热词 | 离心 dna 混匀 磁力 溶液 土壤 裂解 样品 漂洗 涡旋 | ||
专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
申请号 | CN202310259870.X | 申请日 | 2023-03-17 |
公开(公告)号 | CN116144647A | 公开(公告)日 | 2023-05-23 |
申请人 | 上海美吉生物医药科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
发明人 | 梁婷婷; 董亚晨; | 第一发明人 | 梁婷婷 |
权利人 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
当前权利人 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
省份 | 当前专利权人所在省份:上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市:上海市浦东新区 |
具体地址 | 当前专利权人所在详细地址:上海市浦东新区康新公路3399弄3号 | 邮编 | 当前专利权人邮编:201321 |
主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 ; C12Q1/6806 |
专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
专利代理机构 | 北京品源专利代理有限公司 | 专利代理人 | 赵颖; |
摘要 | 本 发明 公开了一种提取 土壤 宏基因组DNA的方法及其应用。所述方法包括:将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与蛋白酶K、裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有 醋酸 盐和 氯化钠 。本发明的方法提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA 质量 的要求,该方法提取的DNA可以获得较多大 片段 、纯度和核酸总量都较高,此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点,适合大规模的推广和应用。 | ||
权利要求 | 1.一种提取土壤宏基因组DNA的方法,其特征在于,所述方法包括: |
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说明书全文 | 一种提取土壤宏基因组DNA的方法及其应用技术领域背景技术[0002] 土壤宏基因组学技术是近年来发展比较迅速的一种新方法,这种方法从土壤环境样本中直接提取微生物基因组DNA即宏基因组。其特点是:采取非培养方法,避开微生物菌种分离培养这一技术难关,从研究环境中获得大量未能培养的微生物成为现实,直接在基因水平上研究、开发和利用无法培养的微生物资源,为人类开发利用自然环境中微生物基因资源开辟了新的途径。所以,完整性好、高纯度、高总量的DNA获得,成为开展土壤宏基因组学的关键要点。 [0003] 目前在提取土壤宏基因组过程中,常常使用物理方法来破碎厚壁或者多层细胞壁,如氧化锆珠法和热酚法,但这些方法会产生相对原位裂解法更短的核酸片段。即便是原位裂解法,仍然会破坏核酸,限制测序读长,特别是对于难以裂解的革兰氏阳性菌。市面上普遍使用的离心柱法试剂盒,虽然简单快速易用,但在许多时候也会导致无法得到10kb以上的大片段核酸。虽然这些方法可以针对某一种生物进行优化,但土壤环境样本种类繁杂,成分非常复杂,含有大量腐殖酸、酚类物质和重金属离子,这些物质不但影响抽提过程中的各种试剂,导致抽提失败,并且会吸附DNA分子,导致抽提质量下降,影响后续实验操作。因此,发明一种高效提取土壤宏基因组高质量DNA的方法,对各种土壤环境样本的宏基因组学研究显得十分必要。 [0004] CN104560955A公开了一种利用CTAB提取土壤微生物基因组DNA的方法,所述方法包括:土壤杂质的去除与微生物细胞的破碎,杂蛋白的抽除,DNA吸附柱吸附DNA以及杂质的去除,DNA洗脱步骤,与传统方法相比,此方法提供独有的去蛋白液和漂洗液去除杂质,能够快速提取到土壤微生物基因组DNA,不仅节省了大量提取时间,同时简化了实验步骤,但是此方法效率低,难以与核酸纯化工作站结合使用。 [0005] 综上所述,目前提取土壤基因组DNA的方法存在操作复杂,效率低,难以有效去除腐殖质、脂类、多糖等杂质,不能满足三代测序平台对DNA质量的要求等问题。如何提供一种高效便捷实用的提取土壤宏基因组DNA的方法,获得高质量和高纯度的DNA,满足三代测序平台对DNA质量的要求,已成为目前分子生物学技术领域亟待解决的问题之一。 发明内容[0006] 针对现有技术的不足和实际需求,本发明提供一种提取土壤宏基因组DNA的方法及其应用,解决了目前提取土壤基因组DNA的方法存在的操作复杂,效率低,难以有效去除腐殖质、脂类、多糖等杂质等问题,达到了高效率获得高质量和高纯度的DNA,满足三代测序平台对DNA质量的要求的效果。 [0007] 为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案: [0008] 第一方面,本发明提供了一种提取土壤宏基因组DNA的方法,所述方法包括: [0009] 将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与蛋白酶K、裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,使用蛋白杂质去除液进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有醋酸盐和氯化钠。 [0010] 本发明提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求,该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高,此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点,适合大规模的推广和应用。 [0011] 所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵中任意一种。 [0012] 优选地,所述沉淀液中醋酸盐的浓度为100‑5000mM。 [0013] 上述100‑5000中的具体点值可以选择100、300、500、700、900、1000、1500、2500、3500、4500、5000等。 [0014] 优选地,所述除杂纯化处理具体包括: [0015] 向最终上清液中加入核酸结合液和羟基磁珠溶液进行核酸吸附,用漂洗液漂洗磁珠,用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液,向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化,收集磁珠,用漂洗液漂洗磁珠,用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA。 [0017] 优选地,所述提取缓冲液中Tris‑HCl的浓度为50‑500mM,pH为7.0‑8.5。 [0018] 上述50‑500中的具体点值可以选择50、55、60、100、200、300、350、360、400、480、490、500等。 [0019] 上述7.0‑8.5中的具体点值可以选择7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5等。 [0020] 优选地,所述提取缓冲液中乙二胺四乙酸二钠的浓度为80‑400mM。 [0021] 上述80‑400中的具体点值可以选择80、90、100、120、200、300、340、360、380、390、400等。 [0022] 优选地,所述提取缓冲液中磷酸氢二钠的浓度为50‑500mM。 [0023] 上述50‑500中的具体点值可以选择50、90、100、120、200、300、340、360、380、390、400、500等。 [0024] 优选地,所述提取缓冲液中氯化钠的浓度为500‑3000mM。 [0025] 上述500‑3000中的具体点值可以选择500、700、900、1000、1500、2500、2600、2700、2800、2900、3000等。 [0026] 优选地,所述裂解液A含有CTAB、乙二胺四乙酸二钠和氯化钠,所述裂解液B含有SDS。 [0027] 优选地,所述裂解液A中CTAB的质量浓度为0.1‑8%。 [0028] 上述0.1‑8中的具体点值可以选择0.1、0.6、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3、5、7、8等。 [0029] 优选地,所述裂解液A中乙二胺四乙酸二钠的浓度为80‑400mM。 [0030] 上述80‑400中的具体点值可以选择80、90、100、120、200、300、340、360、380、390、400等。 [0031] 优选地,所述裂解液A中氯化钠的浓度为500‑2000mM。 [0032] 上述500‑2000中的具体点值可以选择500、700、900、1000、1200、1500、1600、1700、1800、1900、2000等。 [0033] 优选地,所述裂解液B中SDS的质量浓度为1‑30%。 [0034] 上述1‑30中的具体点值可以选择1、6、9、10、15、17、18、20、25、26、27、28、29、30等。 [0035] 优选地,所述蛋白杂质去除液含有苯酚、氯仿和异戊醇。 [0036] 优选地,所述蛋白杂质去除液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。 [0037] 优选地,所述核酸结合液包括异丙醇,所述异丙醇与最终上清液的体积比为(0.5‑1):1。 [0038] 上述0.5‑1中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。 [0039] 优选地,所述漂洗液包括体积分数为70‑85%的乙醇,所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯水,所述含有RNA酶的超纯水中RNA酶的质量百分比为0.5‑3%,所述第二洗脱液包括超纯水,pH为6.5‑8.0。 [0040] 上述70‑85中的具体点值可以选择70、75、77、78、79、80、81、82、83、85等。 [0041] 上述0.5‑3中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3等。 [0042] 上述10‑50中的具体点值可以选择10、20、30、40、45、50等。 [0043] 上述6.5‑8.0中的具体点值可以选择6.5、7、7.5、8等。 [0044] 作为优选的技术方案,所述提取土壤宏基因组DNA的方法的具体步骤包括: [0045] (1)将土壤样品与提取缓冲液、溶菌酶混合孵育,再与裂解液A和裂解液B混合,加热孵育,离心获取上清液,将所述上清液与沉淀液混合,再次离心获取最终上清液,使用蛋白杂质去除液进行除杂纯化处理,得到DNA;所述沉淀液含有醋酸盐和氯化钠;所述沉淀液中醋酸盐的浓度为100‑5000mM; [0046] (2)向最终上清液中加入核酸结合液和羟基磁珠溶液进行核酸吸附,用漂洗液漂洗磁珠,用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液; [0047] (3)向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化,收集磁珠,用漂洗液漂洗磁珠,用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA; [0048] 所述漂洗液包括体积分数为70‑85%的乙醇;所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯水;所述含有RNA酶的超纯水中RNA酶的质量百分比为0.5‑3%;所述第二洗脱液为超纯水,pH为6.5‑8.0。 [0049] 上述70‑85中的具体点值可以选择70、75、77、78、79、80、81、82、83、85等。 [0050] 上述0.5‑3中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3等。 [0051] 上述10‑50中的具体点值可以选择10、20、30、40、45、50等。 [0052] 上述6.5‑8.0中的具体点值可以选择6.5、7、7.5、8等。 [0053] 第二方面,本发明提供了第一方面所述的方法在提取土壤DNA中的应用。 [0055] 与现有技术相比,本发明具有如下有益效果: [0056] (1)本发明提供的方法所含沉淀液,可以有效去除腐殖质,脂类,多糖等杂质,减少对DNA提取过程的干扰,能够满足各种土壤类型,能有效的富集DNA,去除腐殖质的污染,此外,操作简单,不但可以手动操作完成,而且可以用于核酸纯化自动化工作站完成; [0057] (2)本发明所述的DNA提取方法是自行研制的DNA提取缓冲液、溶菌酶、蛋白酶K、CTAB和SDS在不同温度下孵育,进一步裂解细胞并使蛋白变性; [0058] (3)本发明提供的方法采用磁珠进行纯化,相比于陶瓷珠、钢珠和玻璃珠破碎的方法,本发明方法能在破碎细胞的同时保留相对完整的DNA大片段,可以与核酸纯化工作站结合使用,有效提高DNA的提取效率; [0059] (4)本发明提供的方法经二次纯化,提取的土壤DNA片段可以达到23K,OD260/230>1.8,OD260/230>1.6,并且Nanodrop/Qubit<2,符合三代测序平台对DNA质量的要求。附图说明 [0061] 图2为对比例1获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图; [0062] 图3为实施例2‑9获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图; [0063] 图4为对比例2‑9获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图; [0064] 图5为实施例10‑12获得的DNA琼脂糖凝胶电泳质检结果图。 