| 热词 | dna 基因组 基因 裂解 离心 od260 提取 13000rpm 细胞 水稻 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202310052831.2 | 申请日 | 2023-02-03 |
| 公开(公告)号 | CN115976013A | 公开(公告)日 | 2023-04-18 |
| 申请人 | 核小体(北京)生物技术有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 李艳艳; | 第一发明人 | 李艳艳 |
| 权利人 | 核小体(北京)生物技术有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 核小体(北京)生物技术有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：北京市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：北京市昌平区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：北京市昌平区科技园区振兴路36号院2号楼2M-15号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：102299 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京集智东方知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 陈亚斌; 陈攀; |
| 摘要 | 本 发明 提供了一种 植物 基因组DNA快速提取 试剂 盒 及提取DNA的方法，涉及 生物 技术领域，包括：裂解液、除杂液、DNA助提剂、漂洗液、洗脱缓冲液、离子 吸附 柱和收集管；所述DNA助提剂包括100‑150mMNaCl、10％‑15％三氯乙酸、0.5％‑1％Tween‑20，pH5‑6。本发明的试剂盒中各试剂均能发挥其独特的专一性。本发明通过独特的裂解液、除杂液、DNA助提剂三种试剂相互作用，能够快速高效、稳定的提取基因组DNA，是一种高效、快速、无毒且稳定的植物基因组DNA提取试剂盒。所用试剂均是分子生物学实验室的常见试剂，成本低、无毒性、安全性好并且方法简便快速，在室温即可完成。 | ||
| 权利要求 | 1.一种植物基因组DNA快速提取试剂盒，其特征在于，包括：裂解液、除杂液、DNA助提剂、漂洗液、洗脱缓冲液、离子吸附柱和收集管； |
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| 说明书全文 | 一种植物基因组DNA快速提取试剂盒及提取DNA的方法技术领域背景技术[0002] 目前普遍应用的植物基因组DNA的提取方法的原理：低温液氮条件下研磨植物的不同组织，保证样品DNA的稳定性。通过在提取缓冲液中加入十二烷基肌酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠等离子型表面活性剂，能够溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，将DNA游离出来。加入抗氧化剂或还原剂β‑巯基乙醇、二硫苏糖醇降低酶类的活性。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性，通过几次离心和有机溶剂的抽提，再用无水乙醇沉淀DNA、晾干、溶解，最终获得植物基因组DNA。使用传统方法提取DNA浓度高，但不能保证基因组DNA的质量，大大降低了DNA的反应效率。同时，传统方法的实验步骤繁琐且涉及氯仿等危化品的多次使用，影响实验者的健康、污染环境、实验成本高。 发明内容[0003] 本发明的目的在于提供一种植物基因组DNA快速提取试剂盒及提取DNA的方法，以解决上述问题。为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下： [0004] 本申请提供了一种植物基因组DNA快速提取试剂盒，包括：裂解液、除杂液、DNA助提剂、漂洗液、洗脱缓冲液、离子吸附柱和收集管；所述DNA助提剂包括100‑150mM NaC l、10％‑15％三氯乙酸、0.5％‑1％Tween‑20，pH 5‑6。 [0005] 本申请还提出了一种提取DNA的方法，包括步骤： [0006] 制备样品：取新鲜组织100mg或干重组织20mg的植物组织放入研钵，在研钵中加入液氮充分碾磨成粉末状，得到样品； [0007] 裂解细胞：将样品移到第一离心管，加入400μL裂解液，混匀； [0008] 温浴：将所述第一离心管65℃水浴，10m i n； [0009] 分离基因组DNA：往所述第一离心管加入DNA助提剂20μL后混匀，13000rpm离心5m i n，将上清液移入第二离心管； [0010] 除杂质：第二离心管加入150μL除杂液，充分混匀，13000rpm离心5mi n，弃沉淀； [0011] 上柱：将所述第二离心管的上清液加入离子吸附柱中，13000rpm离心30s，弃废液；每一次上柱加入离子吸附柱的上清液不超过650μL； [0012] 漂洗：向所述离子吸附柱加入600μL漂洗液，13000rpm离心30s，弃废液，重复漂洗一次； [0013] 晾干：将离子吸附柱13000rpm离心2m i n； [0014] 洗脱DNA：将离子吸附柱放入第三离心管中，在离子吸附柱的中间加入50μL‑100μL的洗脱缓冲液，室温放置2m i n后，13000rpm离心1mi n，弃废液，得到基因组DNA。 [0015] 本发明的有益效果为： [0016] 本发明的试剂盒中各试剂均能发挥其独特的专一性。本发明通过独特的裂解液、除杂液、DNA助提剂三种试剂相互作用，能够快速高效、稳定的提取基因组DNA。所述裂解液中的各组分协同增效，能够破坏细胞壁快速渗透细胞，并溶解细胞，释放基因组DNA并维持其稳定性。所述DNA助提剂，一方面可以有效除去植物细胞在裂解后所释放的多酚、多糖、萜类物质和膜蛋白等。同时，DNA助提剂可以保护基因组DNA，防止反应时间过长造成DNA二聚化。最后除杂液迅速溶解膜蛋白后，破坏蛋白质的结构。 [0017] 本发明的其他特征和优点将在随后的说明书阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明实施例了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书，以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。 附图说明[0018] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。 [0019] 图1为本发明实施例三不同植物器官利用本发明提出的试剂盒所获得的基因组DNA在1％琼脂糖凝胶下的电泳图，以及实施例四所获基因组DNA为模板的PCR扩增后的电泳图。 [0020] 图2为实施例五同一样品在不同裂解液下提取的基因组DNA在1％琼脂糖凝胶下的电泳图。 [0021] 图中标记： [0022] F1、F2、F3表示三组以水稻幼叶的基因组DNA为模板进行1％琼脂糖凝胶下的电泳的分组编号； [0023] R1、R2、R3表示三组以水稻幼根的基因组DNA为模板进行1％琼脂糖凝胶下的电泳的分组编号； [0024] M1：5K DNA Marker(核小体生物技术有限公司，北京)； [0025] a、b、c、d、e、f表示PCR扩增的不同泳道编号； [0026] A1、A2、A3表示使用裂解液A(含有1M山梨醇)提取的基因组DNA的电泳条带的分组编号； [0027] B1、B2、B3表示使用裂解液B(无山梨醇)提取的基因组DNA的电泳条带的分组编号； [0028] M2：2K p l us DNA Marker(全式金生物技术有限公司)。 具体实施方式[0029] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0030] 应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。同时，在本发明的描述中，术语“第一”“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。 [0031] 实施例一： [0032] 一种植物基因组DNA快速提取试剂盒，包括：裂解液、除杂液、DNA助提剂、漂洗液、洗脱缓冲液、离子吸附柱和收集管； [0033] 所述DNA助提剂包括100‑150mM NaC l、10％‑15％三氯乙酸、0.5％‑1％Tween‑20，pH 5‑6。所述DNA助提剂可以防止植物细胞中的多酚污染并且可去除多糖、萜类物质，并且破坏膜蛋白。 [0034] 所述裂解液包括0.2M NaOH、1M山梨醇和100mM Tr i s‑HC l，所述裂解液pH 5‑6。 [0035] 所述裂解液还包括10mg/m l RNaseA、50‑100mM EDTA。