一种直接分离免疫细胞的方法
| 热词 | 细胞 淋巴细胞 淋巴 生物素 裂解 抗原 抗体 分选 生物 特异 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 驳回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 驳回 |
| 申请号 | CN202210991418.8 | 申请日 | 2022-08-18 |
| 公开(公告)号 | CN115161277A | 公开(公告)日 | 2022-10-11 |
| 申请人 | 武汉华美生物工程有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 罗绍祥; 牛梦溪; 舒芹; | 第一发明人 | 罗绍祥 |
| 权利人 | 武汉华美生物工程有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 武汉华美生物工程有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：湖北省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：湖北省武汉市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：湖北省武汉市东湖开发区高新大道818号高科医疗器械园B11栋 | 邮编 | 当前专利权人邮编：430206 |
| 主IPC国际分类 | C12N5/0781 | 所有IPC国际分类 | C12N5/0781 |
| 专利引用数量 | 5 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京众达德权知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 刘杰; |
| 摘要 | 本 申请 涉及 生物 技术领域，尤其涉及一种直接分离免疫细胞的方法；所述方法包括：使用生物素标记偶联 抗原 ，得到修饰抗原；使用亲和素包被固相载体，后加入修饰抗原进行生物素标记和亲和素的结合，得到修饰固相载体；向修饰固相载体表面加入淋巴细胞，后进行清洗，得到富集B淋巴细胞的载体；向载体的表面加入裂解缓冲液进行裂解，得到B淋巴细胞；其中，生物素标记包括可裂解官能团，裂解缓冲液用于裂解可裂解官能团；通过生物素标记和亲和素结合的方式，再利用抗原和B淋巴细胞表面的特异性 抗体 结合，方便去除未结合的其他细胞，同时通过裂解缓冲液对可裂解官能团进行裂解，能得到特异的B淋巴细胞，提高B淋巴细胞的分离效率。 | ||
| 权利要求 | 1.一种直接分离免疫细胞的方法，其特征在于，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 一种直接分离免疫细胞的方法技术领域背景技术[0002] 单克隆抗体(Monoclonal antibodies，mAb)是由B细胞产生，并能特异性靶向抗原的免疫球蛋白。单克隆抗体不仅是生物化学、分子生物学和医学研究中必不可少的工具，其在临床治疗上的应用也以革命性的速度改进了多种疑难杂症的治疗方法。随着单克隆抗体技术的发展，目前单克隆抗体制备方法不仅包括传统的杂交瘤技术，还包括噬菌体展示技术(Phage display)、人源抗体转基因小鼠(Human antibody‑producing mice)和单B细胞抗体技术(Single B cell antibody technology)，这些方法虽然有各自的局限性，但都已广泛应用于单克隆抗体筛选。 [0003] 目前单克隆抗体技术包含的步骤为：a.从外周血或免疫器官中初步提取淋巴细胞；b.使用细胞分选技术分离出特定的B细胞；c.将分离出的B细胞进行单细胞培养；d.使用逆转录聚合酶链式反应(RT‑PCR)和抗体特异性引物鉴定单B细胞分泌抗体的特异性；e.