专利汇 - 一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法 - PatentHub专利检索|专利汇|专利查询网|发明专利查询分析

一种厌 氧 氨氧化细菌的细菌 铁蛋白的分离纯化方法

热词	铁蛋白 bfr 蛋白细菌厌氧 mm 纯化基因透析厌氧氨氧化菌
专利类型	发明授权	法律事件	公开; 实质审查; 授权;
专利有效性	有效专利	当前状态	授权
申请号	CN202211185425.5	申请日	2022-09-27
公开(公告)号	CN115925831B	公开(公告)日	2025-02-18
申请人	重庆大学;	申请人类型	学校
发明人	陈猷鹏; 王谨; 晏鹏; 傅慧敏; 方芳; 郭劲松;	第一发明人	陈猷鹏
权利人	重庆大学	权利人类型	学校
当前权利人	重庆大学	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：重庆市	城市	当前专利权人所在城市：重庆市沙坪坝区
具体地址	当前专利权人所在详细地址：重庆市沙坪坝区沙正街174号	邮编	当前专利权人邮编：400044
主IPC国际分类	C07K14/195	所有IPC国际分类	C07K14/195 ; C07K1/34 ; C07K1/16 ; C07K1/14
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	6	专利文献类型	B
专利代理机构	重庆博凯知识产权代理有限公司	专利代理人	万霞;
摘要	本发明公开了一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，先对K.S Bfr基因进行扩增，再经克隆和表达后得到菌体，然后用裂解液悬浮，超声裂解，经离心收集上清液，再经两次分离纯化即得到细菌铁蛋白，包括：将凝胶与上清液混合后装入亲和层析柱空柱管中，再依次采用含100 mM、200 mM、400 mM、600 mM的NaCl溶液的洗涤缓冲液进行梯度洗涤；再采用洗涤液进行至少5次洗涤，然后采用洗脱液进行洗脱，即得到细菌铁蛋白混合液；采用超滤管对细菌铁蛋白混合液进行浓缩，然后采用分子筛层析柱分离即得到组装好的球状细菌铁蛋白。该方法能将厌氧氨氧化菌属Candidatus Kuenenia stuttgartiensis细菌的细菌铁蛋白纯化出来，从而为研究厌氧氨氧化细菌铁蛋白的结构和功能提供技术支持。
权利要求	1.一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，其特征在于，先对K.S Bfr基因进行扩增，经克隆和表达后得到菌体，然后用裂解液悬浮，超声裂解，然后离心，收集上清液，最后进行两次分离纯化即得到细菌铁蛋白；所述K.S Bfr基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；克隆和表达操作如下：将扩增K.S Bfr基因与克隆载体pET‑28a+连接，得到K.S Bfr克隆质粒；再将K.S Bfr克隆质粒转入BL21(DE3)中，然后在含有卡那霉素的LB培养基中活化培养，再移至新鲜LB培养基中进行扩增培养，待菌液OD600值为0.6 0.8时，向菌液中加入诱~ 导剂进行诱导培养，最后收集菌体；且细菌扩增培养时，在菌液中还添加有硫酸亚铁和血红素，以增加K.S Bfr的自组装能力；所述细菌铁蛋白分离纯化包括以下步骤： S1 一次纯化将凝胶与上清液混合后，在4 ℃摇床上孵育至少1 h，然后装入亲和层析柱空柱管中，再依次采用含100 mM、200 mM、400 mM、600 mM 的NaCl溶液的洗涤缓冲液进行浓度梯度洗涤；再采用洗涤液进行至少5次洗涤，然后采用洗脱液进行洗脱，即得到细菌铁蛋白混合液；所述凝胶为His‑tag Purification Resin；所述洗脱液的配置为：25 50 mM Tris‑HCl缓冲~ 液，pH 7.5 8.0，25 100 mM NaCl，20 500 mM咪唑，浓度为25 50 mM精氨酸； ~ ~ ~ ~ S2 二次纯化采用含有精氨酸的透析缓冲液对一次纯化后的细菌铁蛋白进行透析，然后采用超滤管对细菌铁蛋白混合液进行浓缩，最后采用分子筛层析柱分离，即可得到自组装的球状细菌铁蛋白；所述分子筛层析柱缓冲液体系为50 mM NaH2PO4，100 mM NaCl，pH 7.6。 