甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检测方法
| 热词 | 病毒 流感 流感病毒 甲型 乙型 呼吸道 pcr 呼吸 样本 荧光 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 驳回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 驳回 |
| 申请号 | CN202111558998.3 | 申请日 | 2021-12-20 |
| 公开(公告)号 | CN114427009A | 公开(公告)日 | 2022-05-03 |
| 申请人 | 杭州丹威生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 陶晔琪; 郭兴中; 曹玉婷; 孙艳; 张苗雷; 王敏涛; 陈文; 朱小娟; | 第一发明人 | 陶晔琪 |
| 权利人 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 杭州丹威生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：浙江省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：浙江省杭州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：浙江省杭州市余杭区仓前街道余杭塘路2959号4幢2层、6层601、9层902、1幢2层 | 邮编 | 当前专利权人邮编：311121 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/70 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/70 ; C12Q1/6804 ; C12Q1/686 ; C12N15/11 ; C12R1/93 |
| 专利引用数量 | 13 | 专利被引用数量 | 1 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 杭州君锐知产专利代理事务所 | 专利代理人 | 方琦; |
| 摘要 | 本 发明 涉及分子 生物 学领域，具体涉及一种甲型流感、乙型流感和 呼吸道 合胞病毒的多重富集检测方法。该方法是将呼吸道样本与分别偶联有甲型流感病毒 抗体 、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体的免疫 磁珠 混合，一定 温度 下混合孵育，使用 磁性 工具分离免疫磁珠‑病毒复合物，将复合物重悬于盐离子缓冲液中，将重悬的免疫磁珠‑病毒复合物进行加热裂解，使用磁性工具分离磁珠，对裂解产物（液体部分）使用 荧光 PCR检测 试剂 直接进行检测。 | ||
| 权利要求 | 1.一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的非诊断或治疗目的的多重富集检测方法，其特征在于具体包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检测方法技术领域背景技术[0002] 目前临床检验中应用的针对流感病毒和呼吸道合胞病毒的方法主要有：单独 检测一个病毒核酸检测方法，如甲型流感病毒核酸检测试剂(荧光PCR法)， 呼吸道合胞病毒核酸检测试剂(荧光PCR法)；多种病毒核酸联合检测方法， 如甲型乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂(荧光PCR法)等。但 目前所应用的荧光PCR检测方法，作为一种酶促反应，仍然存在样本处理繁琐、 对核酸纯度要求高、PCR检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点，另外在血筛 等临床检验中现有的检测方法也无法满足其灵敏度的要求；以上的不足导致目前 针对流感病毒和呼吸道合胞病毒的荧光PCR检测方法在临床检验中的应用受到 了限制，尤其无法满足门诊和急诊的需求。 [0003] 发明内容[0004] 本发明的目的是提供一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集 检测方法，以解决现有检测技术中存在的样本处理繁琐、对核酸纯度要求高、PCR 检测时间偏长、自动化成本偏高等缺点。 [0005] 基于上述目的，本发明采用以下技术方案： [0006] 一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检测方法，具体包括 如下步骤： [0008] S2、病毒的富集：将甲型流感病毒阳性或乙型流感病毒阳性或呼吸道合胞病毒阳 性的样本保存液，与三种偶联病毒抗体的免疫磁珠混合孵育； [0009] S3、用磁性工具分离免疫磁珠‑病毒复合物，将免疫磁珠‑病毒复合物重悬于TE 缓冲液中加热裂解； [0010] S4、用磁性工具分离磁珠，得到富集浓缩的病毒，用多重荧光PCR试剂对裂解 产物中的液体直接进行检测，所述荧光PCR试剂包含以下引物探针(表1)： [0011] 表1 [0012] [0013] 本发明检测方法主要过程是：将呼吸道样本与分别偶联有甲型流感病毒抗 体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体的免疫磁珠混合，一定温度下混合 孵育，使用磁性工具分离免疫磁珠‑病毒复合物，将复合物重悬于盐离子缓冲液 中，将重悬的免疫磁珠‑病毒复合物进行加热裂解，使用磁性工具分离磁珠，对 裂解产物(液体部分)使用荧光PCR检测试剂直接进行检测。使用多重荧光PCR 技术，在同一检测孔中加入13个引物探针，包含3个荧光通道，可检测甲型流 感病毒多个亚型(新型甲型H1N1流感病毒(2009)、季节性H1N1流感病毒、 H3N2、H5N2、H7N9)乙型流感病毒(Yamagata型及Victoria型)、呼吸道合 胞病毒(A型及B型)。在检测的同时可区分甲型流感、乙型流感和呼吸道合 胞病毒，有利于精准判断病情，辅助疾病早期的诊断和治疗。 [0014] 本发明所述的荧光PCR检测试剂中含有耐抑制抗干扰的PCR反应缓冲液和 快速扩增的DNA聚合酶，能对含有各种干扰物质的样本进行有效扩增和荧光检 测。 [0015] 作为优选，所述甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒等三种混合抗体均为 单克隆病毒表面抗体。 [0016] 作为优选，步骤S2所述病毒的富集具体方法为：取样本保存液200μL与三 种偶联病毒抗体的免疫磁珠各5μL混合，室温下(25‑37℃)混匀6‑15分钟。 [0017] 作为优选，步骤S3所述的加热裂解是：在85‑95℃加热5‑15分钟裂解病毒 释放核酸。 [0018] 作为优选，所述荧光PCR试剂还包含以下内标的引物探针： [0019] 引物 序列(5’‑3’) 序列号IC F CATCGCTGGTAACACCACC SEQ ID No:14 IC R AGTCCCTATGACAGAGAGAGAAG SEQ ID No:15 IC P CY5‑TCACTGGGCAGCAGCATGTGGCACC‑BHQ2 SEQ ID No:16 [0020] 作为优选，步骤S4所述荧光PCR试剂(15μL)包含以下组分： [0021] 组份 序列号 母液浓度 每人份用量(μL)IFA F SEQ ID No:1 100uM 0.12 IFA F1 SEQ ID No:2 100uM 0.12 IFA R SEQ ID No:3 100uM 0.12 IFA P SEQ ID No:4 100uM 0.045 IFB F SEQ ID No:5 100uM 0.12 IFB R SEQ ID No:6 100uM 0.12 IFB P SEQ ID No:7 100uM 0.045 RSVA F SEQ ID No:8 100uM 0.10 RSVA R SEQ ID No:9 100uM 0.10 RSVA P SEQ ID No:10 100uM 0.08 RSVB F SEQ ID No:11 100uM 0.10 RSVB R SEQ ID No:12 100uM 0.10 RSVB P SEQ ID No:13 100uM 0.06 IC F SEQ ID No:14 100uM 0.015 IC R SEQ ID No:15 100uM 0.015 IC P SEQ ID No:16 100uM 0.015 纯化水 / 8.125 合计 9.4 [0022] 作为优选，PCR扩增反应条件：52℃持续15min；95℃持续1min；(95℃ 持续5s；58℃持续30s并采集荧光)45个循环。 [0023] 作为优选，所述超顺纳米磁珠直径为200nm‑350nm，表面带有羧基(‑COOH) 基团。 [0024] 作为优选，所述免疫磁珠制备具体为：利用EDC活化法将单克隆表面抗体 连接到表面带羧基(‑COOH)的超顺纳米磁珠表面，并用BSA对偶联了抗体后 的磁珠进行封闭。 [0026] 作为优选，所述免疫磁珠所偶联的病毒抗体为指甲型流感病毒神经氨酸酶 (NA)抗体、乙型流感病毒神经氨酸酶(NA)抗体、呼吸道合胞病毒F蛋白抗体， 是单克隆抗体或多克隆抗体。 [0027] 相对于现有的甲型/乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒核酸联合荧光PCR检测 技术，本发明的有益效果在于：样本处理简单，因进行了富集浓缩而大幅提高检 测灵敏度，通过免疫识别和基因识别两道把关而特异性强，使用快速PCR试剂 而荧光PCR检测时间短等。