专利汇 - 一种通用的SARS-COV-2的RBD纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用 - PatentHub专利检索|专利汇|专利查询网|发明专利查询分析

一种通用的SARS-COV-2的RBD纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用

热词	rbd 疫苗 sars cov 纳米颗粒细胞 nov 病毒蛋白
专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202310266841.6	申请日	2023-03-20
公开(公告)号	CN116121286A	公开(公告)日	2023-05-16
申请人	中国医学科学院医学生物学研究所;	申请人类型	科研院所
发明人	马雁冰; 郑鹏; 龙琼; 白红妹; 杨旭;	第一发明人	马雁冰
权利人	中国医学科学院医学生物学研究所	权利人类型	科研院所
当前权利人	中国医学科学院医学生物学研究所	当前权利人类型	科研院所
省份	当前专利权人所在省份：云南省	城市	当前专利权人所在城市：云南省昆明市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：云南省昆明市五华区茭菱路935号	邮编	当前专利权人邮编：650118
主IPC国际分类	C12N15/70	所有IPC国际分类	C12N15/70 ; C07K19/00 ; A61K39/215 ; A61K9/51 ; A61P31/14 ; C12R1/19
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	8	专利文献类型	A
专利代理机构	北京国序知识产权代理有限公司	专利代理人	高芳; 周恺丰;
摘要	本发明提供了一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用，制备时利用基因工程技术将不同SARS‑CoV‑2毒株的RBD基因构建到诺如病毒的S结构域的C端，得到表达单元，将所述表达单元克隆进入大肠杆菌质粒中得到重组质粒；将获得的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，并在培养基中培养、诱导重组蛋白表达，蛋白诱导结束后离心收集细菌，细菌沉淀重悬于裂解缓冲液中，进行超声裂解，得到细菌裂解液；离心处理细菌裂解液并收集上清，过滤后利用柱层析纯化得到均一的蛋白纳米颗粒，即为通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗。所述RBD纳米颗粒疫苗能够将RBD高密度的呈递在Nov的S结构域表面，自由的迁移到引流淋巴结中从而增强疫苗的效力。
权利要求	1.一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，利用基因工程技术将不同SARS‑CoV‑2毒株的RBD基因构建到诺如病毒的S结构域的C端，得到表达单元，将所述表达单元克隆进入大肠杆菌质粒中得到重组质粒；步骤2，将步骤1获得的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，并在培养基中培养、诱导重组蛋白表达，蛋白诱导结束后离心收集细菌，细菌沉淀重悬于裂解缓冲液中，进行超声裂解，得到细菌裂解液；步骤3，离心处理步骤2获得的细菌裂解液并收集上清，过滤后利用柱层析纯化得到均一的蛋白纳米颗粒，即为通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗。 2.根据权利要求1所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述SARS‑CoV‑2的RBD基因包括RBD‑Wuhan‑Hu‑1，RBD‑B.1.351和RBD‑B.1.617。 3.根据权利要求1所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述诺如病毒的S结构域的氨基酸序列如SEQID No1所示。 4.根据权利要求1～3任一项所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述诺如病毒的S结构域的C端通过连接臂融合所述SARS‑CoV‑2的RBD序列，并在末端添加Histag标签。 5.根据权利要求1所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述柱层析纯化具体包括以下步骤：先使用镍柱亲和层析对细菌裂解液进行纯化，并使用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；洗脱后的目的蛋白再进行凝胶过滤层析，最终获得所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗。 