具体实施方式[0065] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。 [0067] 实施例1 [0068] 本实施例以灌木土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0069] 试剂配置 [0070] 提取缓冲液:0.2M Tris‑HCl(pH为8.0)、0.3M乙二胺四乙酸二钠、0.2M磷酸氢二钠、0.25M氯化钠,超纯水定容1L,高温高压灭菌处理。 [0071] 裂解液A:2%CTAB(w/v)、0.15M乙二胺四乙酸二钠、0.2M氯化钠. [0072] 裂解液B:25%SDS(w/v)。 [0073] 沉淀液:3M醋酸钾,0.5M氯化钠。 [0074] 蛋白杂质去除液:苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(v/v/v)。 [0075] 漂洗液Ⅰ:70%无水乙醇。 [0076] 漂洗液Ⅱ:70%无水乙醇。 [0077] 洗脱液Ⅰ:含1%RNA酶的超纯水(v/v)。 [0078] 洗脱液Ⅱ:超纯水,pH为7.5。 [0079] (1)称取灌木土壤1g于离心管中,加入5mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃条件下漩涡振荡器上振荡30min; [0080] (2)向样品管中加入20μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A200μL,放置于50℃水浴锅中孵育40min,期间颠倒混匀; [0081] (3)向样品管中加入裂解液B 200μL,放置于60℃水浴锅中孵育50min,期间颠倒混匀,将样品在4℃15000rpm离心20min,取上清; [0082] (4)向上清溶液中加入0.5倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置20min;然后在4℃15000rpm离心20min,取上清; [0083] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置10min;然后4℃15000rpm离心20min,取上清; [0084] (6)向上清溶液中加入0.7倍体积异丙醇,再加入40μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0085] (7)从磁力架上取下离心管,加入500μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0086] (8)重复(7)操作一次; [0087] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0088] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于65℃金属浴孵育10min; [0089] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中。 [0090] (12)向DNA溶液中加入0.5倍体积的羧基磁珠溶液,使用移液枪轻轻吸打充分混匀,25℃孵育20min,使DNA结合到磁珠上; [0091] (13)将样品置于磁力架上,待溶液澄清后,小心移除上清; [0092] (14)保持样品始终处于磁力架上,加入500μL漂洗液Ⅱ,漂洗磁珠,25℃孵育10s,小心移除上清; [0093] (15)重复S13操作一次,共漂洗两次; [0094] (16)保持样品始终处于磁力架上,25℃下开盖干燥磁珠约10min; [0095] (17)加入100μL洗脱液Ⅱ,涡旋振荡混匀,25℃静置20min; [0096] (18)在磁力架上静置10min,待溶液澄清后,小心吸取上清至新的离心管中,即可获得高质量DNA溶液。 [0097] 实施例2 [0098] 本实施例以玉米田土为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0099] 试剂配置 [0100] 提取缓冲液:0.4M Tris‑HCl(pH为8.0)、0.2M乙二胺四乙酸二钠、0.1M磷酸氢二钠、0.3M氯化钠,超纯水定容1L,高温高压灭菌处理。 [0101] 裂解液A:1%CTAB(w/v)、0.2M乙二胺四乙酸二钠、0.25M氯化钠. [0102] 裂解液B:20%SDS(w/v)。 [0103] 沉淀液:3M醋酸钠,0.5M氯化钠。 [0104] 蛋白杂质去除液:苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(v/v/v)。 [0105] 漂洗液Ⅰ:80%无水乙醇。 [0106] 漂洗液Ⅱ:80%无水乙醇。 [0107] 洗脱液Ⅰ:含2%RNA酶的超纯水(v/v)。 [0108] 洗脱液Ⅱ:超纯水,pH为7.5。 [0109] (1)称取玉米田土0.5g于离心管中,加入1mL提取缓冲液,再加入50μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡10min; [0110] (2)向样品管中加入5μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于37℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀; [0111] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀,将样品在4℃10000rpm离心5min,取上清; [0112] (4)向上清溶液中加入0.1倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃10000rpm离心5min,取上清; [0113] (5)向上清溶液中加入0.5倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃10000rpm离心5min,取上清,取上清; [0114] (6)向上清溶液中加入0.6倍体积异丙醇,再加入10μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0115] (7)从磁力架上取下离心管,加入500μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0116] (8)重复(7)操作一次; [0117] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0118] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于50℃金属浴孵育10min; [0119] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0120] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0121] 实施例3 [0122] 本实施例以稻田土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0123] 试剂配置 [0124] 提取缓冲液:0.1M Tris‑HCl(pH为8.0)、0.15M乙二胺四乙酸二钠、0.15M磷酸氢二钠、0.1M氯化钠,超纯水定容1L,高温高压灭菌处理。 [0125] 裂解液A:2%CTAB(w/v)、0.1M乙二胺四乙酸二钠、0.1M氯化钠. [0126] 裂解液B:30%SDS(w/v)。 [0127] 沉淀液:2M醋酸铵,1M氯化钠。 [0128] 蛋白杂质去除液:苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1(v/v/v)。 [0129] 漂洗液Ⅰ:80%无水乙醇。 [0130] 漂洗液Ⅱ:80%无水乙醇。 [0131] 洗脱液Ⅰ:含1%RNA酶的超纯水(v/v)。 [0132] 洗脱液Ⅱ:超纯水,pH为7.5。 [0133] (1)称取稻田土1g于离心管中,加入3mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡20min; [0134] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀数次; [0135] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃12000rpm离心10min,取上清; [0136] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃12000rpm离心10min,取上清; [0137] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃12000rpm离心10min,取上清; [0138] (6)向上清溶液中加入0.8倍体积异丙醇,再加入30μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0139] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0140] (8)重复(7)操作一次; [0141] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0142] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min; [0143] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0144] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0145] 实施例4 [0146] 本实施例以香蕉根际土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0147] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。 [0148] (1)称取香蕉根际土1g于离心管中,加入3mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡20min; [0149] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀; [0150] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃12000rpm离心10min,取上清; [0151] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃12000rpm离心10min,取上清; [0152] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃12000rpm离心10min,取上清,取上清; [0153] (6)向上清溶液中加入0.8倍体积异丙醇,再加入30μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0154] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0155] (8)重复(7)操作一次; [0156] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0157] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min; [0158] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0159] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0160] 实施例5 [0161] 本实施例以绿化地土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0162] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。 [0163] (1)称取绿化地土1g于离心管中,加入3mL提取缓冲液,再加入300μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡20min; [0164] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A150μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀; [0165] (3)向样品管中加入裂解液B 150μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃12000rpm离心10min,取上清; [0166] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃12000rpm离心10min,取上清; [0167] (5)向上清溶液中加入0.8倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃12000rpm离心10min,取上清; [0168] (6)向上清溶液中加入0.8倍体积异丙醇,再加入30μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0169] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0170] (8)重复(7)操作一次; [0171] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0172] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min; [0173] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0174] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0175] 实施例6 [0176] 本实施例以银杏土土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0177] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。 [0178] (1)称取银杏土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min; [0179] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀; [0180] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0181] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0182] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清; [0183] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0184] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0185] (8)重复(7)操作一次; [0186] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0187] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min; [0188] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0189] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0190] 实施例7 [0191] 本实施例以菜地土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0192] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。 [0193] (1)称取菜地土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min; [0194] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀; [0195] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0196] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0197] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清; [0198] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0199] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0200] (8)重复(7)操作一次; [0201] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0202] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min; [0203] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0204] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0205] 实施例8 [0206] 本实施例以海滩土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0207] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。 [0208] (1)称取海滩土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min; [0209] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀; [0210] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0211] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0212] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液,混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清; [0213] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0214] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0215] (8)重复(7)操作一次; [0216] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0217] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min; [0218] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0219] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0220] 实施例9 [0221] 本实施例以茶园土壤为样品提取土壤宏基因组DNA。 [0222] 本实施例所用试剂配置与实施例1相同。 [0223] (1)称取茶园土2g于离心管中,加入6mL提取缓冲液,再加入400μL溶菌酶(浓度为100mg/mL),25℃下漩涡振荡器上振荡30min; [0224] (2)向样品管中加入10μL蛋白酶K(浓度为20mg/mL),再加入裂解液A 500μL,放置于50℃水浴锅中孵育20min,期间颠倒混匀; [0225] (3)向样品管中加入裂解液B 500μL,放置于60℃水浴锅中孵育1.0h,期间颠倒混匀,将样品在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0226] (4)向上清溶液中加入0.3倍体积沉淀液,混匀后4℃条件下放置10min;然后在4℃16000rpm离心20min,取上清; [0227] (5)向上清溶液中加入1倍体积蛋白杂质去除液;混匀后25℃放置5min;然后4℃16000rpm离心20min,取上清; [0228] (6)向上清溶液中加入1倍体积异丙醇,再加入60μL羟基磁珠溶液,混匀后25℃放置30min,将样品管转移至磁力架上,吸磁30s至溶液澄清,吸弃上清; [0229] (7)从磁力架上取下离心管,加入700μL漂洗液Ⅰ,涡旋混匀10s,将离心管置于磁力架上,吸磁20s至溶液澄清,吸弃上清; [0230] (8)重复(7)操作一次; [0231] (9)将离心管置于磁力架上,打开离心管盖,对离心管内的磁珠25℃干燥,至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光; [0232] (10)向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ,涡旋混匀,放置于60℃金属浴孵育10min; [0233] (11)孵育结束后,涡旋震荡离心管,然后将离心管置于磁力架上磁吸磁60s至溶液澄清,小心转移上清至离心管中; [0234] (12‑18)与实施例1步骤相同。 [0235] 对比例1‑9 [0236] 对比例1‑9与相对应的实施例1‑9同一样本进行实验。使用FastDNATMSpin Kit for Soil(MPBio,Southern California,USA)DNA提取试剂盒对样品进行提取,抽提样品量为0.5g,步骤按照试剂盒说明书进行。 [0238] 实施例10 [0239] 本实施例与实施例1的区别仅在于:沉淀液改为3M醋酸钠,0.5M氯化钠。 [0240] 实施例11 [0241] 本实施例与实施例1的区别仅在于:沉淀液改为3M醋酸铵,0.5M氯化钠。 [0242] 实施例12 [0243] 本实施例与实施例1的区别仅在于:沉淀液醋酸钾的浓度改为90mM。 [0244] 实施例1和对比例1的超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示,实施例1的琼脂糖凝胶电泳质检结果如图1所示,1号和2号条带代表两次重复,对比例1的琼脂糖凝胶电泳质检结果如图2所示,1号和2号条带代表两次重复。 [0245] 表1 [0246] [0247] 实施例2、3和对比例2、3的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例2、3的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的2号和3号条带所示,对比例2、3的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的2号和3号条带所示。 [0248] 表2 [0249] [0250] [0251] 实施例4、5和对比例4、5的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例4、5的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的4号和5号条带所示,对比例4、5的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的4号和5号条带所示。 [0252] 表3 [0253] 检测指标 实施例4 对比例4 实施例5 对比例5Qubit(ng/μL) 50 39 45 28 OD260/280 1.82 1.54 1.84 1.56 OD260/230 1.65 0.63 1.72 0.26 总量(μg) 5 3.9 4.5 2.9 体积(μL) 100 100 100 100 Nanodrop(ng/μL) 48.8 46.2 48.5 34.6 N/Q 1.02 1.18 1.07 1.24 [0254] 实施例6、7和对比例6、7的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例6、7的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的6号和7号条带所示,对比例6、7的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的6号和7号条带所示。 [0255] 表4 [0256] 检测指标 实施例6 对比例6 实施例7 对比例7Qubit(ng/μL) 96 56 83 50 OD260/280 1.86 1.66 1.89 1.64 OD260/230 1.72 0.45 1.76 0.66 总量(μg) 9.6 5.6 8.3 5 体积(μL) 100 100 100 100 Nanodrop(ng/μL) 84.7 72.6 87.5 72.8 N/Q 1.01 1.27 0.95 1.46 [0257] 实施例8、9和对比例8、9的超微量紫外光分光光度计检测结果如表2所示,实施例8、9的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图3中的8号和9号条带所示,对比例8、9的琼脂糖凝胶电泳质检结果分别如图4中的8号和9号条带所示。 [0258] 表5 [0259] [0260] [0261] 表6 [0262]检测指标 实施例10 实施例11 实施例12 Qubit(ng/μL) 90 85 60 OD260/280 1.81 1.82 1.75 OD260/230 1.56 1.52 1.45 总量(μg) 9 8.5 6 体积(μL) 100 100 100 Nanodrop(ng/μL) 102 125 153 N/Q 1.13 1.47 2.55 [0263] 电泳检测参数:琼脂糖凝胶浓度:0.7%琼脂糖;电压:300V;时间:30min。 [0264] 实施例1中1号条带和2号条带显示结果相近,表明本发明方法提取的DNA均一性好,由实施例1‑9和相应的对比例1‑9电泳结果可知,本发明方法得到的宏基因组DNA条带更加明亮,清晰,完整,且无降解,对比例方法得到的DNA虽然也有较高亮度,但是有降解,拖尾严重,说明本发明方法得到的DNA质量更好,浓度更高,实施例10、实施例11和实施例1相比DNA条带略有拖尾现象,说明沉淀液醋酸盐选用醋酸钾时得到的DNA质量更好,效果更优于醋酸钠和醋酸铵,实施例12和实施例1相比,醋酸钾浓度低于100mM,结果DNA条带有严重拖尾现象,说明沉淀液浓度低于本发明的浓度时不能得到高质量DNA,不能满足三代测序上机检测的要求。 [0265] 从超微量紫外光分光光度计检测结果(表1‑表6)看,本发明方法得到的DNA浓度显著高于其他方法,而且260/280以及260/230比值也比其他方法高,说明本方法得到的DNA蛋白质、糖类、盐等杂质含量少,纯度更好,实施例10、实施例11和实施例1相比核酸总量较低,OD260/230<1.6,说明沉淀液醋酸盐选用醋酸钾时得到的DNA质量更好,杂质更少,纯度更高,效果更优于醋酸钠和醋酸铵,实施例12和实施例1相比,醋酸钾浓度低于100mM,结果核酸总量较低,并且OD260/280<1.8,OD260/230<1.6,说明沉淀液浓度低于本发明的浓度时不能得到高质量DNA,杂质多,纯度低,不能满足三代测序上机检测的要求。 [0266] 综上所述,本发明的方法提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求,该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高,此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点,适合大规模的推广和应用。 |