2.根据权利要求1所述的一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，其特征在于，扩增时，以K.S Bfr基因的核苷酸序列为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增，所述K.S Bfr基因为Candidatus Kuenenia stuttgartiensis细菌铁蛋白基因，K.S Bfr基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物1和引物2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 3.根据权利要求1所述的一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，其特征在于，细菌扩增培养时，硫酸亚铁的浓度为1 5 mM，血红素的浓度为5 10mM。 ~ ~ 4.根据权利要求1所述的一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，其特征在于，裂解液配置：pH 7.5 8.0 Tris‑HCl 缓冲液浓度为25 100 mM，NaCl 浓度为25 150 ~ ~ ~ mM，Triton X‑100占比为0.1% 0.5%，DTT 2 5 mM，DNA 水解酶0 5 ug /mL，蛋白酶抑制剂混~ ~ ~ 合物5 10 μg/mL。 ~ 5.根据权利要求1所述的一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，其特征在于，超声裂解时，超声功率为420 w，输入4 s，间隔6 s，共进行20 30 min；离心时，离心20~ 30 min，转速为10000 rpm，温度为4 ℃；凝胶和上清液混合时，凝胶和上清液的体积比为~ 1:4。 6.根据权利要求1所述的一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，其特征在于，洗涤液的配置为：25 50 mM Tris‑HCl缓冲液、25 100 mM NaCl，0 5 mM咪唑，pH 7.5~ ~ ~ ~ 8.0；洗涤时，至少采用洗涤液进行5次洗涤，每次洗涤液量为柱体积的一半。
说明书全文	一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法技术领域 [0001] 本发明属于污水处理技术领域，特别涉及一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法。背景技术 [0002] 厌氧氨氧化细菌是参与厌氧氨氧化过程的一类细菌的总称，是一种厌氧菌。厌氧氨氧化菌（Anammox bacteria）属于浮霉菌门的化能自养型细菌。浮霉菌纲可以分为浮霉菌目和厌氧氨氧化菌目。厌氧氨氧化菌目可以分为6个属Ca.Anammoximicrobium、Ca.Brocadia、Ca.Anammoxoglobus、Ca.Jettenia、Ca.Kuenenia和Ca.Scalindua（Ca.为Candidatus的简称）。 [0003] 厌氧氨氧化细菌以亚硝酸盐为电子受体，将氨氮氧化为氮气和硝酸盐氮，具有高效低耗的优点，在水处理领域脱氮工艺中最具有应用前景。厌氧氨氧化菌富含丰富的铁，当厌氧氨氧化污泥成为优势菌后，呈现出美丽的红色，这与传统活性污泥不同，因此在水处理领域也被称为“红菌”。 [0004] 亚铁是厌氧氨氧化菌生长的重要底物元素，被广泛用于厌氧氨氧化污泥的培养。Van Niftrik等人在Anammox细菌中发现了纳米级(直径16 25纳米)的电子密度颗粒，显示~ 出较高的铁含量。