附图说明 [0028] 图1为本发明甲型/乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒核酸联合荧光PCR检测 流程示意图； [0029] 图2为本发明甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒阳性样本在富 集后免核酸纯化荧光PCR检测的扩增曲线图，其中a、甲型流感病毒阳性样本， b、乙型流感病毒阳性样本，c、呼吸道合胞病毒阳性样本； [0030] 图3为对甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒阳性样本直接进行 核酸提取(甲型/乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒核酸(荧光PCR法))检测的 扩增曲线图，其中a、甲型流感病毒阳性样本，b、乙型流感病毒阳性样本，c、 呼吸道合胞病毒阳性样本； [0031] 图4为甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒阳性样本原液直接荧 光PCR检测扩增曲线图，其中a、甲型流感病毒阳性样本，b、乙型流感病毒阳 性样本，c、呼吸道合胞病毒阳性样本； [0032] 图5为甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒阳性样本经过病毒免 疫富集的样本上清液加热裂解后荧光PCR检测扩增曲线图，其中a、甲型流感病 毒阳性样本，b、乙型流感病毒阳性样本，c、呼吸道合胞病毒阳性样本。 具体实施方式[0033] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解， 本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/ 或改变都将落入本发明保护范围。 [0034] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和 原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明， 均为本领域的常规方法。 [0035] 下述实施例中所用的试剂，如无特殊说明，可以从常规生化试剂商店购买得 到。 [0036] 实施例1甲型流感病毒、乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒检测试剂的研制[0037] 一、引物探针的设计 [0038] 根据文献报道，选用甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒相对应 的保守区作为本发明试剂盒的目标基因，针对每种病毒分别设计了2对引物及相 对应的探针。并根据实验结果，综合考虑检出率、扩增线型、扩增效率等方面， 每个病毒选取一个引物组合。最终选择的各病毒的引物对及探针序列见表2。 [0039] 表2 [0040] [0041] 本发明内标引物探针的设计： [0043] 表3内标的引物、探针序列 [0044] [0045] 二、反应体系的建立和优化 [0046] 为了能最大限度提高了实验的可靠性和精密性，得到阳性符合率高的实验结 果，本发明对基因扩增系统特别是酶混合液和PCR反应缓冲液的主要成分进行 了优化，具体是： [0047] 酶混合液的组成为： [0048] [0049] 扩增反应液1的组成为： [0050] [0051] 扩增反应液2中引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况 下，对引物浓度进行梯度测试，对探针浓度进行梯度测试，经过多次对比试验， 最终确定的引物浓度和探针浓度见表4。 [0052] 表4扩增反应液2组成 [0053] [0054] [0055] 本发明对扩增反应条件优化后，确定为： [0056] 52℃持续15min；95℃持续1min；(95℃持续5s；58℃持续30s并采集荧 光)45个循环。 [0057] 实施例2甲型、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒阳性样本的检测 [0058] 一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检测方法，流程图见 图1，具体过程是： [0059] 一、方法 [0060] 1、配制甲型/乙型流感病毒和呼吸道合胞病毒核酸联合检测试剂(免提取荧光 PCR法)。 [0061] (1)配制PCR反应液 [0062] 原料名称 每人份体积(μL)酶混合液 1.6 扩增反应液1 4 扩增反应液2 9.4 样本 5 [0063] (2)分装PCR反应液 [0064] 将PCR反应液，按照15μL/反应，分装至PCR管中。 [0065] (3)免疫磁珠的制备：将甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒三种抗体分别 偶联至羧基修饰的超顺纳米磁珠上，得到三种偶联病毒抗体的免疫磁珠。