所述裂解液能够破坏细胞壁快速渗透细胞，并溶解细胞，释放基因组DNA并维持基因组DNA的稳定性。 [0036] 所述除杂液包括5.5M GuHC l、2M‑3M硫脲和30％‑40％无水乙醇，所述除杂液pH 5‑6。所述除杂液主要目的是除去不溶或变性蛋白质。 [0037] 所述漂洗液包括70％‑80％无水乙醇，pH 6‑8。 [0038] 所述洗脱缓冲液包括1mM‑3mM Tr i s‑HC l，pH 7.5‑8.5。 [0039] 本申请的试剂盒中各试剂均能发挥其独特的专一性。所述裂解液中的各组分协同增效，能够破坏细胞壁快速渗透细胞，并溶解细胞，释放基因组DNA并维持其稳定性。裂解液中的氢氧化钠可使细胞迅速裂解，而山梨醇在NaOH的作用下可以很好的渗透细胞，并且不会因为强碱的条件造成细胞内基因组DNA的断裂，反而在强碱的作用下山梨醇使得细胞释放大量的基因组DNA。释放的DNA通过Tr i s‑HC l提供稳定的缓冲条件。由于细胞内有15％‑20％的核酸RNA，本裂解液在使用前加入RNaseA可有效降解RNA，同时添加EDTA可保护RNaseA的活性。 [0040] 其后，在提取植物基因组DNA时定要加入本发明的DNA助提剂，一方面可以有效除去植物细胞在裂解后所释放的多酚、多糖、萜类物质和膜蛋白等。其中三氯乙酸在多糖和蛋白混合物中发挥作用，可使蛋白和多糖聚合物沉淀并去除；而Tween‑20能够破坏细胞膜及溶解膜内的蛋白，从而有效提高基因组DNA的提取效率。同时，加入DNA助提剂可以保护基因组DNA，防止反应时间过长造成DNA二聚化。 [0041] 最后在除杂液的作用下除去不溶或变性蛋白质，通过离心后去除杂质。其中，发挥主要作用的成分硫脲和盐酸胍，硫脲是迅速溶解膜蛋白后，GuHC l破坏蛋白质的结构。两者共同作用从而除去蛋白杂质。 [0043] 实施例二： [0044] 一种提取DNA的方法，需要提前准备，离心机、1.5m l无菌离心管、无水乙醇、水浴锅或金属浴、移液器、分光光度计Nanodrop(ND‑1000，Thermo F i sher Sc i ent i f i c，USA)。包括步骤： [0045] 制备样品：取新鲜组织100mg或干重组织20mg的植物组织放入研钵，在研钵中加入液氮充分碾磨成粉末状，得到样品； [0046] 裂解细胞：将样品移到第一离心管，加入400μL裂解液，旋涡振荡进行混匀； [0047] 温浴：将所述第一离心管65℃水浴，10m i n，反应过程中颠倒离心管2‑3次，混合样品； [0048] 分离基因组DNA：往所述第一离心管加入DNA助提剂20μL后混匀，并上下旋转离心管8‑10次，13000rpm离心5m i n，将上清液移入第二离心管； [0049] 除杂质：第二离心管加入150μL除杂液，充分混匀，13000rpm离心5mi n，弃沉淀； [0050] 上柱：将所述第二离心管的上清液加入离子吸附柱中，13000rpm离心30s，弃废液；此步骤可分次进行上柱，每一次上柱加入离子吸附柱的上清液不超过650μL； [0051] 漂洗：向所述离子吸附柱加入600μL漂洗液，13000rpm离心30s，弃废液，重复漂洗一次，该步骤有效去除盐溶液和其他杂质； [0052] 晾干：将离子吸附柱13000rpm离心2m i n，除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应； [0053] 洗脱DNA：将离子吸附柱放入第三离心管中，在离子吸附柱的中间加入50μL‑100μL的洗脱缓冲液，室温放置2m i n后，13000rpm离心1mi n，弃废液，得到基因组DNA。 [0054] 所述基因组DNA可直接用于PCR、Southern‑b l ot、酶切和杂交以及新鲜样品和转基因作物的快速检测等，基因组DNA可以贮存于2‑8℃，如果要长时间存放，贮存于‑20℃。 [0055] 实施例三：对所得到基因组DNA质量进行检测。 [0056] 本实施例实验材料为日本晴水稻的幼叶、幼根。所述幼叶设有三组，编号分别为F1、F2、F3。所述幼根设有三组，编号分别为R1、R2、R3。通过实施例一中的试剂盒和实施例二中的操作步骤获得的水稻基因组DNA，对所获得的水稻基因组DNA进行纯度和浓度的检测。 [0057] 分别取1μL所述水稻基因组DNA，用Nanodrop分光光度计检测DNA的浓度和纯度；再分别用2μL DNA所述水稻基因组DNA，加入3μL 6×Load i ng Dye，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，并以DL5000 Marker(核小体生物技术有限公司，北京)为参照M1，DL2K p l us Marker(全式金生物技术有限公司)为参照M2。