厌氧氨氧化菌中的铁浓度比其他微生物高一个数量级。蛋白组学发现在Anammox细菌基因组中有两个细菌铁蛋白基因（Q1Q5F8和Q1Q315）。这些含铁纳米颗粒被证明是细菌铁蛋白，其含量占总蛋白的8.03%以上。此外，铁对厌氧氨氧化菌的生长和活性有 2+ 积极作用，将Anammox反应器中Fe 的浓度从0.03mmol/L提高到0.09 mmol/L有利于血红素的合成和厌氧氨氧化菌的生长。它还可以促进细胞色素C合成，提高肼脱氢酶(HDH)的活性， 2+ Anammox反应器的启动时间大大缩短。Fe 的添加提高了污泥的疏水性增加了厌氧氨氧化细菌颗粒的直径，提高了厌氧氨氧化反应器的脱氮能力。厌氧氨氧化细菌内的含铁蛋白参与细胞内电子传递、合成代谢、分解代谢和厌氧氨氧化反应等多个重要的细胞过程。因此研究厌氧氨氧化细菌铁蛋白的结构与功能对提高厌氧氨氧化工艺的运行效率具有非常重要的意义。 [0005] 目前，蛋白分离纯化的技术有：凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析和反相层析技术。离子交换层析法定性能力较差，且仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。疏水层析常用高盐度缓冲液，但细菌铁蛋白在高盐度中很容易解体成单个亚基；同时疏水相互作用层析更适用于从大体积中提取含量蛋白，成本较高。所以怎样分离纯化得到厌氧氨氧化细菌铁蛋白是本领域技术人员期望解决的技术问题。发明内容 [0006] 针对现有的纯化技术以及细菌铁蛋白本身的性质，本发明的目的就在于提供一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，该方法能有效的将厌氧氨氧化菌属Candidatus Kuenenia stuttgartiensis细菌铁蛋白分离纯化出来，从而为研究厌氧氨氧化细菌铁蛋白的结构和功能提供技术支持。 [0007] 本发明的技术方案是这样实现的： [0008] 一种厌氧氨氧化细菌的细菌铁蛋白的分离纯化方法，先对K.S Bfr基因进行扩增，经克隆和表达后得到菌体，然后用裂解液悬浮，超声裂解，然后离心，收集上清液，最后进行两次分离纯化即得到细菌铁蛋白，其分离纯化包括以下步骤： [0009] S1 一次纯化 [0010] 将凝胶与上清液混合后，在4 ℃摇床上孵育至少1 h，然后装入亲和层析柱空柱管中，再依次采用含100 mM、200 mM、400 mM、600 mM 的NaCl溶液的洗涤缓冲液进行浓度梯度洗涤；再采用洗涤液进行至少5次洗涤，然后采用洗脱液进行洗脱，即得到细菌铁蛋白混合液； [0011] S2 二次纯化 [0012] 采用超滤管对细菌铁蛋白混合液进行浓缩，然后采用分子筛层析柱分离，即可得到自组装的球状细菌铁蛋白。 [0013] 进一步地，扩增时，以K.S Bfr基因的核苷酸序列为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增，所述K.S Bfr基因为Candidatus Kuenenia stuttgartiensis细菌铁蛋白基因，K.S Bfr基因的氨基酸序列表如SEQ ID NO.1所示，K.S Bfr基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；引物1和引物2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 [0014] 进一步地，克隆和表达操作如下：将扩增K.S Bfr基因与克隆载体pET‑28a+连接，得到K.S Bfr克隆质粒；再将K.S Bfr克隆质粒转入BL21(DE3)中，然后在含有卡那霉素的LB培养基中活化培养，再移至新鲜LB培养基中进行扩增培养，待菌液OD600值为0.6 0.8时，向~菌液中加入诱导剂进行诱导培养，最后收集菌体。 [0015] 进一步地，细菌扩培时，在菌液中还添加有硫酸亚铁和血红素，以增加K.S Bfr的自组装能力，其中硫酸亚铁的浓度为1 5mM，血红素的浓度为5 10 mM。