所述超 顺纳米磁珠直径为200nm‑350nm。 [0066] 利用EDC活化法将单克隆表面抗体连接到表面带羧基(‑COOH)的超顺纳 米磁珠表面，并用BSA对偶联了抗体后的磁珠进行封闭。 [0067] 所述免疫磁珠的风干保存方法为：将免疫磁珠置于烘箱中，将温度调至 30℃‑37℃，开启通风，静置10小时以上后取出，于2‑8℃密封保存。 [0068] 2、样本处理 [0069] 取3份临床呼吸道样本(样板1为甲型流感病毒阳性，样本2为乙型流感病 毒阳性，样本3位呼吸道合胞病毒阳性)，每个样本均平行进行如下三组处理； [0070] (1)处理组‑免疫富集组 [0071] 将偶联有甲型流感病毒抗体、乙型流感病毒抗体、呼吸道合胞病毒抗体的免 疫磁珠各5μL添加至离心管中，再加入200μL样本，使其与免疫磁珠混合，使 用移液器轻缓吹吸5‑6次； [0072] 室温孵育10分钟； [0073] 使用磁力架进行磁分离，弃上清，在剩余磁珠中加入25μL TE； [0074] 90℃加热5分钟。使用磁力架进行磁分离； [0075] 取上清5μL加入到PCR管中，准备上机检测； [0076] (2)对照组1‑提取检测组 [0077] 取200μL样本，加入到核酸提取试剂中，进行核酸提取，将提取好的核酸 5μL加到PCR管中，准备上机检测； [0078] (3)对照组2‑原液检测组 [0079] 样本混匀后，直接取样本5μL进行加到PCR管中，准备上机检测； [0080] (4)对照组3‑上清检测组 [0081] 将(1)免疫富集组磁分离后的上清作为样本，90℃加热5分钟后取上清5μL 加入到PCR管中，准备上机检测。 [0082] 3、上机检测 [0083] 将完成加样的PCR管放入荧光PCR仪中，进行荧光PCR扩增，检测程序： 52℃持续15min；95℃持续1min；(95℃持续5s；58℃持续30s并采集荧光) 45个循环。 [0084] 二、结果及分析 [0085] 设备检测程序运行完成后，观察扩增曲线图，读取Ct值； [0086] 本发明甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒阳性样本在富集后免 核酸纯化荧光PCR检测的扩增曲线见图2，对照组1(未富集)、对照组2、对 照组3的扩增曲线分别见图3，图4和图5。各处理组检测结果(荧光曲线Ct 值)如表5所示。 [0087] 表5 [0088] [0089] [0090] 说明：FAM：呼吸道合胞病毒；VIC：乙流病毒；ROX：甲流病毒。 [0091] 根据图2，图3，图4和图5，以及表5可知，免疫富集处理后进行检测(本 发明)，与常规提取后检测对照组的检测效率(Ct值小者效率更高)检测效率 更高，与直接扩增对比也有显著优势；而与上清液检测结果的比较说明本发明的 免疫富集具有较好的病毒捕获能力。 [0092] 实施例3 [0093] 一种检测甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的引物探针组合，该组合是 由表2所示的引物探针，以及表3所示的内标引物探针组成。该组合用于对甲型、 乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒阳性样本的检测。 [0094] 实施例4 [0095] 一种甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的检测试剂盒，该检测试剂盒中 包括用于多重荧光PCR检测的荧光PCR试剂，所述荧光PCR试剂含有实施例3 所述的引物探针组合，且含有DNA聚合酶及逆转录酶、镁离子、dNTP及表面 活性剂等。 [0096] PCR试剂组成为(15μL)： [0097] [0098] 其中，扩增反应液2的组成见表4。 [0099] 该试剂盒使用时，加入5μL样本，反应体系为20μL。 [0100] 本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与 其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实 施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单， 相关之处参见方法部分说明即可。 [0101] 以上对本发明所提供的甲型流感、乙型流感和呼吸道合胞病毒的多重富集检 测方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行 了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还 可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保 护范围内。 |
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