120V电泳30mi n后，于紫外凝胶成像系统(Tanon 4100，上海天能科技有限公司，上海)下观察并照相。实验结果分别见表1和图1。 [0058] 表1：水稻基因组DNA浓度和纯度的测定 [0059]样品名称 浓度(ng/uL) OD260/OD280 OD260/OD230 F1 565.153 2.05 2.06 F2 581.196 1.97 2.18 F3 628.284 1.94 1.96 R1 490.276 1.83 2.07 R2 526.774 2.06 1.97 R3 543.376 2.15 1.88 [0060] 实验结果表明：每三个平行样的DNA提取结果相对一致，每个样本进行电泳检测，如图1中的条带“F1、F2、F3和R1、R2、R3”结果如图1。本方法对所用水稻的幼叶、幼根这2种材料的DNA都进行了有效的分离，体现出了良好的对不同材料的适应性，且未出现明显降解或RNA残留。另外，分光光度计检测DNA的浓度和纯度，OD260/OD280值在1.8～2.0之间，OD260/OD230>1.8，说明DNA纯度较高，无蛋白质和RNA的残留，满足下游实验的需要。 [0061] 实施例四：对所得到基因组DNA扩增产物凝胶进行电泳检测。 [0062] 分别以上述所得到基因组DNA为模板，用特异性引物Pr i mer‑F、Pr i mer‑R进行PCR扩增，实则可扩增出一条带，且大小为799bp，以检测是否成功提取DNA。20μL反应体系如下：4μL 5xEffc i ent Taq PCR Master M i x(wi th Dye)(核小体生物技术有限公司，北京)，正向、反向引物各0.5μL(10μM)，提取出的DNA各10ng作为模板，用去离子水补至20μL。 [0063] PCR程序为：95℃，2m i n；95℃，10s；56℃，20s；72℃，30‑40s；30个循环；72℃，5m i n。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统下观察并拍照。实验结果如图1。 [0065] 引物名称 序列(5'‑3')Primer‑F ATGGAGCTGGAGCTTGG Primer‑R CCCAGTATCTTCAGGCG [0066] 实验结果表明：以上述所提取水稻的根和叶DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，结果见图1中泳道“a、b、c、d、e、f”。可以获得单一的扩增条带，说明通过本实验获得的基因组DNA特异性好，并且能稳定用于基因组DNA的下游实验。 [0067] 实施例五：研究山梨醇在裂解液中的作用。 [0068] 按照以下要求进行实验，分别配制以下两种裂解液： [0069] 一种裂解液包含1M山梨醇、0.2M NaOH、100mM Tr i s‑HC l、70mM EDTA、RNaseA(10mg/m l)，命名为裂解液A； [0070] 一种裂解液包含0.2M NaOH、100mM Tr i s‑HC l、70mM EDTA、RNaseA(10mg/m l)，命名为裂解液B。 [0071] 本实验研究的其他各试剂配制情况如下：除杂液包含：5.5MGuHC l、2M‑3M硫脲、30％‑40％无水乙醇，pH 5‑6；DNA助提剂包含：100‑150mM NaC l、10％‑15％三氯乙酸、 0.5％‑1％Tween‑20，pH 5‑6；漂洗液包含：70％‑80％无水乙醇，pH 6‑8；洗脱液包含：1mM‑ 3mM Tr i s‑HC l，pH 7.5‑8.5。 [0072] 实验方法按照实施例二的实验步骤进行，实验材料为野生型日本晴水稻的幼叶，每个实验均以100mg鲜重量为标准。每组实验进行三次生物学重复，并分别命名为A1、A2、A3和B1、B2、B3。电泳检测均以2μl上样量进行检测。实验结果如表3和图2。 [0073] 表3：6例样本使用不同裂解液提取基因组DNA的检测结果 [0074] [0075] 实验结果说明：使用含有山梨醇的裂解液A，提取水稻叶片的基因组DNA，实验结果如A1、A2、A3的浓度和纯度的测定，OD260/OD280>1.8，说明DNA纯度高，并且电泳结果表示条带单一。使用裂解液B提取的基因组DNA，实验结果如B1、B2、B3的浓度和纯度的测定，OD260/OD280<1.8，说明提取的DNA中纯度低。图2中最上层的一排条带为基因组DNA，白色框内为质粒DNA，说明B1、B2、B3基因组DNA中有质粒DNA的污染。