~ ~ [0016] 进一步地，裂解液配置：pH 7.5 8.0 Tris‑HCl 缓冲液浓度为25 100 mM，NaCl 浓~ ~度为25 150 mM，Triton X‑100占比为0.1 0.5%，DTT 2 5 mM，DNA 水解酶 0 5 ug /mL，蛋白~ ~ ~ ~ 酶抑制剂混合物5 10 ug/mL。 ~ [0017] 进一步地，超声裂解时，超声功率为420 w，输入4 s，间隔6 s，共进行20 30 min；~ 离心时，离心20 30 min，转速为8000 10000 rpm，温度为4 ℃；凝胶和上清液混合时，凝胶~ ~ 和上清液的体积比为1:4。 [0018] 进一步地，洗涤液的配置为：25 50 mM Tris‑HCl缓冲液、25 100 mM NaCl，0 5 mM~ ~ ~咪唑，pH 7.5 8.0；洗涤时，至少采用洗涤液进行5次洗涤，每次洗涤液量为柱体积的一半。 ~ [0019] 进一步地，洗脱时采用的洗脱液进行洗脱，洗脱液的配置为：25 50 mM Tris‑HCl~缓冲液，pH 7.5 8.0，25 100 mM NaCl，20 500 mM咪唑。 ~ ~ ~ [0020] 进一步地，洗脱缓冲液中加有精氨酸，所述精氨酸浓度为25 50 mM。~ [0021] 进一步地，在浓缩前，采用透析液进行透析，所述透析液配置为：在浓缩前，采用透析液进行透析，所述透析液配置为：25~50 mM NaH2PO4，25~100 mM NaCl，pH 7.5~8.0，25~50 mM精氨酸。 [0022] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： [0023] 1、本发明能成功将厌氧氨氧化菌属Candidatus Kuenenia stuttgartiensis的细菌铁蛋白纯化分离出来，从而为研究厌氧氨氧化细菌铁蛋白的结构和功能提供技术支持。 [0024] 2、本发明在一次纯化过程中，先采用NaCl浓度梯度洗涤，接着采用洗涤液洗涤杂蛋白，再采用洗脱液对于目的蛋白进行洗脱；二次纯化时采用分子筛层析柱将组装好的球状细菌铁蛋白与未完整组装的链状细菌铁蛋白分离，得到正确组装的球状细菌铁蛋白。 [0025] 3、厌氧氨氧化是目前最有前景的污水处理技术，细菌铁蛋白是很好的铁存储位点，K.S Bfr的纯化为研究厌氧氨氧化细菌中铁的代谢过程以及为该技术的铁调控提供了有力的支持。附图说明 [0026] 图1‑实施例1的K.S Bfr基因和空载体 pET‑28a+酶切结果图。 [0027] 图2‑实施例1的BL21(DE3)菌液混合液的宏观照片。 [0028] 图3‑实施例1的重组蛋白的SDS‑PAGE图。 [0029] 图4‑实施例1的一次纯化细菌铁蛋白的透射电镜图 [0030] 图5‑实施例1和实施例2中精氨酸优化效果图。 [0031] 图6‑实施例1的K.S Bfr 基因的凝胶渗透色谱图。 [0032] 图7‑实施例1的K.S Bfr 基因的透射电镜图。 [0033] 图8‑实施例1的重组K.S Bfr 基因的活性验证图。具体实施方式 [0034] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。 [0035] 从NCBIS数据库里面得到的Candidatus Kuenenia stuttgartiensis细菌铁蛋白基因（简称：K.S Bfr基因）的氨基酸序列如下，具体如SEQ ID NO.1所示。 [0036] K.S Bfr基因的氨基酸序列： [0037] megnpkvivv lnellmaeit ainqyfvhak mcenwgykrl yefneknsie emkhaeklie rllylegipk mdlgkitvgk vvkeqlendy alekiaiqrl qksitlcaev gdagsrelle hiltdeekha ndleehlqqi kdmgienyls vqvikkde [0038] 通过转换和修饰得到K.S Bfr基因的核苷酸序列，K.S Bfr基因的核苷酸序列如下，具体如SEQ ID NO.2所示。 [0039] K.S Bfr基因的核苷酸序列： [0040] ATGGAAGGCA ACCCGAAAGT AATTGTAGTG CTGAATGAAC TGCTGATGGC AGAAATCACC GCGATTAACC AGTATTTCGT ACACGCGAAA ATGTGCGAGA ACTGGGGCTA CAAACGCCTG TATGAGTTCA ATGAAAAGAA CTCTATCGAG GAAATGAAAC ATGCCGAAAA ACTGATTGAA CGTCTGCTGT ACCTGGAAGG CATTCCGAAG ATGGATCTGG GTAAAATTAC CGTCGGCAAG GGTCTGCTGT ACCTGGAAGG CATTCCGAAG ATGGATCTGG GTAAAATTAC CGTCGGCAAG GAGAAAAGCA TCACTCTGTG CGCAGAAGTG GGCGACGCTG GTTCCCGCGA GCTGCTGGAA CACATCCTGA CTGATGAAGA AAAACACGCC AACGACCTGG AGGAACACCT GCAGCAGATT AAAGACATGG GCATCGAAAA CTATCTGAGC GTACAGGTGA TCAAGAAAGA TGAA[0041] 实施例1 [0042] （1）基因扩增 [0043] 克隆K.S Bfr基因，用PCR法扩增K.S Bfr的基因，得到扩增K.S Bfr基因，所用的引物1和引物2的核苷酸序列如下，具体分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。 [0044] 引物1：AAGGAGCAAC TGGAGAACGA TTACG [0045] 引物2：TCGGTCAAAA TATGTTCAAG CAACTCC [0046] PCR扩增体系为：引物1 0.5uL×22，引物2 0.5uL×24，dNTP (25 mM) 1uL， 10X pfu Buffer 5 uL，上下游引物各2uL， Pfu(5 μ/μL) 0.4μL，ddH2O补水至 50μL。 [0047] PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性22 s；58 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s；最后72 ℃在延伸5 min。从第二步开始设置24个循环，进行两轮扩增。 [0048] 对质粒进行双酶切，将载体的酶切体系放于 37 ℃恒温水浴锅中反应 2 h。用2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，使用 AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒切胶回收PCR 产物，回收产物用于后续研究。载体pET28a：4 μg；10X FD Buffer：5μL; Sall: 1μL (10 μ/μL); EcoRI: 1 μL (10 μ/μL); ddH2O: 39 μL。 [0049] （2）目的片段的连接和产物转化 [0050] 将回收的纯化DNA片段与载体进行连接，由于运用相同的核苷酸内切酶会产生相同的粘性末端，所以载体质粒与插入的DNA片段带有相同的粘性末端，用连接酶可以将这两个具有粘性末端的片段连接在一起。将连接体系混合液放在22℃PCR 仪 1 h。连接完成后，重新进行酶切验证。连接体系：酶切目的片段：8 μg；酶切载体 pET28a：4 μL；10X T4 DNAligase Buffer：2 μL；T4 DNAligase：1 μL (5 μ/μL)；ddH2O：补充至 20μL。 [0051] 结果如图1所示，利用MulI、XHoI酶切获得片段基因大小。一个是不含目的基因的大条带，一个是含目的基因的小条带。使用MulI、XhoI酶切后，酶切片段与理论大小1336bp一致，质粒和目的基因酶切片段都符合预期，可以进入下一阶段。 [0052] （3）质粒转化至 BL21(DE3)感受态细胞 [0053] 将连接好的质粒转入感受态细胞中，需要先将从低温冰箱中去除感受态的细胞并在冰上融化，再加入 2 μL 的连接产物于融化的细胞，继续冰浴 15 min。然后将混合细胞液置于 42 ℃的恒温水浴锅中热激 90s，使 DNA 进入感受态细胞。整个过程中保持细胞的稳定，避免摇晃震荡。热激完成后，冰浴 5 min。最后加入 500 μL LB 培养基，在 37℃，200 rpm 的条件下震荡 1 h，取200 μL菌体涂布含有抗性(终浓度 50 μg/ml 卡那霉素)的 LB 平板，37℃倒置培养过夜。 [0054] （4）表达细菌铁蛋白 [0055] A、活化： [0056] 将K.S Bfr克隆质粒转入BL21(DE3)中，然后将带有pET28a‑K.S Bfr质粒基因表达载体的大肠杆菌接种于含有50 ug/mL卡那霉素的5 mL LB液体培养基中，在37 ℃，180 rpm 摇床中过夜培养。 [0057] B、扩培： [0058] 将过夜活化的大肠杆菌按照1:50的比例接种于含有LB液体培养基中，在37 ℃，180 rpm 摇床中扩培，待菌液OD600值为0.6 0.8时，停止培养。 ~ [0059] C、诱导： [0060] 向菌液中加入诱导剂IPTG（异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷），使其终浓度为1 mM；添加2.5 mM硫酸亚铁，10 mM血红素。接着在25 ℃，120 rpm, 摇床中培养18 h，得到细胞沉淀。 [0061] D、收菌： [0062] 将上述细胞沉淀用pH 8.0的磷酸盐缓冲液悬浮沉淀后再离心，该步骤重复3次，收集菌体沉淀物，菌体成红色。 [0063] 含有K.S Bfr 蛋白的BL21(DE3)菌液混合液如图2所示，混合液呈粉红色。 [0064] （4）纯化细菌铁蛋白 [0065] A、裂解： [0066] 将上述菌体用pH 8.0的Tris‑HCl缓冲液清洗一次，离心后将细胞沉淀用裂解液在冰上悬浮0.5 1 h。~ [0067] 裂解液配置：pH 8.0，Tris‑HCl 缓冲液浓度为25 100 mM，NaCl 浓度为25 150 ~ ~mM，Triton X‑100溶液体积比为0.1 0.5%，DTT 2 5 mM，DNA水解酶 0‑5 ug /mL，蛋白酶抑~ ~ 制剂混合物5‑10 ug/mL。所有操作均在冰上进行。 [0068] B、细胞破碎 [0069] 用超声波细胞破碎仪来裂解细胞。超声功率为420 w，输入4 s，间隔6 s，共进行2030 min。待溶液出现菌液分离的界面时停止。 ~ [0070] C、菌液分离： [0071] 利用离心机收取细菌裂解上清液，此时上清液颜色呈棕红色。离心条件：离心时间30 min，转速为10000 rpm，4 ℃。 [0072] D、一次纯化 [0073] 蛋白纯化过程中需要的材料包括His‑tag Purification Resin（简称为凝胶），亲和层析柱空柱管。 [0074] 具体操作如下：每1 mL凝胶中加入4 mL细菌裂解液上清，使得凝胶和细菌裂解上清液均匀混合。接着在4 ℃ 摇床上缓慢孵育至少1 h。最后将裂解上清液和凝胶混合物装入亲和层析柱空柱管中，在重力作用下使柱内液体流出，凝胶被截留在层析柱内。 [0075] ①洗涤 [0076] 依次采用100，200，400，600 mM NaCl溶液洗涤凝胶，俗称洗柱。每个浓度洗涤两次，洗涤体积为柱体积的2倍。该缓冲液中Tris‑HCl为25‑100 mM，pH 7.6。 [0077] ②再次洗涤杂蛋白 [0078] 采用洗涤缓冲液进行洗涤，洗涤缓冲液体系为：50 mM Tris‑HCl缓冲液，pH 7.6，100 mM NaCl，5mM咪唑。至少进行5次，每次洗涤缓冲液量为柱体积的一半。 [0079] ③目的蛋白洗脱 [0080] 每次用半个柱体积洗脱液进行洗脱。 [0081] 洗脱缓冲液配置：50 mM Tris‑HCl缓冲液，pH 7.6，100 mM NaCl，20 500 mM咪唑。~ 由于细菌铁蛋白呈红色，因此，在洗脱时，待His‑tag Purification Resin呈现出原来的蓝色时，洗脱结束。 [0082] 此时得到的重组蛋白的SDS‑PAGE图如图3所示，图3中M从小到大依次为：10、15、25、35、45、60、75、100、140、180KDa，由图可见，目的蛋白的条带对应分子量大约为18.3KDa，这与目的蛋白的理论分子量一致，表面成功纯化得到细菌铁蛋白。 [0083] 一次纯化后的细菌铁蛋白的透射电镜图如图4所示，由图可见，内含球状和链状的细菌铁蛋白，其中球状为完成组装的细菌铁蛋白，而链状为细菌铁蛋白单体或多聚体。 [0084] E、二次纯化 [0085] ①透析 [0086] 采用含有精氨酸的透析缓冲液对一次纯化后的细菌铁蛋白进行透析，精氨酸有助于蛋白稳定和溶解。透析条件：每隔4 h更换1次透析液，共透析4 次。透析缓冲液配置为：50 mM NaH2PO4，100 mM NaCl，pH 7.6，50 mM助溶剂精氨酸。助溶剂精氨酸优化效果如图5所示，图5中M 从小到大：10、15、25、35、45、60KDa，由图5可见，未透析时蛋白由于沉淀导致大量损失，条带显示蛋白浓度显著减少；在透析液中添加精氨酸（精氨酸透析）后蛋白浓度显著增加，条带较宽。 [0087] ②筛选 [0088] 使用超滤管将透析后的蛋白进行浓缩，得到浓度相对较高的细菌铁蛋白，然后采用分子筛层析柱对蛋白进行二次纯化。缓冲液体系为 50 mM NaH2PO4，100 mM NaCl，pH 7.6。 [0089] 纯化过程中对K.S Bfr的凝胶进行渗透色谱分析，其结果如图6所示，出现两个吸收峰，其中峰1（较高的峰）为完整组装细菌铁蛋白，峰2（较低的峰）为细菌铁蛋白单体或多聚体。 [0090] 在具体实施时提高蛋白浓度的方法为：填充重力柱时，可以适当减少纯化树脂填充体积，以增加目的蛋白与镍柱结合密度；同时，在洗脱目的蛋白时，减少每次洗脱体积，减缓目的蛋白被洗脱下来的速度，以增加目的蛋白浓度。 [0091] 对最终得到的细菌铁蛋白进行了透射电镜扫描，其透射电镜图如图7所示，细菌铁蛋白约为10 13nm的球状（图7（a）），表明成功的纯化出了组装完好的球蛋白。而未组装的蛋~白呈链状（图7（b））。 [0092] 体外实验： [0093] 验证纯化得到的组装完好的球蛋白的活性：通过测定340 nm处紫外吸光度的增加量，监测K.S Bfr的铁蛋白氧化活性的动力学参数。反应体积为1 mL。该缓冲溶液中含有100 mM MES，pH 6.5，新鲜制备的FeSO4溶液，最终蛋白浓度为0.5 μM，FeSO4为125 μM 。不添加细菌铁蛋白的为对照组。并对反应后溶液中铁离子浓度进行了检测。 [0094] 结果如图8所示，由图8（a）可知，加入Fe2+后，K.S Bfr溶液340 nm处的吸光度在前200秒内迅速增加，吸光度值逐渐接近0.25，而不含K.S Bfr的对照组吸光度几乎为零。由图 2+ 8（b）可知，K.S Bfr溶液Fe 含量急剧下降，结果表明，K.S Bfr具有良好的活性，且具有一个功能性的亚铁氧化酶中心（FC）。 [0095] 实施例2 [0096] 本实施例同实施例1，不同之处在于，在对目的蛋白洗脱时，直接在洗脱缓冲液中加入助溶剂精氨酸50 mM，同时不进行透析步骤。其结果如图5所示。与纯化后精氨酸透析（精氨酸透析）相比，蛋白纯化时添加精氨酸（精氨酸纯化）与前者在同等条件下，蛋白均无沉淀产生，且胶条宽度一样，说明无论在纯化后还是纯化时添加精氨酸都可以有效防止蛋白沉淀，两者效果无差别。 [0097] 最后需要说明的是，本发明的上述实施例仅是为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化和变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

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