一种皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器
| 热词 | 毛细管 毛细 细胞 单细胞 pl 锥形 裂解 样品 溶液 吸入 | ||
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202210063822.9 | 申请日 | 2022-01-20 |
| 公开(公告)号 | CN114441264B | 公开(公告)日 | 2023-05-30 |
| 申请人 | 复旦大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 张祥民; 翁凌霄; 高明霞; 晏国全; | 第一发明人 | 张祥民 |
| 权利人 | 复旦大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 复旦大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：上海市杨浦区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：上海市杨浦区邯郸路220号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：200433 |
| 主IPC国际分类 | G01N1/28 | 所有IPC国际分类 | G01N1/28 ; G01N30/06 ; G01N30/88 ; C12M1/00 ; C12M1/26 ; C12M1/40 ; C12M3/06 |
| 专利引用数量 | 8 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 8 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 上海正旦专利代理有限公司 | 专利代理人 | 张磊; |
| 摘要 | 本 发明 提出一种皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器，将毛细管反应器内表面修饰上与 蛋白质 反应的基团，通过注射 泵 连接毛细管，从头端依次吸入含有单个细胞的溶液及裂解缓冲溶液，缓慢推出两种溶液使二者悬挂在毛细管头端进行充分混合，再吸回毛细管内使单细胞内的蛋白质与毛细管内壁的基团反应后固定在反应器内表面、随后依次从毛细管头端吸入还原 试剂 、烷基化试剂及酶 接触 已固定的蛋白并反应，实现单细胞在毛细管管口的裂解，毛细管内蛋白质的固定及酶解，酶解后得到的肽直接转移至液质连用仪器中进行单细胞蛋白组分离鉴定。利用本发明实现了单个细胞样品的裂解酶解，处理体积为皮升级，改善了单细胞蛋白质样品处理中的样品损失问题，为单细胞蛋白质组学分析提供新的工具。 | ||
| 权利要求 | 1.一种皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器，其特征在于，所述裂解酶解反应器由锥形头、毛细管和与氨基或羧基反应的基团组成，所述毛细管一端设有锥形头，锥形头毛细管内表面设置有与氨基或羧基反应的基团，所述裂解酶解反应器由进行单细胞样品处理的装置实现，所述装置由注射泵、进样针、三维平台、显微镜和升降台组成，注射泵、进样针和三维平台均放置于升降台上，注射泵一端连接进样针，裂解酶解反应器一端放置于三维平台上，锥形头一端放置于显微镜下，进样针一端连接毛细管非锥形头一端；通过注射泵推动进样针，使毛细管从锥形头一端依次吸入含有单个细胞的PBS溶液及裂解缓冲溶液，然后缓慢推出两种溶液，使二者悬挂在毛细管的锥形头端进行充分混合，再吸回毛细管内表面使单个细胞内的蛋白质与毛细管内表面的与氨基或羧基反应的基团反应后，固定在毛细管内表面，随后依次从毛细管锥形头端吸入还原试剂、烷基化试剂及酶，使这些试剂接触已固定的蛋白并之反应，实现单细胞在毛细管锥形口的裂解，毛细管内蛋白质的固定及酶解，酶解后得到的肽，直接转移至液质连用仪器中，进行单细胞蛋白组分离鉴定。 |