这说明裂解液中山梨醇在NaOH的作用下可以很好的渗透细胞，并且不会因为强碱的条件造成细胞内基因组DNA的断裂，反而在强碱的作用下山梨醇使得细胞释放大量的基因组DNA，从而避免强碱环境下断裂的质粒DNA影响基因组DNA的提取。而6例样本的基因组DNA的浓度均值在650ng/μl左右，并且OD260/OD230>2，综上所述山梨醇在裂解液中对DNA的纯度具有增效作用，但几乎不影响基因组DNA的浓度。 [0076] 实施例六：研究硫脲的最佳反应浓度。 [0077] 配制如下除杂液： [0078] 除杂液1包含：1.5M硫脲、5.5M GuHC l、30％‑40％无水乙醇，pH 5.8。 [0079] 除杂液2包含：2M硫脲、5.5M GuHC l、30％‑40％无水乙醇，pH 5.8。 [0080] 除杂液3包含：2.5M硫脲、5.5M GuHC l、30％‑40％无水乙醇，pH 5.8。 [0081] 除杂液4包含：3M硫脲、5.5M GuHC l、30％‑40％无水乙醇，pH 5.8。 [0082] 除杂液5包含：3.5M硫脲、5.5M GuHC l、30％‑40％无水乙醇，pH 5.8。 [0083] 本实验的其他试剂配制如下：一种裂解液包含1M山梨醇、0.2MNaOH、100mM Tr i s‑HC l、70mM EDTA、RNaseA(10mg/m l)；DNA助提剂包含：100‑150mM NaC l、10％‑15％三氯乙酸、0.5％‑1％Tween‑20，pH 5‑6；漂洗液包含：70％‑80％无水乙醇，pH 6‑8；洗脱液包含：1mM‑3mM Tr i s‑HC l，pH 7.5‑8.5。 [0084] 实验方法按照本发明实施例二的实验步骤进行，实验材料为野生型日本晴水稻的幼叶，每个实验均以100mg鲜重量为标准。每组实验进行三次生物学重复。实验结果如表4。 [0085] 表4：15例样本使用5种不同除杂液提取基因组DNA的检测结果 [0086] [0087] 实验结果表明：当硫脲的浓度小于2M，或者大于3M时，基因组DNA的浓度明显降低，且OD260/OD280<1.8，说明基因组DNA中有蛋白质的污染；而当除杂液中硫脲的浓度为2‑3M时，基因组DNA的浓度较高且比较稳定，OD260/OD280>1.8。这表明对基因组DNA的浓度和纯度具有促进作用硫脲，其最适浓度为2‑3M。其中除杂液中硫脲的主要作用是溶解膜蛋白，同时与GuHC l相互协作破坏蛋白质的结构，从而保证基因组DNA纯度和稳定性。 [0088] 实施例七：研究DNA助提剂的对基因组DNA的作用。 [0089] 进行以下实验，对照组中未使用本发明的DNA助提剂进行的基因组DNA提取实验；实验组是使用DNA助提剂，包括：100‑150mM NaC l、10％‑15％三氯乙酸、0.5％‑1％Tween‑ 20，pH 5‑6，按照本发明实施例二的操作步骤进行基因组DNA提取实验。 [0090] 本实验的其他试剂配制如下：裂解液包含1M山梨醇、0.2M NaOH、100mM Tr i s‑HC l、70mM EDTA、RNaseA(10mg/m l)；漂洗液包含：70％‑80％无水乙醇，pH 6‑8；洗脱液包含：1mM‑3mM Tr i s‑HC l，pH7.5‑8.5。 [0091] 实验方法按照本发明的实验步骤进行，实验材料为野生型日本晴水稻的幼叶，每个实验均以100mg鲜重量为标准。每组实验进行三次生物学重复。实验结果如表5。 [0092] 表5:6例样本在有无DNA助提剂的参与下进行基因组DNA提取的实验结果 [0093] [0094] 实验结果表明：使用DNA助提剂进行基因组DNA提取所获得的实验组3例样本的浓度均值为655ng/μl，并且OD260/OD280>1.8，OD260/OD230>2；未使用DNA助提剂进行基因组DNA提取所获得的对照组3例样本的浓度均值为574.538ng/μl，并且OD260/OD280约为1.7‑1.8，OD260/OD230<2，有多糖和碳水化合物的污染；这说明DNA助提剂可有效去除植物破壁后释放的多糖多酚类物质，同时防止DNA二聚化，保护DNA的稳定性，在植物基因组DNA提取中发挥重要作用。因而，DNA助提剂可提高植物基因组DNA的质量且不限于浓度和纯度。 [0095] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 [0096] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。 |
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