例以玉米田土为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0099] 试剂配置
[0100] 提取缓冲液:0.4M Tris‑HCl(pH为8.0)、0.2M乙二胺四乙酸二钠、0.1M磷酸氢二钠、0.3M氯化钠,超纯水定容1L,高温高压灭菌处理。
[0101] 裂解液A:1%CTAB(w/v)、0.2M乙二胺四乙酸二钠、0.25M氯化钠.
[0102] 裂解液B:20%SDS(w/v)。
[0103] 沉淀液:3M醋酸钠,0.5M氯化钠。
[0104] 蛋白杂质去除液:苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(v/v/v)。
[0105] 漂洗液Ⅰ:80%无水乙醇。
[0106] 漂洗液Ⅱ:80%无水乙醇。
[0107] 洗脱液Ⅰ:含2%RNA酶的超纯水(v/v)。
[0108] 洗脱液Ⅱ:超纯水,pH为7.5。
[0109] (1)称取玉米田土0.5g于离心管中,加入1mL提取缓冲液,再加入50μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡10min;
[0110] (2)向样品管中加入5μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于37℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀;
[0111] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀,将样品在4℃10000rpm离心5min,取上清;
[0112] (4)向上清溶液中加入0.1倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃10000rpm离心5min,取上清;
[0113] (5)向上清溶液中加入0.5倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃10000rpm离心5min,取上清,取上清;
[0114] (6)向上清溶液中加入0.6倍体积异丙醇,再加入10μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0115] (7)从磁力架上取下离心管,加入500μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0116] (8)重复(7)操作一次;
[0117] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0118] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于50℃金属浴孵育10min;
[0119] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0120] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0121] 实施例3
[0122] 本实施例以稻田土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0123] 试剂配置
[0124] 提取缓冲液:0.1M Tris‑HCl(pH为8.0)、0.15M乙二胺四乙酸二钠、0.15M磷酸氢二钠、0.1M氯化钠,超纯水定容1L,高温高压灭菌处理。
[0125] 裂解液A:2%CTAB(w/v)、0.1M乙二胺四乙酸二钠、0.1M氯化钠.
[0126] 裂解液B:30%SDS(w/v)。
[0127] 沉淀液:2M醋酸铵,1M氯化钠。
[0128] 蛋白杂质去除液:苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(v/v/v)。
[0129] 漂洗液Ⅰ:80%无水乙醇。
[0130] 漂洗液Ⅱ:80%无水乙醇。
[0131] 洗脱液Ⅰ:含1%RNA酶的超纯水(v/v)。
[0132] 洗脱液Ⅱ:超纯水,pH为7.5。
[0133] (1)称取稻田土1g于离心管中,加入3mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡20min;
[0134] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀数次;
[0135] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0136] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0137] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0138] (6)向上清溶液中加入0.8倍体积异丙醇,再加入30μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0139] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0140] (8)重复(7)操作一次;
[0141] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0142] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min;
[0143] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0144] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0145] 实施例4
[0146] 本实施例以香蕉根际土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0147] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。
[0148] (1)称取香蕉根际土1g于离心管中,加入3mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡20min;
[0149] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀;
[0150] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0151] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0152] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃12000rpm离心10min,取上清,取上清;
[0153] (6)向上清溶液中加入0.8倍体积异丙醇,再加入30μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0154] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0155] (8)重复(7)操作一次;
[0156] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0157] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min;
[0158] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0159] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0160] 实施例5
[0161] 本实施例以绿化地土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0162] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。
[0163] (1)称取绿化地土1g于离心管中,加入3mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡20min;
[0164] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀;
[0165] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0166] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0167] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃12000rpm离心10min,取上清;
[0168] (6)向上清溶液中加入0.8倍体积异丙醇,再加入30μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0169] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0170] (8)重复(7)操作一次;
[0171] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0172] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min;
[0173] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0174] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0175] 实施例6
[0176] 本实施例以银杏土土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0177] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。
[0178] (1)称取银杏土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min;
[0179] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀;
[0180] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0181] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0182] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0183] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0184] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0185] (8)重复(7)操作一次;
[0186] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0187] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min;
[0188] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0189] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0190] 实施例7
[0191] 本实施例以菜地土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0192] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。
[0193] (1)称取菜地土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min;