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| 说明书全文 | 一种皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器技术领域背景技术[0002] 单细胞分析在近年来已经得到了越来越多的关注。随着生命科学的发展，研究者发现单个细胞间存在差异，即细胞间存在异质性。并且细胞的异质性在生命过程中具有重要作用。传统基于大量细胞的研究因为仅能够得到细胞群体平均的数据，已经越来越难以满足现在生物医学研究领域对生命过程更加深入的研究需要。因此，对于单个细胞进行研究并分析细胞间的异质性具有重要意义。 [0003] 目前单细胞的基因组及转录组已经发展得较为成熟，研究者能够从这两种组学分析中发现一些信息。但蛋白质作为生命功能的主要执行者，对它进行分析能够更加直观地了解细胞内生命活动的状态。并且研究表明，蛋白质实际的水平与转录组推断得到的数据有很大差异，因此对于单细胞的蛋白质进行直接分析是非常必要的。在实现单细胞蛋白质组学分析的各种方法中，基于液相色谱‑质谱联用的方法能够更加全面地获得单个细胞内蛋白质的信息，因此引起了研究者们的关注。然而一个哺乳动物体细胞内的蛋白质仅为100‑200皮克，蛋白质无法像基因一样扩增，常规对于大量样品的处理方式不适用于单细胞样品。特别是使用质谱分析时样品内不能带有影响样品电离的表面活性剂等物质，充分进行细胞的破裂以及极少量蛋白质的酶解是很大的挑战。同时反应过程中样品与容器的接触损失，以及样品转移进入分析系统时的损失，都给单细胞蛋白质组学分析带来了很大限制。 因此需要发展一系列技术方法改善这些问题。 发明内容[0004] 本发明的目的是在一定程度上解决现有单细胞蛋白质组学分析样品处理技术上存在的问题。为此，本发明提出了一种皮升级单细胞样品裂解酶解方法，旨在进行单细胞样品的充分破裂，高效酶解，并减少单细胞样品处理过程中的损失，使分析结果更加可靠。 [0005] 本发明提出的一种皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器，所述裂解酶解反应器由锥形头、毛细管和与氨基或羧基反应的基团组成，所述毛细管一端设有锥形头，锥形头毛细管内表面设置有与氨基或羧基反应的基团，所述裂解酶解反应器由进行单细胞样品处理的装置实现，所述装置由注射泵、进样针、三维平台、显微镜和升降台组成，注射泵、进样针和三维平台均放置于升降台上，注射泵一端连接进样针，裂解酶解反应器一端放置于三维平台上，锥形头一端放置于显微镜下，进样针一端连接毛细管非锥形头一端；通过注射泵推动进样针，使毛细管从锥形头一端依次吸入含有单个细胞的PBS溶液及裂解缓冲溶液，然后缓慢推出两种溶液，使二者悬挂在毛细管的锥形头端进行充分混合，再吸回毛细管内表面使单个细胞内的蛋白质与毛细管内表面的与氨基或羧基反应的基团反应后，固定在毛细管内表面，随后依次从毛细管锥形头端吸入还原试剂、烷基化试剂及酶，使这些试剂接触已固定的蛋白并之反应，实现单细胞在毛细管锥形口的裂解，毛细管内蛋白质的固定及酶解，酶解后得到的肽，可以直接转移至液质连用仪器中，进行单细胞蛋白组分离鉴定。 [0007] 本发明中，所述毛细管锥形头通过打磨或拉制形成。 [0008] 本发明中，所述毛细管锥形头外表面修饰有疏水涂层。 [0010] 本发明中，所述吸入单个细胞的PBS溶液的体积为5‑1000 pL；所述吸入的裂解缓冲溶液的体积为5‑1000 pL。 [0011] 本发明中，所述裂解缓冲溶液内含有去污剂或蛋白变性剂，所述去污剂或蛋白变性剂为SDS、Triton X‑100、Triton X‑114、NP‑40、Tween 20、Tween 80、RIPA、CHAPS、CTAB、盐酸胍、尿素或硫脲中的一种或多种。 [0013] 本发明提出的皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器的实现方法，具体步骤如下： [0014] （1）取一根内径为10‑100微米的毛细管，使用乙醇、水、0.01‑1 mol/L NaOH、0.01‑1 mol/L HCl、水、乙醇分别冲洗5‑30 min，然后在25‑60℃下与试剂反应1min‑18h，使毛细管内表面修饰有与氨基或羧基反应的基团，反应完成后冲洗毛细管内表面，再使用砂纸将毛细管一端打磨或使用拉制仪拉制使毛细管一端形成锥形头，乙醇冲去杂质后，使用疏水涂层处理毛细管锥形头端外表面，毛细管尾端与注射泵上充满液体的进样针相连； [0015] （2）控制注射泵推动进样针，使毛细管锥形头端吸入一段空气后，吸入5‑1000pL含有单个细胞的PBS溶液，再吸入5‑1000 pL裂解缓冲溶液； [0016] （3）将所述含有单个细胞的PBS溶液与所述裂解缓冲溶液缓慢推动至所述毛细管锥形头，使其混合形成液滴，再吸回所述毛细管内，重复推吸2‑5次，最后将混合溶液吸回所述毛细管管内，再吸入空气及水，将所述裂解酶解反应器在25‑60℃水浴中反应1‑360 min，单细胞内的蛋白质与毛细管内壁的基团反应后固定在裂解酶解反应器内表面； [0017] （4）推出反应完成的溶液，使用水或缓冲溶液冲洗所述反应毛细管内表面； [0018] （5）在所述毛细管内吸入10‑3000 pL 0.01‑0.1mol/L还原试剂，37‑50℃下反应15‑60min，反应完成后推出还原试剂； [0019] （6）在所述毛细管内吸入10‑3000 pL 0.02‑0.3mol/L烷基化试剂，室温避光反应15‑60min，反应完成后推出烷基化试剂； [0020] （7）在所述毛细管内吸入10‑3000pL含有0.01‑0.5 ng/nL酶的缓冲溶液，37‑60℃反应10‑720 min，得到单细胞多肽样品。 [0021] 本发明的有益效果在于：单个细胞在皮升级体积的反应器内进行反应，与传统样品处理方法相比，小体积的尺寸效应带来高的反应速率；同一反应器内完成的皮升级体积样品处理过程使样品与表面接触面积减小，减少了接触带来的吸附损失；反应器头端外表面的疏水化修饰减小了溶液混合时的吸附损失，也减小了后续将样品转移至液质系统分析时的损失。附图说明 [0022] 图1 为根据本发明的一个实施例的皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器示意图。 [0023] 图2 为根据本发明的一个实施例的皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器毛细管内细胞裂解及蛋白固定过程示意图。 [0024] 图3 为根据本发明的一个实施例的使用皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器进行单细胞样品处理的装置结构示意图。 [0025] 图中标号：1为锥形头，2为毛细管外表面，3为毛细管内表面，4为与氨基反应的基团，5为注射泵，6为进样针，7为三维平台，8为单细胞样品裂解酶解反应器，9为显微镜，10为升降台。 具体实施方式[0026] 下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。 [0027] 实施例1 [0028] 使用皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器进行500 pL单个HeLa细胞多肽样品的制备。 [0029] 培养至70%的HeLa细胞使用0.25%胰蛋白酶从培养皿上消化下来，PBS洗涤2次后重悬于1 mL含有10 mM EDTA二钠的PBS溶液中。 [0030] 毛细管内径为25微米，外径为360微米，在连入系统之前使用乙醇、水、0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl、水、乙醇分别冲洗10min，然后在60℃下与0.1M GLYMO乙醇溶液反应12h，使毛细管内表面修饰有环氧基团，反应完成后使用乙醇冲洗，使用砂纸将毛细管一端打磨至锥形，乙醇冲去表面杂质后，使用全氟癸基三乙氧基硅烷处理毛细管锥形头外表面，然后非锥形头一端连接上注射泵上充满水的1μL平头进样针用于样品处理。 [0031] 在显微镜观察下，控制注射泵使毛细管锥形头吸入200 pL空气；通过操作三维平台使毛细管锥形头对准一个HeLa细胞，控制注射泵将100 pL含单个HeLa细胞的PBS溶液吸入毛细管中；将毛细管锥形头伸入水中，移动清洗锥形头外表面；在毛细管中继续吸入100 pL裂解缓冲液，裂解缓冲液中含有0.2M Na2HPO4以及0.2% SDS；控制注射泵使总体积为200pL的反应混合液在毛细管锥形头混合，再吸回毛细管中；在间隔200 pL空气后，再在反应毛细管中吸入500pL水防止反应液体蒸发。 [0032] 将毛细管置于水浴中， 60℃反应60 min。反应完成后将反应混合液推出，并使用0.2 μL进样针内原先充满的脱气水洗涤毛细管内表面。 [0033] 在反应毛细管内吸取500 pL 10 mM DTT溶液，移动溶液位置使其充满前面的反应混合液反应位置，50℃下反应30min后，将液体推出毛细管。 [0034] 在反应毛细管内吸取500 pL 30 mM IAA溶液，移动溶液位置使其充满前面的反应混合液反应位置。室温避光反应30min后，将液体推出毛细管。 [0035] 在反应毛细管内吸入500 pL 0.2 ng/nL Trypsin溶液，溶液中的缓冲盐为50mM 碳酸氢铵，移动溶液位置使其充满前面的反应混合液反应位置。50℃反应30min后得到500 pL单个HeLa细胞多肽样品。 [0036] 整个反应过程中单细胞蛋白样品处理体积为皮升级，反应溶液与容器接触的面积2 约为0.2mm 。与使用传统方法在离心管中进行的方法相比，反应溶液与容器的接触面积大大减小，减小了样品因为与容器接触而造成损失的可能性。 [0037] 实施例2： [0038] 使用皮升级体积单细胞样品裂解酶解反应器进行2000 pL单个MCF‑7细胞多肽样品的制备。 [0039] 培养至70%的MCF‑7细胞使用0.25%胰蛋白酶从培养皿上消化下来，PBS洗涤2次后重悬于1 mL含有10 mM EDTA二钠的PBS溶液中。 [0040] 毛细管内径为50微米，外径为360微米，在连入系统之前使用乙醇、水、0.01 mol/L NaOH、0.01 mol/L HCl、水、乙醇分别冲洗30min，然后在25℃下与三氟乙磺酰氯二氯甲烷溶液反应18h，使反应毛细管内表面修饰有tresyl基团，反应完成后使用二氯甲烷冲洗，使用砂纸将毛细管一端打磨至锥形，二氯甲烷冲去表面杂质后，使用表面疏水处理剂Aquapel(PPG Industries, USA)处理毛细管锥形头外表面，然后非锥形头一端连接上注射泵上充满水的10μL平头进样针用于样品处理。 [0041] 在显微镜观察下，控制注射泵使反应毛细管锥形头吸入2000 pL空气；通过操作三维平台使毛细管锥形头对准一个MCF‑7细胞，控制注射泵将1000 pL含单个MCF‑7细胞的PBS溶液吸入毛细管中；将毛细管锥形头伸入水中，移动清洗锥形头外表面；在毛细管中继续吸入1000 pL裂解缓冲液，裂解缓冲液中含有0.2M Na2HPO4以及0.01% Tween 20；控制注射泵使总体积为2000pL的反应混合液在毛细管锥形头混合，再吸回毛细管中；在间隔2000 pL空气后，在毛细管中吸入2000 pL水防止反应液体蒸发。 [0042] 将毛细管置于水浴中， 37℃反应30 min。反应完成后将反应混合液推出管口，并使用2μL进样针内原先充满的脱气水洗涤毛细管内表面。 [0043] 在毛细管内吸取2000 pL 10 mM DTT溶液，移动溶液位置使其充满前面的反应混合液反应位置，50℃下反应60 min后，将液体推出管口。 [0044] 在毛细管内吸取2000 pL 30 mM IAA溶液，移动溶液位置使其充满前面的反应混合液反应位置。室温避光反应30 min后，将液体推出管口。 [0045] 在毛细管内吸入2000 pL 0.05 ng/nL Trypsin溶液，溶液中的缓冲盐为25 mM 碳酸氢铵，移动溶液位置使其充满前面的反应混合液反应位置。37℃反应120min后得到2000 pL单个MCF‑7细胞多肽样品。 |
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