扩增特异抗体基因；f.将抗体基因克隆到表达载体中，并在细菌或细胞系统中表达；g.纯化表达产生的抗体，并用ELISA等方法进行评估。 [0004] 因此在单克隆技术中，细胞分选技术是单克隆抗体技术流程中最为关键的一环，而特异性高、操作便利的分选流程可以大大降低后续实验的难度和工作量。目前常见的细胞分选方法包括流式细胞分选(FACS)和磁珠分选(MACS)，然而由于外周血或免疫器官提取的淋巴细胞中含有大量T淋巴细胞、巨噬细胞、非特异B淋巴细胞，采用传统的FACS和MACS技术进行细胞分选，虽然能得到一定程度上富集B淋巴细胞，但是无法有效的分离除B淋巴细胞外的其他免疫细胞或者物质，因此存在分离效率低的问题，因此如何在富集B淋巴细胞的基础上提高B淋巴细胞的分离效率，是目前亟需解决的技术问题。发明内容 [0005] 本申请提供了一种直接分离免疫细胞的方法，以解决现有技术中在富集B淋巴细胞的基础上B淋巴细胞的分离效率过低的技术问题。 [0006] 第一方面，本申请提供了一种直接分离免疫细胞的方法，所述方法包括： [0007] 使用生物素标记偶联抗原，得到修饰抗原； [0008] 使用亲和素包被固相载体，后加入所述修饰抗原进行生物素标记和亲和素的结合，得到修饰固相载体； [0009] 向所述修饰固相载体表面加入淋巴细胞，以使所述修饰固相载体上的抗原和B淋巴细胞特异性结合，后进行清洗，得到富集B淋巴细胞的载体； [0010] 向所述载体的表面加入裂解缓冲液进行裂解，得到B淋巴细胞； [0011] 其中，所述生物素标记包括可裂解官能团，所述裂解缓冲液用于裂解所述可裂解官能团。 [0012] 可选的，所述可裂解官能团包括二硫键、Dadps、Dde和PC中的至少一种。 [0013] 可选的，所述生物素标记包括生物素‑SS‑NHS酯、磺基‑NHS酯‑SS‑生物素和NHS酯‑SS‑聚乙二醇‑生物素中的至少一种。 [0014] 可选的，所述裂解缓冲液包括还原剂。 [0015] 可选的，所述还原剂包括谷胱甘肽、二硫苏糖醇和β‑巯基乙醇中的至少一种。 [0016] 可选的，所述谷胱甘肽的浓度为45mmol/L～55mmol/L。 [0017] 可选的，所述生物素标记和所述抗原的摩尔比为1:2～1:4。 [0018] 可选的，所述修饰抗原和所述亲和素的质量之比为1:0.9～1:1.1。 [0019] 可选的，所述亲和素包括卵白亲和素、链霉亲和素和中性亲和素中的至少一种。 [0020] 可选的，所述裂解的时间≥15min。 [0021] 本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点： [0022] 本申请实施例提供的一种直接分离免疫细胞的方法，先通过生物素标记和亲和素结合的方式，由于生物素标记和亲和素之间的结合是目前最强的非共价作用，因此通过生物素标记和亲和素结合的方式，能使得抗原和固相载体之间牢固结合，再利用抗原和B淋巴细胞表面的特异性抗体结合，从而使得目的细胞能固定在固相载体的表面，方便去除未结合的其他细胞，同时由于生物标记含有可裂解的官能团，通过裂解缓冲液对生物标记的可裂解官能团进行裂解，使得生物素标记断裂，从而使得同生物素偶联的抗原被释放，而由于抗原特异性结合了B淋巴细胞表面的抗体，因此随着抗原被释放的同时B淋巴细胞也被释放，从而能得到特异的B淋巴细胞，实现对B淋巴细胞的有效分离，提高了B淋巴细胞的分离效率。附图说明 [0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0025] 图1为本申请实施例提供的方法的流程示意图； [0026] 图2为本申请实施例提供的培养基中PCT阳性率的结果图； [0027] 图3为本申请实施例提供的培养基中细胞活率的结果图； [0028] 其中，***为P<0.001，ns为无相关性。 具体实施方式[0029] 下面将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。 [0030] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。 [0031] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。 [0032] 本申请的创造性思维为： [0033] 虽然杂交瘤技术和噬菌体展示技术已经在单克隆抗体生产中广泛应用，但它们依然存在较难克服的缺点制约着抗体生产过程，比如杂交瘤技术细胞融合效率低、噬菌体展示技术导致重链、轻链的天然同源配对丢失等问题。为了克服这些技术局限性，不断开发和完善单克隆抗体具有重要意义，目前单克隆抗体技术的步骤中，细胞分选技术是单克隆抗体技术流程中最为关键的一环，特异性高、操作便利的分选流程可以大大降低后续实验的难度和工作量。目前常见的细胞分选方法包括流式细胞分选(FACS)和磁珠分选(MACS)。 [0034] 流式细胞分选是利用流式细胞仪的分选功能，用特定波长的激光激发细胞表面标记的荧光色素，在高压电场的作用下，挑选出目的细胞，最后流入收集容器中。流式细胞分选是一种精度、自动化程度很高方法，但这种方法的缺点有：1)设备昂贵，市售价格较高，对科研的前期投入和后续开展都有较大的经济压力；2)细胞在分选过程中需要经受激光照射、高压电场、气流等压力考验，对细胞后续培养都是不小的挑战；3)通常流式分选会预先用荧光抗体标记细胞，荧光蛋白分子量较大且分选后细胞表面的荧光蛋白很难去除，这对后续实验的开展具有一定制约；4)流式分选细胞时为降低对细胞的机械损伤，其分选流速无法设置太高，若分选细胞总量大于10^9是将耗费数十小时时间，这对机器成本、细胞活性都是不小的考验。 [0035] 磁珠分选是利用磁珠上包被的特异性抗体与细胞表面抗原结合，通过磁场作用，将特定细胞留存在磁场中，而不能与磁珠上的特异抗体结合的细胞则会随流动相离开磁场，从而达到分离特异细胞的目的。磁珠分选技术相比流式分选法，其机械化程度低、细胞损伤小、设备成本低，但依然不能完全替代流式分选。它的局限性有：1)磁珠分选的机械化程度低虽然对细胞的损害小于流式分选，但分选出的细胞若要进行单细胞培养，则需耗费较多人力进行后续实验，且实验精度低于流式分选；2)磁珠分选的设备虽然造价比流式分选仪低，但商用较广泛的磁力架等设备依然需要几万至十几万不等，且耗材也较为昂贵；3)若使用正向筛选，最后获得的是与磁珠特异抗体结合的细胞，且磁珠后续很难与细胞分离，因此磁珠过大会是导致细胞容易聚集或沉淀、磁珠过小会容易随细胞内吞作用进入胞内，这都会影响细胞的生物学活性；4)若使用反向筛选，最后获得的是不能与磁珠上的特异抗体结合的细胞，这样可以避免磁珠对细胞活性的影响，但这需要耗费更多的抗体，得到的细胞均一性略差。 [0036] 其他从外周血中分离淋巴细胞的技术也已经有许多已经公开，例如按照步骤1：全血样本预处理、Ficoll法分离、MNC收集和洗涤、MNC计数、MNC冻存、细胞复苏、MNC计数和细胞扩增；步骤2：添加用生物素标记的特异性抗体偶联链霉亲和素微泡，使目标细胞被微泡标记，通过离心使目标细胞分离；步骤3：使用AXP全自动细胞分离设备来从成人外周血中自动化提取免疫细胞的方法；步骤4：用固相化抗原的磁颗粒微球捕获靶淋巴B细胞分泌的特异抗体，再用磁力分离出磁颗粒微球，确定阳性孔，通过抗体工程提高单克隆抗体体内、外药效，评价单克隆抗体体内成药性，获得临床前候选抗体。但是上述方法要么流程操作复杂，要么整体的分离效率较低，无法在短时间内获得高活力、高纯度的目的细胞。 [0037] 因此若能将分泌特异性抗体的B淋巴细胞从免疫器官细胞或外周血细胞中高效的分离和富集可以减少单B细胞培养的工作量、提高生产效率。 [0038] 本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下： [0039] 在本申请的一个实施例中，如图1所示，提供一种直接分离免疫细胞的方法，所述方法包括： [0040] S1.