6.一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗，其特征在于，所述疫苗由如权利要求1～5任一项所述制备方法制备得到。 7.根据权利要求1所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗，其特征在于，所述RBD纳米颗粒疫苗的粒径为20nm～25nm。 8.一种如权利要求6或7所述RBD纳米颗粒疫苗在制备SARS‑COV‑2相关疫苗中的应用。
说明书全文	一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用技术领域 [0001] 本发明属于疫苗领域，特别涉及一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用。背景技术 [0002] SARS‑CoV‑2是一种复杂的包膜单链RNA冠状病毒，与SARS‑CoV一样，SARS‑CoV‑2的刺突蛋白识别血管紧张素转换酶2(ACE2)作为细胞进入受体。通过高分辨率低温电子显微镜结构和界面突变扫描证实，关键的结合界面位于刺突蛋白受体结合域(RBD)上，因此，该蛋白区域是开发疫苗的理想靶点。然而，RBD亚单位作为候选疫苗的应用仍然受到其低免疫原性的阻碍，为了提高免疫原性，对RBD进行修饰以实现更大的抗原载体复合物尺寸或多聚化是目前的主要策略。针对COVID‑19大流行的疫苗开发工作广泛使用了抗原设计、抗原展示和疫苗递送的平台技术。 [0003] 疫苗的保护效力取决于它们诱导强效抗体反应的能力，因为中和抗体滴度被认为是保护的机制相关性。然而，疫苗诱导的T细胞激活同样重要。因此，了解疫苗引发的精确免疫机制对于确定其保护效力至关重要。在疫苗应答过程中，免疫会引发局部炎症和先天免疫细胞的浸润，包括抗原呈递细胞(APCs)，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)。APCs在免疫部位捕获抗原，迁移到引流淋巴结，并将处理过的肽抗原呈递到同源T细胞，随后增殖并分化为效应T细胞和记忆T细胞。传统的疫苗平台，包括灭活疫苗和减毒活疫苗，可能具有潜在的传染性，特别是对老年人和有基础疾病的成年人。相反，基于蛋白质的重组亚单位疫苗是安全的，但通常免疫原性较低且不理想，需要佐剂来诱导炎症。腺病毒疫苗是另一个成功的平台。然而，人类常见腺病毒血清型的流行以及免疫史可能会限制在新发传染病的疫苗开发中选择腺病毒血清型，以逃避预先存在的针对腺病毒载体本身的免疫。最近的mRNA疫苗显示出对SARS‑CoV‑2的高效保护，具有持久的抗体和T细胞反应。然而，炎症因子和相关效应分子对合成mRNA和脂质纳米颗粒的反应性质仍未得到解决并可能导致意想不到的副作用。相比之下，自组装或颗粒蛋白免疫原是一种临床验证的疫苗方式，在人类中具有经过验证的安全性和有效性。例如，针对人乳头瘤病毒(HPV)和乙型肝炎病毒(HBV)的病毒样颗粒(VLP)疫苗是已知最有效的亚单位疫苗之一，有数据表明，特别是HPV疫苗即使在接种一次疫苗后也能提供有效、持久的免疫。因此，一种适用于SARS‑COV‑2、且简单，快速，容易生产的纳米化抗原递送系统急需开发。发明内容 [0004] 针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗及其制备方法和应用，所述RBD纳米颗粒疫苗能够将RBD高密度的呈递在Nov的S结构域表面，自由的迁移到引流淋巴结中从而增强疫苗的效力。 [0005] 现有SARS‑COV‑2疫苗多为亚单位疫苗和灭活疫苗，与传统的亚单位疫苗相比，纳米颗粒疫苗已显示出增强的疫苗免疫反应和更大的免疫保护。重复性，高密度的蛋白抗原是提高免疫原性的重要因素，因为单体可溶性抗原与同源B细胞的BCRs相互作用有限。相反，高密度的表面蛋白导致与多种BCR更强的相互作用，从而促进BCR交联、下游信号级联的激活和强B细胞的激活。反过来，活化的B细胞可以与同源滤泡辅助T细胞(Tfh)相互作用，并接收型别转换、亲和成熟以及生成长寿命抗体分泌浆细胞和记忆B细胞所需的基本信号。 [0006] 除了抗原多价性外，其他包括纳米颗粒大小、电荷和流向引流淋巴结，也有助于疫苗效力。例如，纳米颗粒的大小控制着淋巴结的转运，20‑30nm的大小可以自由地转运到引流淋巴结，而更大的纳米颗粒从注射部位转运到淋巴结则严格需要APC。纳米颗粒疫苗的主要优势是它们能够调节这些特性，包括抗原多价性、大小、电荷和淋巴结运输，以改善抗体和T细胞反应，并最终提高疫苗效力。 [0007] 诺如病毒(Nov)是一种单正链RNA病毒，是目前世界上大多数国家引起急性胃肠炎的主要病毒病原体。