| 热词 | 裂解 样本 蛋白酶 蛋白 核酸 加热 稀释 溶液 pcr 组织 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 驳回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 驳回 |
| 申请号 | CN202210354913.8 | 申请日 | 2022-03-29 |
| 公开(公告)号 | CN114717223A | 公开(公告)日 | 2022-07-08 |
| 申请人 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 宋东亮; 孙晓亮; | 第一发明人 | 宋东亮 |
| 权利人 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：上海市浦东新区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：上海市浦东新区天雄路166弄1号楼402室 | 邮编 | 当前专利权人邮编：200120 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 ; C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 11 | 专利被引用数量 | 1 |
| 专利权利要求数量 | 16 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 苏州根号专利代理事务所 | 专利代理人 | 朱华庆; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种处理 生物 样本的 试剂 ，其组成包括：裂解液和蛋白酶K溶液，所述裂解液包括缓冲剂、蛋白变性剂、 表面活性剂 以及 金属离子 ，所述蛋白酶K溶液包括蛋白酶K和蛋白酶K缓冲液，所述蛋白酶K的浓度为1‑30mg/mL。该试剂对于动物组织具有优异的处理效果，尤其是较难处理的动物组织，例如 肺 、肝脏等。更重要的，组织样本使用本发明提供的试剂处理完毕后，经加热和稀释处理后即可直接进行PCR扩增，无需进行核酸富集步骤，大大节约了实验时间和试剂成本。 | ||
| 权利要求 | 1.根据权利要求1所述的处理生物样本的试剂，其组成包括：裂解液和蛋白酶K溶液，所述裂解液包括缓冲剂、蛋白变性剂、表面活性剂以及金属离子，所述蛋白酶K溶液包括蛋白酶K和蛋白酶K缓冲液，所述蛋白酶K的浓度为1‑30mg/mL。 |
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| 说明书全文 | 处理生物样本的试剂及其应用技术领域[0001] 本发明涉及一种处理生物样本的试剂及其应用，属于分子生物学技术领域。 背景技术[0002] 生物样本的处理是进行分子生物学实验的重要技术手段。在分子生物学的研究中，所涉及的生物样本种类非常多，其中动物组织样本是较为常见的样本类型。动物组织样本经过裂解处理后，可以释放出样本中的核酸，经过核酸纯化的步骤后即可进行下游实验。然而，动物组织的裂解相对困难，尤其是肺、肝脏等组织，在未经组织研磨破碎的情况下，消化裂解所需的时间较长。组织消化裂解主要依靠蛋白酶K的作用，蛋白酶K可以降解蛋白，使组织裂解得以顺利进行。通常的裂解液需要在加热条件下使用以增强蛋白酶K的效率，但是在加热过程中也会使蛋白酶K的活性逐渐降低，导致在长时间加热的情况下无法彻底裂解动物组织。此外，对于使用核酸进行PCR扩增的实验，通常需要先纯化核酸，再进行PCR扩增，如果能避免核酸纯化的步骤，也可以大大节约实验时间。本发明针对上述问题，提供了一种效果良好的生物样本处理试剂，对于动物组织样本，尤其是较难裂解的动物组织样本，无需进行研磨破碎处理，就可以达到良好的裂解效果，并且裂解后的组织样本经加热和稀释处理后，可以直接进行PCR扩增或核酸富集操作。 发明内容[0003] 本发明的目的是提供一种处理生物样本的试剂。 [0004] 本发明采用的技术方案为： [0005] 一种处理生物样本的试剂，包括：裂解液和蛋白酶K溶液，所述裂解液包括缓冲剂、蛋白变性剂、表面活性剂以及金属离子，所述蛋白酶K溶液包括蛋白酶K和蛋白酶K缓冲液，所述蛋白酶K的浓度为1‑30mg/mL，优选的，蛋白酶K浓度为10‑30mg/mL，更为优选的，蛋白酶K浓度为20‑30mg/mL。 [0006] 优选的，所述缓冲剂为三羟基氨基甲烷‑盐酸、磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠、硼酸‑硼酸钠、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾、磷酸二氢钾‑氢氧化钠、巴比妥钠‑盐酸或甘氨酸‑氢氧化钠中的一种或数种，缓冲剂的浓度为1mM‑100mM，试剂的pH值为7.0‑9.0。 [0007] 更优选的，所述缓冲剂为三羟基氨基甲烷‑盐酸、磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾、磷酸二氢钾‑氢氧化钠中的一种或数种，缓冲剂的浓度为5mM‑70mM，更优选的浓度为10mM‑50mM，缓冲液的pH值为7.5‑8.5，更优选的，试剂的pH值为8.0。 [0009] 更优选的，所述蛋白变性剂为盐酸胍、硫氰酸胍、尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠中的一种或数种，浓度为0.2M‑4.5M，更优选的浓度为0.25M‑4M。 [0010] 优选的，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基磺酸钠、月桂醇醚硫酸钠、N‑月桂酰肌氨酸钠、N‑月桂酰谷氨酸钠、椰油酰胺烷醇硫酸钠、硬脂酸甲酯磺酸钠、十六烷基二苯基醚单磺酸钠、单硬脂酸甘油硫酸酯钠盐、N‑月桂酰基谷氨酸二酯、壬基酚聚氧乙烯醚、辛基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯山梨醇酐单棕榈酸酯、脂肪醇聚氧乙烯醚、聚乙二醇双月桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚中的一种或数种的混合物，浓度为0.05％‑5％(m/V)，优选的浓度为0.1％‑4％(m/V)，更优选的浓度为0.2‑3％(m/V)。 [0011] 优选的，所述金属离子为钠离子、锂离子、钙离子、镁离子、锰离子、锌离子中的一种或数种的混合物，浓度为1mM‑50mM，优选的浓度为2mM‑40mM，更优选的浓度为3mM‑30mM。 [0012] 优选的，所述蛋白酶K缓冲液为三羟基氨基甲烷‑盐酸、磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠、硼酸‑硼酸钠、磷酸氢二钠‑磷酸二氢钾、磷酸二氢钾‑氢氧化钠、巴比妥钠‑盐酸或甘氨酸‑氢氧化钠的一种或数种，浓度为1mM‑100mM，优选的浓度为5mM‑70mM，更优选的浓度为10mM‑50mM，蛋白酶K缓冲液的pH值为7.0‑9.0，优选的pH值为7.5‑8.5，更优选的pH值为8.0。 [0013] 优选的，所述蛋白酶K溶液还包括金属离子，所述金属离子为钠离子、锂离子、钙离子、镁离子、锰离子、锌离子中的一种或数种的混合物，浓度为1mM‑50mM，优选的浓度为2mM‑40mM，更优选的浓度为3mM‑30mM。 [0014] 优选的，所述蛋白酶K溶液还包括甘油，甘油浓度为0.1％‑50％(m/V)，优选的浓度为0.2％‑30％(m/V)，更为优选的浓度为0.5％‑20％(m/V)。 [0015] 本发明还公开了上述的处理生物样本的试剂在裂解生物样本中的应用。 [0016] 优选的，其步骤为：取生物样本，加入至离心管中，加入裂解液和蛋白酶K溶液，摇晃混匀后离心，加热使样本裂解，加热过程中过一段时间充分混匀一次。 [0017] 优选的，加热温度为37‑65℃。 [0019] 优选的，加热温度为70‑90℃，加热时间为10‑30分钟。 [0020] 优选的，加热温度为75‑80℃，加热时间为15‑20分钟。 [0021] 优选的，稀释倍数为2‑100倍。 [0022] 优选的，稀释倍数为20‑50倍。 [0023] 裂解完全的样本经加热和稀释处理后，可以直接进行PCR扩增。所述的加热处理可以降解蛋白变性剂，降低蛋白变性剂对于PCR扩增的抑制，同时可以灭活蛋白酶K。所述的稀释处理可以降低样本裂解液中PCR抑制物的浓度，并降低核酸的浓度，使其更有利于PCR扩增。所述的稀释处理的稀释倍数为2‑100倍，优选的，所述的稀释倍数为20‑50倍。 [0024] 裂解的完全的样本还可以直接进行核酸富集操作。所述的核酸是指DNA，尤其是基因组DNA，所述的核酸富集操作包括手动法和自动化法，所述的核酸富集操作需要使用配套的提取试剂，提取试剂可以来自商品化的提取试剂盒。 [0025] 本发明涉及的生物样本主要指动物组织样本，所述动物组织样本包括肌肉、血液、肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺、肠、脑、鼠尾等样本，对于培养的细胞也具有良好的效果。所述的动物组织样本，可以不进行研磨破碎处理，直接使用本发明提供的试剂即可完成样本裂解。所述的动物组织样本，可以是新鲜的样本，也可以是冻存样本，或者石蜡包埋的动物组织样本。对于石蜡包埋的动物组织样本，需要先进行脱蜡处理，然后使用本发明提供的试剂进行裂解。 [0026] 本发明的有益效果： [0027] 本发明的裂解液具有良好的动物组织消化和裂解的效果，蛋白酶K溶液中的表面活性剂和金属离子具有保持蛋白酶K稳定的作用，尤其是在长时间加热的条件下具有显著的效果。得益于以上效果，本发明试剂可以高效且持久的进行生物样本的裂解，尤其在加热条件下可以保持较好的裂解性能，对于较难裂解的动物组织样本，无需研磨破碎即可进行裂解。裂解后的动物组织样本，经加热和稀释处理后，可以直接进行PCR扩增或核酸富集操作。所述的加热处理可以降解蛋白变性剂，并且灭活蛋白酶K。