使用生物素标记偶联抗原，得到修饰抗原； [0041] S2.使用亲和素包被固相载体，后加入所述修饰抗原进行生物素标记和亲和素的结合，得到修饰固相载体； [0042] S3.向所述修饰固相载体表面加入淋巴细胞，以使所述修饰固相载体上的抗原和B淋巴细胞特异性结合，后进行清洗，得到富集B淋巴细胞的载体； [0043] S4.向所述载体的表面加入裂解缓冲液进行裂解，得到B淋巴细胞； [0044] 其中，所述生物素标记包括可裂解官能团，所述裂解缓冲液用于裂解所述可裂解官能团。 [0045] 在一些可选的实施方式中，所述可裂解官能团包括二硫键、Dadps、Dde和PC中的至少一种，其中，所述可裂解官能团可以是二硫键，也可以是Dadps，也可以是Dde，还可以是PC。 [0046] 本申请实施例中，控制可裂解官能团的种类，能实现通过大部分的裂解缓冲液实现对可裂解官能团的裂解，使得带有特异性抗体的B淋巴细胞从固相载体的表面解离，从而得到抗原特异性结合的B淋巴细胞的悬液，提高B淋巴细胞的分离效率。 [0047] 在一些可选的实施方式中，所述生物素标记包括生物素‑SS‑NHS酯、磺基‑NHS酯‑SS‑生物素和NHS酯‑SS‑聚乙二醇‑生物素中的至少一种。 [0048] 本申请实施例中，控制生物素标记的种类，能包含大部分可裂解的官能团可能的生物素及标记，从而使得本申请的方法具有普适性。 [0049] 在一些可选的实施方式中，所述裂解缓冲液包括还原剂。 [0050] 本申请实施例中，控制裂解缓冲液包括还原剂，通过还原的方式将可裂解官能团中的可还原官能团去除，由于还原的方式较其他裂解缓冲液和可裂解官能团之间的方式安全和高效，因此通过还原的方式，不仅能将生物素标记裂解完全，还能使得抗原和固相载体的分离速度变快，从而提高B淋巴细胞的分离效率。 [0051] 在一些可选的实施方式中，所述还原剂包括谷胱甘肽、二硫苏糖醇和β‑巯基乙醇中的至少一种，其中，所述还原剂可以是谷胱甘肽，也可以是二硫苏糖醇，还可以是β‑巯基乙醇。 [0052] 本申请实施例中，控制还原剂的种类，能包含大部分生物类还原剂的种类，从而使得本申请的方法具有普适性。 [0053] 在一些可选的实施方式中，所述谷胱甘肽的浓度为45mmol/L～55mmol/L，其中，所述谷胱甘肽的浓度可以是45mmol/L，也可以是50mmol/L，还可以是55mmol/L。 [0054] 本申请实施例中，控制谷胱甘肽的浓度为45mmol/L～55mmol/L的积极效果是在该浓度范围内，能使得充当还原剂的谷胱甘肽的含量充足，保证谷胱甘肽和可裂解官能团中的还原性官能团之间发生还原反应而裂解，从而使得抗原从固相载体上解离，进而使得同抗原特异性结合的B淋巴细胞分离，从而提高B淋巴细胞的分离效率。 [0055] 在一些可选的实施方式中，所述生物素标记和所述抗原的摩尔比为1:2～1:4，其中，该摩尔比可以是1:2，也可以是1:3，还可以是1:4。 [0056] 本申请实施例中，控制生物素标记和抗原的摩尔比的积极效果是在该范围内，能使得生物素标记偶联充足的抗原，从而保证后续带有特异性抗体的B淋巴细胞和抗原之间的紧密结合，方便后续对特异性结合的B淋巴细胞和未结合细胞之间的分离，从而提高B淋巴细胞的分离效率。 [0057] 在一些可选的实施方式中，所述修饰抗原和所述亲和素的质量之比为1:0.9～1:1.1，其中，该质量比可以是1:0.9，也可以是1:1，还可以是1:1.1。 [0058] 本申请实施例中，控制修饰抗原和亲和素的质量之比的积极效果是在该质量之比的范围内，能保证修饰抗原上的生物素标记和亲和素之间的结合充分，保证后续对B淋巴细胞的分离效果。 [0059] 在一些可选的实施方式中，所述亲和素包括卵白亲和素、链霉亲和素和中性亲和素中的至少一种。 [0060] 本申请实施例中，控制亲和素的具体种类，能涵盖大部分同生物素标记结合的亲和素，使得本申请的方法具有普适性。 [0061] 在一些可选的实施方式中，所述裂解的时间≥15min。 [0062] 本申请实施例中，控制裂解的时间≥15min的积极效果是在该时间范围内，能保证裂解缓冲液对可裂解官能团之间的作用时间，使得裂解充分进行，进而使得抗原和固相载体能够充分分离，从而使得B淋巴细胞能同固相载体分离完全。 [0063] 实施例1 [0064] 如图1所示，一种直接分离免疫细胞的方法，包括： [0065] S1.使用生物素标记偶联抗原，得到修饰抗原，具体步骤包括： [0066] (1)将浓度为20mg/mL的生物素溶解在PBS溶液中，然后生物素与抗原按分子摩尔比1:1的比例混合，室温反应1h，其中，生物素采用Thermo Scientific的可还原生物素EZ‑TMLink Sulfo‑NHS‑SS‑biotin； [0067] (2)用超滤管去除游离生物素及其他试剂，并用抗体保存液保存抗体。 [0068] 实施例2 [0069] 将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于： [0070] S2.使用亲和素包被固相载体，后加入所述修饰抗原进行生物素标记和亲和素的结合，得到修饰固相载体，具体步骤包括： [0072] (2)将2μg/mL链酶亲和素溶液加入细胞培养皿中，于37℃包被过夜，后吸弃溶液，用无菌PBST溶液将培养皿洗3遍，每次3min，清除多余的链酶亲和素溶液； [0073] (3)将2μg/mL生物素－抗原复合物加入细胞培养皿中，于37℃包被1h，后吸弃溶液，用无菌PBS将培养皿洗3遍，每次3min，清除多余的抗原； [0074] (4)将质量浓度为2％的BSA溶液加入细胞培养皿中，37℃封闭1h，后吸弃溶液，用无菌PBS将培养皿洗1遍，将培养皿放回37℃培养箱，干燥1h～2h。 [0075] 实施例3 [0076] 将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于： [0077] S3.向所述修饰固相载体表面加入淋巴细胞，以使所述修饰固相载体上的抗原和B淋巴细胞特异性结合，后进行清洗，得到富集B淋巴细胞的载体，具体步骤为： [0078] (1)将1mL脾细胞或外周血细胞加入15mL容积的离心管中，加入红细胞裂解液裂将离心管装满，上下颠倒离心管10min直至液体呈红色，1500rpm离心5min，弃去上清，再用5mL的DMEM溶液重悬细胞，1500rpm离心5min，再次吸弃上清，用5mL的DMEM溶液重悬细胞，得到无红细胞的脾细胞或外周血细胞； [0079] (2)将5mL淋巴细胞分离液加入15mL离心管中，将上一步的得到的细胞悬液缓慢、小心地滴加在淋巴细胞分离液表面，于400G离心20min，离心后细胞分为四层，从上到下依次为：DMEM、淋巴细胞、分离液、红细胞。第二层淋巴细胞为环状乳白色，将该层细胞小心吸到新的离心管中，再用5mL的DMEM分散细胞，于1500rpm离心5min，吸弃上清，用5mL的含10％的FBS的DMEM培养基重悬细胞，得到淋巴细胞悬液； [0080] (3)将收集到的淋巴细胞悬液加入制备的抗原包被的细胞培养皿中，然后将细胞培养皿放入37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱中孵育1h，期间每20min将培养皿取出，轻轻晃动； [0081] (4)吸弃培养皿中上清，用质量浓度为2％的FBS的DMEM培养基将培养皿洗10次，每次1min，清除未被结合的细胞. [0082] 实施例4 [0083] 将实施例4和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于： [0084] S4.