一种提取植物DNA的方法
| 热词 | dna 离心 漂洗 磁力 溶液 裂解 混匀 洗脱 洗脱液 澄清 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202310226741.0 | 申请日 | 2023-03-10 |
| 公开(公告)号 | CN116042606A | 公开(公告)日 | 2023-05-02 |
| 申请人 | 上海美吉生物医药科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 梁婷婷; 董亚晨; | 第一发明人 | 梁婷婷 |
| 权利人 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：上海市浦东新区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：上海市浦东新区康新公路3399弄3号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：201321 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 ; C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京品源专利代理有限公司 | 专利代理人 | 王艳斋; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种提取 植物 DNA的方法。所述方法包括：将 研磨 后的植物组织样品与裂解缓冲液混合，加热孵育，离心获取上清液，将所述上清液与沉淀液混合低温处理，再次离心获取最终上清液，进行分离纯化处理，得到DNA，所述裂解缓冲液含有： 醋酸 盐、 乙二胺四乙酸 二钠、十二烷基 硫酸 钠、聚乙烯吡咯烷 酮 和 氯化钠 。本发明的方法提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA 质量 的要求，该方法提取的DNA可以获得较多大 片段 、纯度和核酸总量都较高，此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点，适合大规模的推广和应用。 | ||
| 权利要求 | 1.一种提取植物DNA的方法，其特征在于，所述方法包括： |
||
| 说明书全文 | 一种提取植物DNA的方法技术领域背景技术[0002] 近年来Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies、Bionano Genomics和10x Genomics等公司的长读长测序技术越来越受欢迎，随着相关技术的推广应用，而获得大片段、高纯度、高含量和高完整性的基因组DNA显得尤为重要。高质量DNA分子(high‑molecular‑weight DNA)是指片段长度在200bp‑1Mb之间，目前已应用于基因组测序、甲基化研究和突变鉴定等多个研究领域。 [0003] 传统DNA提取方法获得的DNA片段长度在50kb左右，很少有大片段DNA，而以NanoPore、PacBio为代表的三代测序平台具有长读长的优点，三代测序技术对DNA质量要求较高，即：OD260/280比值范围在1.7‑2.0，OD260/230比值范围在1.6‑2.0；Nanodrop/Qubit比值范围在1.5以下；浓度大于等于10ng/μL；DNA总量大于等于5μg。传统的DNA提取方法产生的DNA片段长度、纯度及完整性较难满足测序平台要求，因此需要获得高质量DNA。 [0004] 植物DNA提取多采用的是新鲜或冷冻状态保存的组织，但是涉及到野外采集特别是距离较远的山林采集样本时就受到液氮或冰壶携带不方便，这时候硅胶干燥样本便于携带的优势就较为凸显。目前常用的DNA提取方法有CTAB法、SDS法和试剂盒法，均可以适用于新鲜或冷冻样本核酸提取，但是提取时间较长，都要使用有毒有机物进行提取，比如氯仿、苯酚、异戊醇被用于去除蛋白质和多糖杂质，β‑巯基乙醇多用于防止酚类物质氧化，其中氯仿和β‑巯基乙醇易挥发，进入人体后易引起中毒，这些有机物质不仅会对人体产生伤害，而且对环境造成危害。植物干燥样本产生的次级代谢物质常与核酸形成复合物，DNA被包裹在这些粘稠的胶状物质中难以溶解分离出来，并且会产生不同成都的褐变，导致抽提结果较差，因此急需寻找解决方法。 [0005] CN105505916A公开了从海人树干燥叶片中提取高质量基因组DNA的方法及试剂盒，所述方法包括对干燥叶片细胞研磨破碎，两步法抽提DNA、杂质的去除以及DNA的纯化，所述方法能够有效的去除干燥组织样本中富含的多酚、多糖等次生代谢产物，最终获得高质量的基因组DNA，但是所述方法需要使用氯仿、苯酚和异戊醇等有机物质，进入人体后易引起中毒，不仅会对人体产生伤害，而且对环境造成危害。 [0006] CN109652403A公开了一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，所述方法包括干燥叶片研磨、去糖、裂解、抽提、沉淀、洗涤和检测等步骤。其中，去糖是此发明的关键，在核膜没有裂解释放出基因组DNA之前，加入预热的去糖缓冲液，在65℃水浴条件下悬浮叶片组织溶液，可以使多糖及其他次生代谢物质溶解于缓冲液中，再通过低速离心去除多糖等杂质，使最后沉淀得到DNA的具有较高的浓度和纯度。但是此方法得到的DNA片段大小集中于40K～60K之间，难以满足测序平台的要求。 [0007] 综上所述，目前提取植物干燥叶片DNA的方法存在使用氯仿、苯酚和异戊醇有毒有机物，危害人体和环境，DNA片段长度在50kb左右，很少有大片段DNA，难以得到高质量DNA，难以满足测序平台需要等问题。如何提供一种高效便捷的提取植物干燥叶片DNA的方法，获得高效率、高质量和高纯度的DNA，满足三代测序平台对DNA质量的要求，已成为目前分子生物学技术领域亟待解决的问题之一。 发明内容[0008] 针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种提取植物DNA的方法，解决了目前提取植物DNA的方法使用有毒有机试剂、难以获得高质量DNA等问题，达到了高效率获得高质量和高纯度的DNA，满足三代测序平台对DNA质量的要求的效果。 [0009] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案： [0010] 第一方面，本发明提供了一种提取植物DNA的方法，所述方法包括： [0011] 将研磨后的植物组织样品与裂解缓冲液混合，加热孵育，离心获取上清液，将所述上清液与沉淀液混合并进行低温处理，再次离心获取最终上清液，进行分离纯化处理，得到DNA，所述裂解缓冲液含有：醋酸盐、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠，所述沉淀液含有醋酸盐。 [0012] 本发明提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求，该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高，此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点，适合大规模的推广和应用。 [0013] 优选地，所述分离纯化处理具体包括： [0014] 向最终上清液中加入异丙醇和羟基磁珠溶液进行核酸吸附，用漂洗液漂洗磁珠，用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液，向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化，收集磁珠，用漂洗液漂洗磁珠，用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA溶液。 [0015] 优选地，所述植物组织样品包括干燥叶片。 [0016] 优选地，所述研磨在液氮环境中进行。 [0017] 优选地，所述裂解缓冲液的pH为4.0‑6.5。 [0018] 上述4.0‑6.5中的具体点值可以选择4.0、4.5、5、5.5、6、6.5等。 [0019] 优选地，所述裂解缓冲液中所述醋酸盐的浓度为20‑200mM。 [0020] 上述20‑200中的具体点值可以选择20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、100、160、180、200等。 [0021] 优选地，所述裂解缓冲液中所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为20‑300mM。 [0022] 上述20‑300中的具体点值可以选择20、25、30、65、80、100、150、160、270、280、290、300等。 [0023] 优选地，所述裂解缓冲液中所述十二烷基硫酸钠质量百分比为0.5‑5％。 [0024] 上述0.5‑5中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3、4、5等。 [0025] 优选地，所述裂解缓冲液中所述聚乙烯吡咯烷酮质量体积百分比为0.5‑5％。 [0026] 上述0.5‑5中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3、4、5等。 [0027] 优选地，所述裂解缓冲液中所述氯化钠的浓度为200‑1500mM。 [0028] 上述200‑1500中的具体点值可以选择200、400、600、800、1000、1200、1500等。 [0029] 优选地，所述裂解缓冲液中所述醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵中任意一种。 [0030] 优选地，所述裂解缓冲液中所述聚乙烯吡咯烷酮包括PVP K30、PVP K10或PVP 40中任意一种。 [0031] 优选地，所述沉淀液中醋酸盐包括醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵中任意一种。 [0032] 优选地，所述植物组织样品与裂解缓冲液的质量体积比为1g:(3‑10)mL。 [0033] 上述3‑10中的具体点值可以选择3、5、7、8、9、10等。 [0034] 优选地，所述低温处理包括：3‑10℃条件下放置5‑30min；所述离心和再次离心的条件各自独立地为于0‑8℃、10000‑17000rpm离心5‑25min。 [0035] 上述3‑10中的具体点值可以选择3、5、7、8、9、10等。 [0036] 上述0‑8中的具体点值可以选择0、2、4、6、7、8等。 [0037] 上述10000‑17000中的具体点值可以选择10000、12000、13000、14000、15000、16000、17000等。 [0038] 上述5‑25中的具体点值可以选择5、6、7、10、15、16、17、18、20、25等。 [0039] 优选地，所述漂洗液包括体积分数为70‑85％的乙醇，所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯水，所述RNA酶的质量百分比为0.5‑3％，RNA酶的浓度为10‑50mg/mL，所述第二洗脱液为超纯水，pH为6.5‑8.0。 [0040] 上述70‑85中的具体点值可以选择70、75、77、78、79、80、81、82、83、85等。 [0041] 上述0.5‑3中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3等。 [0042] 上述10‑50中的具体点值可以选择10、20、30、40、45、50等。 [0043] 上述6.5‑8.0中的具体点值可以选择6.5、7、7.5、8等。 [0044] 优选地，所述羧基磁珠溶液在使用前经过20‑35℃孵育30‑60min。 [0045] 上述20‑35中的具体点值可以选择20、21、25、28、30、35等。 [0046] 作为优选的技术方案，所述提取植物DNA的方法具体包括以下步骤： [0047] (1)将研磨后的样品组织与裂解缓冲液混合，加热孵育，离心获取上清液，将所述上清液与沉淀液混合并进行低温处理，再次离心获取最终上清液，所述裂解缓冲液含有：醋酸盐、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基硫酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和氯化钠； [0048] (2)向最终上清液中加入异丙醇和羟基磁珠溶液进行核酸吸附，用漂洗液漂洗磁珠，用第一洗脱液进行洗脱获得DNA粗提液； [0049] (3)向DNA粗提液中加入羧基磁珠溶液进行纯化，收集磁珠，用漂洗液漂洗磁珠，用第二洗脱液进行洗脱获得高质量DNA溶液； [0050] 所述漂洗液包括体积分数为70‑85％的乙醇，所述第一洗脱液包括含有RNA酶的超纯水，所述RNA酶的质量百分比为0.5‑3％，RNA酶的浓度为10‑50mg/mL，所述第二洗脱液为超纯水，pH为6.5‑8.0。 [0051] 上述70‑85中的具体点值可以选择70、75、77、78、79、80、81、82、83、85等。 [0052] 上述0.5‑3中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、1.7、1.8、2、2.5、3等。 [0053] 上述10‑50中的具体点值可以选择10、20、30、40、45、50等。 [0054] 上述6.5‑8.0中的具体点值可以选择6.5、7、7.5、8等。 [0055] 优选地，步骤(1)中所述沉淀液的体积为上清液的0.1‑0.7倍。 [0056] 上述0.1‑0.7中的具体点值可以选择0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7等。 [0057] 优选地，步骤(2)中所述异丙醇的体积为最终上清液的0.6‑1倍。 [0058] 上述0.6‑1中的具体点值可以选择0.6、0.7、0.8、0.9、1等。 [0059] 优选地，步骤(3)中所述羧基磁珠溶液为最终上清液的0.5‑1倍。 [0060] 上述0.5‑1中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。 [0061] 第二方面，本发明提供了第一方面所述的提取植物DNA的方法在提取植物DNA中的应用。 [0063] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： [0064] (1)本发明中的提取植物DNA的方法可用于芋头、铁苋菜、玉簪和艾草等植物干燥或新鲜叶片总DNA提取，采样不受液氮和冰壶的限制，可进行大批量样品常温采集，减少样品保鲜保存工作量，适用范围广； [0065] (2)本发明的提取方法避免采用氯仿、苯酚、β‑巯基乙醇等有毒有机物，对操作者的健康无损害，对环境的污染程度很小。采用的试剂均为常规的化学试剂，降低了提取成本； [0066] (3)本发明提供的提取植物DNA的方法提取DNA的纯度高，完整性好，总量高，可三代测序平台对DNA的质量要求，且提取工艺简单，适合大规模的推广和应用； [0067] (4)本发明无论在DNA质量还是总量上都可以较好的完成，pH为4.0‑6.5酸性提取液可以避免多酚类物质进一步氧化，同时利用PVP结合酚类物质，防止核酸褐变，高浓度的K+有利于SDS与蛋白质及多糖形成复合物，复合物经离心即可去除，可彻底去除蛋白质和多糖杂质，纳米磁珠颗粒具有较强的核酸捕获能力和洗脱效率，在快速吸磁的同时，能够保持良好的分散性和极低的非特异性吸附。 附图说明 [0069] 图2为实施例5‑7获得的DNA的琼脂糖凝胶电泳质检结果图。 具体实施方式[0070] 为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。 [0072] 实施例1 [0073] 以芋头叶片为样品，提取高质量DNA，该样品中蛋白质、多酚和多糖含量较高。 [0074] 裂解缓冲液：醋酸钠80mM，pH＝5.0，乙二胺四乙酸二钠20mM，十二烷基硫酸钠2％，聚乙烯吡咯烷酮3％，氯化钠1.5M。 [0075] 沉淀液：醋酸钾3M，pH＝5.0。 [0076] 漂洗液Ⅰ：80％无水乙醇。 [0077] 洗脱液Ⅰ：超纯水(含2％RNA酶)。 [0078] 漂洗液Ⅱ：75％无水乙醇。 [0079] 洗脱液Ⅱ：超纯水pH＝7.0。 [0080] (1)细胞裂解 [0082] (2)核酸分离纯化 [0083] 样品与裂解缓冲液混合，放置于55℃金属浴中孵育50min，期间颠倒混匀，在4℃条件下12000rpm离心20min，离心后转移上清溶液至离心管中，加入0.5倍体积沉淀液，混匀后4℃条件下放置20min，4℃12000rpm离心20min，取上清溶液。 [0084] (3)核酸吸附沉淀 [0085] 加入上清溶液1倍体积异丙醇，再加入20μL羟基磁珠溶液，混匀后25℃放置30min，然后将离心管转移至磁力架上，吸磁30s至溶液澄清，吸弃上清，从磁力架上取下离心管，加入800μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清，再次从磁力架上取下离心管，加入800μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清，将离心管置于磁力架上，打开离心管盖，对离心管内的磁珠25℃干燥，至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光，向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ(RNA酶含量为3％)，涡旋混匀，放置于60℃金属浴孵育10min，孵育结束后，涡旋震荡离心管，然后将离心管置于磁力架上磁吸磁20s至溶液澄清，小心转移上清至离心管中。 [0086] (4)核酸二次纯化 [0087] 向步骤(3)最终得到的上清溶液中加入0.5倍体积的羧基磁珠溶液，使用移液枪轻轻吸打充分混匀，25℃孵育30min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清，保持样品始终处于磁力架上，加入500μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清，重复(13)操作一次，共漂洗两次；重复保持样品始终处于磁力架上，加入500μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清，保持样品始终处于磁力架上，25℃下开盖干燥磁珠约8min，加入100μL洗脱液Ⅱ，涡旋振荡混匀，25℃静置20min，在磁力架上静置10min，待溶液澄清后，小心吸取上清至新的离心管中，即可获得高质量DNA溶液。 [0089] 实施例2 [0091] 裂解缓冲液：醋酸钠20mM，pH＝4.0，乙二胺四乙酸二钠20mM，十二烷基硫酸钠0.5％，聚乙烯吡咯烷酮0.5％，氯化钠200mM。 [0092] 沉淀液：醋酸钠2.5M，pH＝4.0。 [0093] 漂洗液Ⅰ：70％无水乙醇。 [0094] 洗脱液Ⅰ：超纯水(含0.5％RNA酶)。 [0095] 漂洗液Ⅱ：70％无水乙醇。 [0096] 洗脱液Ⅱ：超纯水pH＝7.0。 [0097] (1)细胞裂解 [0098] 称取干燥叶片0.15g，加钢珠放置于打磨管中，先在液氮中预冷，然后在高通量组织研磨仪中进行研磨，设置研磨参数：研磨频率为45HZ，研磨时间为20s，研磨3次。 [0099] (2)核酸分离纯化 [0100] 样品与裂解缓冲液混合，放置于65℃金属浴中孵育30min，期间颠倒混匀，在4℃条件下11000rpm离心10min，离心后转移上清溶液至离心管中，加入0.3倍体积沉淀液，混匀后4℃条件下放置20min，4℃11000rpm离心10min，取上清溶液。 [0101] (3)核酸吸附沉淀 [0102] 加入上清溶液0.8倍体积异丙醇，再加入10μL羟基磁珠溶液，混匀后25℃放置15min，然后将离心管转移至磁力架上，吸磁20s至溶液澄清，吸弃上清，从磁力架上取下离心管，加入600μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清，重复从磁力架上取下离心管，加入600μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清一次，将离心管置于磁力架上，打开离心管盖，对离心管内的磁珠25℃干燥，至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光，向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ(RNA酶含量为2％)，涡旋混匀，放置于65℃金属浴孵育10min，孵育结束后，涡旋震荡离心管，然后将离心管置于磁力架上磁吸磁20s至溶液澄清，小心转移上清至离心管中。 [0103] (4)核酸二次纯化 [0104] 向步骤(3)最终得到的上清溶液中加入0.8倍体积的羧基磁珠溶液，使用移液枪轻轻吸打充分混匀，25℃孵育20min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清，保持样品始终处于磁力架上，加入600μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清，重复保持样品始终处于磁力架上，加入600μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清操作一次，共漂洗两次，保持样品始终处于磁力架上，25℃下开盖干燥磁珠约10min，加入150μL洗脱液Ⅱ，涡旋振荡混匀，25℃静置20min，在磁力架上静置 5min，待溶液澄清后，小心吸取上清至新的离心管中，即可获得高质量DNA溶液。 [0105] 超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示，琼脂糖凝胶电泳(电泳检测参数：琼脂糖凝胶浓度：0.7％琼脂糖；电压：300V；时间：30min。)质检结果如图1中2号条带所示。 [0106] 实施例3 [0107] 以铁苋菜叶片为样品，提取高质量DNA，该样品富含生物碱、甾醇、酰胺、糖苷和酚。 [0108] 裂解缓冲液：醋酸铵200mM，pH＝6.5，乙二胺四乙酸二钠300mM，十二烷基硫酸钠5％，聚乙烯吡咯烷酮5％，氯化钠1500mM。 [0109] 沉淀液：醋酸钾2.5M，pH＝4.8。 [0110] 漂洗液Ⅰ：85％无水乙醇。 [0111] 洗脱液Ⅰ：超纯水(含3％RNA酶)。 [0112] 漂洗液Ⅱ：85％无水乙醇。 [0113] 洗脱液Ⅱ：超纯水pH＝7.5。 [0114] (1)细胞裂解 [0115] 称取干燥叶片0.2g，加钢珠放置于打磨管中，先在液氮中预冷，然后在高通量组织研磨仪中进行研磨，设置研磨参数：研磨频率为50HZ，研磨时间为20s，研磨1次。 [0116] (2)核酸分离纯化 [0117] 样品与裂解缓冲液混合，放置于50℃金属浴中孵育250min，期间颠倒混匀，在4℃条件下13000rpm离心15min，离心后转移上清溶液至离心管中，加入0.5倍体积沉淀液，混匀后4℃条件下放置15min，4℃13000rpm离心15min，取上清溶液。 [0118] (3)核酸吸附沉淀 [0119] 加入上清溶液0.6倍体积异丙醇，再加入30μL羟基磁珠溶液，混匀后25℃放置20min，然后将离心管转移至磁力架上，吸磁20s至溶液澄清，吸弃上清，从磁力架上取下离心管，加入700μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清，重复从磁力架上取下离心管，加入700μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清操作一次，将离心管置于磁力架上，打开离心管盖，对离心管内的磁珠25℃干燥，至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光，向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ(RNA酶含量为1％)，涡旋混匀，放置于50℃金属浴孵育5min，孵育结束后，涡旋震荡离心管，然后将离心管置于磁力架上磁吸磁20s至溶液澄清，小心转移上清至离心管中。 [0120] (4)核酸二次纯化 [0121] 向步骤(3)最终得到的上清溶液中加入1倍体积的羧基磁珠溶液，使用移液枪轻轻吸打充分混匀，25℃孵育20min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清，保持样品始终处于磁力架上，加入700μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清，重复保持样品始终处于磁力架上，加入700μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清操作一次，共漂洗两次，保持样品始终处于磁力架上，25℃下开盖干燥磁珠约15min，加入80μL洗脱液Ⅱ，涡旋振荡混匀，25℃静置15min，在磁力架上静置5min，待溶液澄清后，小心吸取上清至新的离心管中，即可获得高质量DNA溶液。 [0122] 超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示，琼脂糖凝胶电泳(电泳检测参数：琼脂糖凝胶浓度：0.7％琼脂糖；电压：300V；时间：30min。)质检结果如图1中3号条带所示。 [0123] 实施例4 [0124] 以玉簪叶片为样品，提取高质量DNA，该样品富含香豆精类、三萜、多糖和氨基酸。 [0125] 裂解缓冲液：醋酸钠100mM，pH＝4.5，乙二胺四乙酸二钠40mM，十二烷基硫酸钠2％，聚乙烯吡咯烷酮1％，氯化钠1.0M。 [0126] 沉淀液：醋酸钾3M，pH＝5.0。 [0127] 漂洗液Ⅰ：80％无水乙醇。 [0128] 洗脱液Ⅰ：超纯水(含2％RNA酶)。 [0129] 漂洗液Ⅱ：80％无水乙醇。 [0130] 洗脱液Ⅱ：超纯水pH＝8.0。 [0131] (1)细胞裂解 [0132] 称取干燥叶片0.2g，加钢珠放置于打磨管中，先在液氮中预冷，然后在高通量组织研磨仪中进行研磨，设置研磨参数：研磨频率为55HZ，研磨时间为20s，研磨2次。 [0133] (2)核酸分离纯化 [0134] 样品与裂解缓冲液混合，放置于50℃金属浴中孵育250min，期间颠倒混匀，在4℃条件下12000rpm离心15min，离心后转移上清溶液至离心管中，加入0.5倍体积沉淀液，混匀后4℃条件下放置15min，4℃12000rpm离心15min，取上清溶液。 [0135] (3)核酸吸附沉淀 [0136] 加入上清溶液0.7倍体积异丙醇，再加入20μL羟基磁珠溶液，混匀后25℃放置15min，然后将离心管转移至磁力架上，吸磁20s至溶液澄清，吸弃上清，从磁力架上取下离心管，加入800μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清，重复从磁力架上取下离心管，加入800μL漂洗液Ⅰ，涡旋混匀10s，将离心管置于磁力加上，吸磁10s至溶液澄清，吸弃上清操作一次，将离心管置于磁力架上，打开离心管盖，对离心管内的磁珠25℃干燥，至羟基磁性纳米颗粒表面无泛光，向离心管中加入200μL洗脱液Ⅰ(RNA酶含量为2％)，涡旋混匀，放置于50℃金属浴孵育15min，孵育结束后，涡旋震荡离心管，然后将离心管置于磁力架上磁吸磁20s至溶液澄清，小心转移上清至离心管中。 [0137] (4)核酸二次纯化 [0138] 向步骤(3)最终得到的上清溶液中加入0.5倍体积的羧基磁珠，使用移液枪轻轻吸打充分混匀，25℃孵育15min，使DNA结合到磁珠上，将样品置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移除上清，保持样品始终处于磁力架上，加入700μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清，重复保持样品始终处于磁力架上，加入700μL漂洗液Ⅱ，漂洗磁珠，25℃孵育20s，小心移除上清操作一次，共漂洗两次，保持样品始终处于磁力架上，25℃下开盖干燥磁珠约15min，加入100μL洗脱液Ⅱ，涡旋振荡混匀，25℃静置15min，在磁力架上静置5min，待溶液澄清后，小心吸取上清至新的离心管中，即可获得高质量DNA溶液。 [0139] 超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示，琼脂糖凝胶电泳(电泳检测参数：琼脂糖凝胶浓度：0.7％琼脂糖；电压：300V；时间：30min。)质检结果如图1中4号条带所示。 [0140] 实施例5 [0141] 本实施例与实施例1的区别仅在于：沉淀液改为醋酸钠3M，pH＝5.0。 [0142] 超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示，琼脂糖凝胶电泳(电泳检测参数：琼脂糖凝胶浓度：0.7％琼脂糖；电压：300V；时间：30min。)质检结果如图2中5号条带所示。 [0143] 实施例6 [0144] 本实施例与实施例1的区别仅在于：沉淀液改为醋酸铵3M，pH＝5.0。 [0145] 超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示，琼脂糖凝胶电泳(电泳检测参数：琼脂糖凝胶浓度：0.7％琼脂糖；电压：300V；时间：30min。)电泳质检结果如图2中6号条带所示。 [0146] 实施例7 [0147] 本实施例与实施例1的区别仅在于：裂解缓冲液中十二烷基硫酸钠质量百分比改为0.2％，裂解缓冲液中聚乙烯吡咯烷酮质量百分比改为0.3％。 [0148] 超微量紫外光分光光度计检测结果如表1所示，琼脂糖凝胶电泳(电泳检测参数：琼脂糖凝胶浓度：0.7％琼脂糖；电压：300V；时间：30min。)质检结果如图2中7号条带所示。 [0149] 表1 [0150] [0151] 由表1结果可知利用本发明方法中的裂解液提取的DNA总量高；260/280以及260/230比值高，说明本方法得到的DNA蛋白质、糖类、盐等杂质含量少，纯度高；此外实施例5和实施例6和实施例1相比可知沉淀液选用醋酸钾溶液效果更优于醋酸钠和醋酸铵；实施例7和实施例1相比裂解缓冲液中十二烷基硫酸钠和聚乙烯吡咯烷酮质量百分比改为不在比例范围内，结果不能满足三代测序上机检测的要求；图1结果表明该参数下提取获得的DNA能够满足三代测序上机检测的要求，图2结果表明该参数下实施例5和6提取获得的DNA能够满足三代测序上机检测的要求，实施例7提取获得的DNA不能够满足三代测序上机检测的要求。 [0152] 综上所述，本发明的方法提取获得的DNA满足三代测序平台对DNA质量的要求，该方法提取的DNA可以获得较多大片段、纯度和核酸总量都较高，此方法具有成本低、步骤简单、安全高效等优点，适合大规模的推广和应用。 |
||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