所述的稀释处理可以降低PCR抑制物的浓度，降低核酸浓度，使其更有利于PCR扩增。附图说明 [0029] 图2为实施例6的琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA Marker(翌圣生物，10507)，1‑5分别为样本裂解液稀释5倍、20倍、50倍、100倍、250倍后的扩增产物。 [0030] 图3为实施例7的琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA Marker(翌圣生物，10507)，1‑7分别为每份猪肝脏组织提取得到的核酸。 [0031] 下面结合附图对本发明的具体实施方式做进一步说明。 具体实施方式[0032] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。 [0033] 实施例1： [0034] 裂解液的配制：取4M尿素溶液25mL，十二烷基硫酸钠0.5g，月桂醇聚氧乙烯醚1g，加入至100mL容量瓶中，用20mM pH 8.0的Tris溶液定容至100mL，充分摇匀使试剂彻底溶解至均匀溶液，即得到裂解液。 [0035] 实施例2： [0036] 蛋白酶K溶液的配制：取20mg蛋白酶K冻干粉，50mM氯化钙溶液100μL，100μL甘油，0.1％(m/V)月桂醇聚氧乙烯醚溶液100μL，上述试剂混合后加入20mM pH 8.0的Tris溶液定容至1mL，即得蛋白酶K溶液。 [0037] 实施例3： [0038] 取小鼠肝脏组织15mg，加入至1.5mL离心管中，继续加入150μL裂解液，15μL蛋白酶K溶液，充分摇匀后短暂离心，置于63℃金属浴中加热处理，加热过程中每隔一段时间充分摇匀一次。样本经加热处理约2小时后即完全裂解，形成透明均匀的溶液。 [0039] 实施例4 [0040] 取猪肺组织20mg，加入至1.5mL离心管中，继续加入180μL裂解液，20μL蛋白酶K溶液，充分摇匀后短暂离心，置于63℃金属浴中加热处理，加热过程中每隔一段时间充分摇匀一次。样本经加热处理约3小时后即完全裂解，形成透明均匀的溶液。 [0041] 实施例5 [0042] 取鼠尾尖约2mm，加入至1.5mL离心管中，继续加入100μL裂解液，20μL蛋白酶K溶液，充分摇匀后短暂离心，置于60℃金属浴中加热处理，加热过程中每隔一段时间充分摇匀一次。样本经加热处理约2小时后即完全裂解，有毛发残留，经短暂离心后，上清液为透明均匀溶液。 [0043] 实施例6 [0044] 取猪肾组织15mg，加入至1.5mL离心管中，继续加入130μL裂解液，20μL蛋白酶K溶液，充分摇匀后短暂离心，置于63℃金属浴中加热处理，加热过程中每隔一段时间充分摇匀一次。样本经加热处理约2小时后即完全裂解，形成透明均匀的溶液。将裂解完全后的溶液置于80℃加热处理15分钟，加热结束后取裂解后的样本溶液，用纯水分别稀释5倍，20倍，50倍，100倍，250倍，将稀释后的溶液作为模板进行PCR扩增。所述的模板用量为5μL，所述的PCR反应体系为20μL，PCR试剂来自翌圣(货号11184)，使用sTERT4引物。反应结束后，将扩增产物进行凝胶电泳。 [0045] 反应体系： [0046] [0047] [0048] 反应程序： [0049] [0050] 实验结果：样本裂解液稀释20倍和稀释50倍作为模板，荧光定量PCR测试的Ct值基本相同，但稀释50倍的荧光增峰更高。裂解液稀释5倍后无法正常扩增，裂解液稀释100倍和250倍的Ct值有所延后(图1)。将上述荧光定量PCR产物进行凝胶电泳，其结果如图2所示，其中M为Marker,1号为稀释5倍样本，2号为稀释20倍样本，3号为稀释50倍样本，4号为稀释100倍样本，5号为稀释250倍样本。 [0051] 实施例7 [0052] 取7份15mg的猪肝脏组织，分别加入至1.5mL离心管中，每份加入180μL裂解液，20μL蛋白酶K溶液，充分摇匀后短暂离心，置于63℃金属浴中加热处理，加热过程中每隔一段时间充分摇匀一次。样本经加热处理约2小时后即完全裂解，形成透明均匀的溶液。向裂解完全的样本溶液中分别加入400μL结合液(自配)，充分混合均匀后转移至核酸纯化柱中(来自翌圣试剂盒)，静置2分钟后8000rpm离心1分钟，弃去废液；继续向核酸纯化柱中加入700μL漂洗液(自配)，静置2分钟后8000rpm离心1分钟，弃去废液；继续向核酸纯化柱中加入700μL洗涤液(自配)，静置2分钟后8000rpm离心1分钟，弃去废液；重复上一步骤一次，12000rpm离心2分钟除去核酸纯化柱中残留的洗涤液；将核酸纯化柱晾干约3分钟，向核酸纯化柱膜中滴加70μL洗脱液，置于60℃金属浴中加热5分钟，然后10000rpm离心1分钟得到纯化后的核酸溶液。所得的核酸溶液进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示。 |
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