诺如病毒的基因组长度约为7500个核苷酸，由三个开放阅读框(ORFs)组成。ORF2编码主要的帽膜蛋白VP1，通过X射线晶体学对Nov VP1的结构分析显示，全长的VP1由一个N端壳(S)域组成，通过一个短的、灵活的铰链与一个C端突出的(P)域相连。大肠杆菌表达系统具有细胞繁殖快速，产量高，成本低，IPTG诱导简便等优势，是重组蛋白最常用的蛋白表达系统。 [0008] 基于此在本发明中，将Nov的S结构域的C端与SARS‑CoV‑2的RBD区域融合，在大肠杆菌中表达可以将RBD暴露在表面，纯化可以得到自组装的S‑RBD纳米颗粒。此外，面对不断变异的SARS‑CoV‑2毒株，在不同的RBD序列与Nov的S融合后均能高效的装配成纳米颗粒，说明该策略可用于制备其他新兴的，突发的SARS‑CoV‑2的RBD纳米颗粒疫苗。 [0009] 为了实现上述发明目的，本发明第一方面提供了一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下步骤： [0010] 步骤1，利用基因工程技术将不同SARS‑CoV‑2毒株的RBD基因构建到诺如病毒(Nov)的S结构域的C端，得到表达单元，将所述表达单元克隆进入大肠杆菌质粒中得到重组质粒； [0011] 步骤2，将步骤1获得的重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，并在培养基中培养、诱导重组蛋白表达，蛋白诱导结束后离心收集细菌，细菌沉淀重悬于裂解缓冲液中，进行超声裂解，得到细菌裂解液； [0012] 步骤3，离心处理步骤2获得的细菌裂解液并收集上清，过滤后利用柱层析纯化得到均一的蛋白纳米颗粒，即为通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗。 [0013] 进一步的，步骤1中，所述SARS‑CoV‑2的RBD基因包括RBD‑Wuhan‑Hu‑1，RBD‑B.1.351和RBD‑B.1.617。 [0014] 进一步的，步骤1中，所述诺如病毒的S结构域的氨基酸序列如SEQ ID No1所示。 [0015] 进一步的，步骤1中，所述诺如病毒的S结构域的C端通过连接臂融合所述SARS‑CoV‑2的RBD序列，并在末端添加His tag标签。 [0016] 进一步的，步骤3中，所述柱层析纯化具体包括以下步骤： [0017] 先使用镍柱亲和层析对细菌裂解液进行纯化，并使用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白；洗脱后的目的蛋白再进行凝胶过滤层析，最终获得所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗。 [0018] 本发明第二方面提供前述第一方面所述方法制备得到的通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗。 [0019] 进一步的，所述RBD纳米颗粒疫苗的粒径为20nm～25nm。 [0020] 本发明第二方面提供前述第二方面所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗在制备SARS‑COV‑2相关疫苗中的应用。 [0021] 本发明相比现有技术的有益效果为： [0022] 本发明将诺如病毒(Nov)的S结构域与不同的SARS‑CoV‑2的RBD序列融合，在大肠杆菌表达纯化后，能高效组装成为均一的纳米颗粒，是一种通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗，装配效率高、纳米颗粒均一，粒径大小约为20nm～25nm，能够将RBD高密度的呈递在Nov的S结构域表面，因此该纳米疫苗可以自由的迁移到引流淋巴结中从而增强疫苗的效力。附图说明 [0023] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明： [0024] 图1为本发明实施例所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的结构组成示意图； [0025] 图2为本发明实施例所述通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗的透射电子显微镜(TEM)图片。具体实施方式 [0026] 实施例1——S‑RBD纳米疫苗的制备 [0027] 如图1所示，本实施例提供了通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗及其制备方法，所述制备方法为： [0028] 步骤1，利用基因工程技术将不同SARS‑CoV‑2毒株的RBD基因构建到诺如病毒(Nov)的S结构域的C端，得到表达单元，将所述表达单元克隆进入大肠杆菌质粒中得到重组质粒。 [0029] 具体操作为：在Nov的S结构域(1‑221氨基酸)的C端通过连接臂(GGGGS)融合RBD序列(RBD‑Wuhan‑Hu‑1，RBD‑B.1.351，RBD‑B.1.617)，并在末端添加6个His tag标签(HHHHHH)以方便纯化，最后分别以酶切位点Nde I和EcoRI构建在质粒pThioHisA中。 [0030] 所述SARS‑CoV‑2的RBD基因包括RBD‑Wuhan‑Hu‑1，RBD‑B.1.351和RBD‑B.1.617。 [0031] RBD‑Wuhan‑Hu‑1的氨基酸序列为： [0032] NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV。 [0033] RBD‑B.1.351的氨基酸序列为： [0034] NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV。 [0035] RBD‑B.1.617的氨基酸序列为： [0036] NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYRYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVQGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV。 [0037] 所述诺如病毒的S结构域的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示，氨基酸序列为： [0038] MKMASNDASPSDGSTANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPANAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKVIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIIVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDSTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVE。 [0039] 步骤2，将步骤1构建的重组质粒转化为大肠杆菌的感受态细胞中(BL21，DE3)，具体过程如下： [0040] (1)从‑80℃冰箱中取出大肠杆菌(BL21，DE3)感受态细胞100μl放在冰上融化；(2)待感受态细胞融化后，加入质粒20ng后混匀，在冰上放置30min；(3)将上述感受态细胞放入42℃水浴锅中热激50s后，迅速放回冰上3分钟，随后加入900μl LB培养基，并放在摇床上，转速为200rpm，40分钟。(4)将转化后的细胞均匀涂在氨苄青霉素抗性的固体LB培养基上，置于37℃培养箱过夜培养。 [0041] 挑选单克隆接种于LB培养基中，在37℃下以220rpm的速度振荡培养，直到OD600达到0.6。然后，向培养物中加入1mM的异丙基β‑D‑1‑硫代半乳糖苷(IPTG)，在恒温摇床上16℃诱导蛋白表达16小时，转速为200rpm。蛋白诱导结束后，诱导培养的细菌在4℃下6000rpm离心10min，然后收集细菌。将细胞重悬于冰冷的裂解缓冲液(0.01M PBS，500mM 氯化钠，pH 6.0)中，超声裂解，得到细菌裂解液。 [0042] 步骤3，在12000rpm离心20分钟后收集上清，通过0.45μm 过滤器过滤，然后使用填料Ni Sepharose 6Fast Flow(Cytiva)进行镍柱亲和层析纯化，并使用洗脱缓冲液(0.01M PBS，500mM氯化钠，500mM咪唑，PH 7.0)洗脱目的蛋白。洗脱后的目的蛋白最后用填料Sepharose 6Fast Flow(Cytiva)在组装缓冲液(0.01M PBS，500mM氯化钠，pH 6.0)进行凝胶过滤层析，得到均一的蛋白纳米颗粒，即为通用的SARS‑COV‑2的RBD纳米颗粒疫苗，分别获得S‑RBD(Wuhan‑Hu‑1)、S‑RBD(B.1.351)和S‑RBD(B.1.617)。 [0043] 实施例2——S‑RBD纳米疫苗的形态鉴定 [0044] 为确定纯化后的不同的S‑RBD蛋白是否自组装成均一的纳米颗粒，本实施例针对实施例1制备获得的S‑RBD(Wuhan‑Hu‑1)、S‑RBD(B.1.351)和S‑RBD(B.1.617)进行形态鉴定。 [0045] 使用透射电子显微镜(TEM)观察纳米颗粒的形态。如图2显示，纯化后的不同序列S‑RBD均组装成20nm～25nm的均一的纳米颗粒。 [0046] 最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

意见反馈