[0194] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀;
[0195] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0196] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0197] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0198] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0199] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0200] (8)重复(7)操作一次;
[0201] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0202] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min;
[0203] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0204] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0205] 实施例8
[0206] 本实施例以海滩土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0207] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。
[0208] (1)称取海滩土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min;
[0209] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀;
[0210] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0211] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0212] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0213] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0214] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0215] (8)重复(7)操作一次;
[0216] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0217] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min;
[0218] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0219] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0220] 实施例9
[0221] 本实施例以茶园土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。
[0222] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。
[0223] (1)称取茶园土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min;
[0224] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A 500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀;
[0225] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0226] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0227] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清;
[0228] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清;
[0229] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清;
[0230] (8)重复(7)操作一次;
[0231] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光;
[0232] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min;
[0233] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中;
[0234] (12‑18)与实施例1步骤相同。
[0235] 对比例1‑9
[0236] 对比例1‑9与相对应的实施例1‑9同一样本进行实验。使用FastDNATMSpin Kit for Soil(MPBio,Southern California,USA)DNA提取试剂盒对样品进行提取,抽提样品量为0.5g,步骤按照试剂盒说明书进行。
[0237] 电泳检测参数:琼脂糖凝胶浓度:0.7%琼脂糖;电压:300V;时间:30min。
[0238] 实施例10
[0239] 本实施例与实施例1的区别仅在于:沉淀液改为3M醋酸钠,0.5M氯化钠。
[0240] 实施例11
[0241] 本实施例与实施例1的区别仅在于:沉淀液改为3M醋酸铵,0.5M氯化钠。
[0242] 实施例12
[0243] 本实施例与实施例1的区别仅在于:沉淀液醋酸钾的浓度改为90mM。
[0244] 实施例1和对比例1的超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示,实施例1的琼脂糖凝胶电泳质检结果如图1所示,1号和2号条带代表两次重复,对比例1的琼脂糖凝胶电泳质检结果如图2所示,1号和2号条带代表两次重复。
[0245] 表1
[0246]
[0247] 实施例2、3和对比例2、3的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例2、3的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的2号和3号条带所示,对比例2、3的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的2号和3号条带所示。
[0248] 表2
[0249]
[0250]
[0251] 实施例4、5和对比例4、5的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例4、5的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的4号和5号条带所示,对比例4、5的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的4号和5号条带所示。
[0252] 表3
[0253] 检测指标 实施例4 对比例4 实施例5 对比例5Qubit(ng/μL) 50 39 45 28
OD260/280 1.82 1.54 1.84 1.56
OD260/230 1.65 0.63 1.72 0.26
总量(μg) 5 3.9 4.5 2.9
体积(μL) 100 100 100 100
Nanodrop(ng/μL) 48.8 46.2 48.5 34.6
N/Q 1.02 1.18 1.07 1.24
[0254] 实施例6、7和对比例6、7的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例6、7的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的6号和7号条带所示,对比例6、7的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的6号和7号条带所示。
[0255] 表4
[0256] 检测指标 实施例6 对比例6 实施例7 对比例7Qubit(ng/μL) 96 56 83 50
OD260/280 1.86 1.66 1.89 1.64
OD260/230 1.72 0.45 1.76 0.66
总量(μg) 9.6 5.6 8.3 5
体积(μL) 100 100 100 100
Nanodrop(ng/μL) 84.7 72.6 87.5 72.8
N/Q 1.01 1.27 0.95 1.46
[0257] 实施例8、9和对比例8、9的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例8、9的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的8号和9号条带所示,对比例8、9的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的8号和9号条带所示。
[0258] 表5
[0259]
[0260]
[0261] 表6
[0262]检测指标 实施例10 实施例11 实施例12
Qubit(ng/μL) 90 85 60
OD260/280 1.81 1.82 1.75
OD260/230 1.56 1.52 1.45
总量(μg) 9 8.5 6
体积(μL) 100 100 100
Nanodrop(ng/μL) 102 125 153
N/Q 1.13 1.47 2.55
[0263] 电泳检测参数:琼脂糖凝胶浓度:0.7%琼脂糖;电压:300V;时间:30min。
[0264] 实施例1中1号条带和2号条带显示结果相近,表明本发明方法提取的DNA均一性好,由实施例1‑9和相应的对比例1‑9电泳结果可知,本发明方法得到的宏基因组DNA条带更加明亮,清晰,完整,且无降解,对比例方法得到的DNA虽然也有较高亮度,但是有降解,拖尾严重,说明本发明方法得到的DNA质量更好,浓度更高,实施例10、实施例11和实施例1相比DNA条带略有拖尾现象,说明沉淀液醋酸盐选用醋酸钾时得到的DNA质量更好,效果更优于醋酸钠和醋酸铵,实施例12和实施例1相比,醋酸钾浓度低于100mM,结果DNA条带有严重拖尾现象,说明沉淀液浓度低于本发明的浓度时不能得到高质量DNA,不能满足三代测序上机检测的要求。
[0265] 从超微量紫外光分光光度计检测结果(表1‑表6)看,本发明方法得到的DNA浓度显著高于其他方法,而且260/280以及260/230比值也比其他方法高,说明本方法得到的DNA蛋白质、糖类、盐等杂质含量少,纯度更好,实施例10、实施例11和实施例1相比核酸总量较低,OD260/230<1.6,说明沉淀液醋酸盐选用醋酸钾时得到的DNA质量更好,杂质更少,纯度更高,效果更优于醋酸钠和醋酸铵,实施例12和实施例1相比,醋酸钾浓度低于100mM,结果核酸总量较低,并且OD260/280<1.8,OD260/230<1.6,说明沉淀液浓度低于本发明的浓度时不能得到高质量DNA,杂质多,纯度低,不能满足三代测序上机检测的要求。
[0266] 综上所述,本发明的方法提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求,该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高,此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点,适合大规模的推广和应用。
[0267] 申请声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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