向所述载体的表面加入裂解缓冲液进行裂解，得到B淋巴细胞，具体步骤包括： [0085] (1)加入裂解缓冲液,室温处理15min，期间多次晃动培养皿帮助被切割后的细胞解离下来，其中，裂解缓冲液的配方包括：50mM的glutathione,75mM的NaCl，10mM的EDTA，质量浓度为2％的BSA，0.075N的NaOH； [0086] (2)将解离下的细胞悬液转移至离心管中，培养皿用含2％的FBS的DMEM培养基洗1遍，并将溶液转移至离心管中，于1500rpm离心5min，吸弃上清，用1mL的含1％的FBS的PBS溶液重悬细胞，得到目的细胞悬液。 [0087] 实施例5 [0088] 将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于： [0089] 对目的细胞悬液的细胞进行检测，具体步骤如下： [0090] (1)将分离出的目的细胞悬液中的细胞标记为“分离后样本”，将细胞分离前的淋巴细胞悬液标记为“未分离样本”，将两种样本细胞各取10μL与等体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数仪进行计数，计算样本中细胞活力； [0091] (2)使用Gammacell1000辐照CD40L‑NIH‑3T3细胞，将处理后的细胞进行计数，配制B淋巴细胞的IMDM培养基：质量浓度为10％的FBS，1％的Penicillin‑Streptomycin8 (10000U/mL)，1μg/L的CPG‑ODN，10个/L辐照后CD40L‑NIH‑3T3细胞。 [0092] (3)将(2)中的两种细胞分别用200mL的B淋巴细胞IMDM培养基稀释至104个/L，并将细胞悬液充分混合后接种在10个96孔板中，每孔加入200μL细胞悬液，后将细胞置于37℃、体积浓度为5％的CO2培养箱中培养11～13天后，收取培养基上清液进行检测，检测培养基中的PCT抗体效价，计算阳性细胞比例，检测结果如表1所示。 [0093] 表1 [0094] [0095] [0096] 表1中，采用不成对测试，具体结果如图2和图3所示，可知，采用本申请的分离方法，利用可还原的生物素和抗原标记的B淋巴细胞，使得B淋巴细胞紧密的结合在细胞培养皿的固相载体上，方便后续对未结合细胞的分离，再利用裂解缓冲液切割生物素，采用生物素中的可裂解官能团和裂解缓冲液之间的反应，使得抗原标记的B淋巴细胞从固相载体上解离出来，从而能获得活力更高、特异性更好的B细胞。 [0097] 本申请实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点： [0098] (1)本申请实施例提供的方法，通过生物素标记和亲和素结合的方式，使得抗原和固相载体之间牢固结合，再利用抗原和B淋巴细胞表面的特异性抗体结合，从而使得目的细胞能固定在固相载体的表面，方便去除未结合的其他细胞，同时通过裂解缓冲液对生物标记的可裂解官能团进行裂解，使得同生物素偶联的抗原被释放，随着抗原被释放的同时B淋巴细胞也被释放，从而能得到特异的B淋巴细胞，实现对B淋巴细胞的有效分离，提高了特异B淋巴细胞的含量。 [0099] (2)本申请实施例提供的方法，固相载体可以从1.27*109个/m2～6.37*109个/m2的原始细胞中富集特异的B淋巴细胞。 [0100] (3)本申请实施例提供的方法，能够在非常短的时间内获得高活力、高纯度的目的细胞，整体对细胞的操作时间在1.5h～2h内可以完成，减少对细胞活性的损害。 [0101] (4)本申请实施例提供的方法，能使得实验人员能从人体外周血、动物免疫器官中更简单、高效地分离获取目的细胞例如免疫细胞、造血干细胞等。 [0102] 需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。 [0103] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。 [0104] 以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。 |
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