一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液及其制备方法
| 热词 | 保存 样本 rnaase rna 病毒 核酸 rt covid 灵敏度 灵敏 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202110730255.3 | 申请日 | 2021-06-29 |
| 公开(公告)号 | CN113462750A | 公开(公告)日 | 2021-10-01 |
| 申请人 | 浙江峻山生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 张锋; 吴金荣; | 第一发明人 | 张锋 |
| 权利人 | 浙江峻山生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 浙江峻山生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：浙江省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：浙江省绍兴市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：浙江省绍兴市杭州湾上虞经济技术开发区 | 邮编 | 当前专利权人邮编：312300 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/6806 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/6806 ; C12Q1/70 ; C12N15/10 |
| 专利引用数量 | 7 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京维正专利代理有限公司 | 专利代理人 | 全万志; |
| 摘要 | 本 申请 涉及医学分子检测领域，更具体地说，它涉及一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液及其制备方法，其中样本保存液包括如下浓度范围成分的缓冲溶液：胍盐裂解剂：3～6 M； 金属离子 络合剂：0.1～1 mM；外源非特异RNA：10～200 ng/L；二硫键还原剂：5～50 mM；缓冲溶液的浓度为6～10 mM，该保存液的pH值为7.0～8.0。该样本保存液的制备方法如下：称取胍盐裂解剂和金属离子络合剂，溶解于 水 中，再依次加入二硫键还原剂、非离子 表面活性剂 ，再加入缓冲对离子配置成缓冲溶液，并调节pH值为7.0～8.0，随后加入 酵母 RNA并定容，混合均匀后得到样本保存液。在本申请中，通过添加酵母RNA，可以提高样本对RNAase的耐受性，进而提高样本的保存效果。 | ||
| 权利要求 | 1.一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液，其特征在于，包括缓冲溶液，所述缓冲溶液中添加有如下浓度范围组分： |
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| 说明书全文 | 一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液及其制备方法技术领域[0001] 本申请涉及医学分子检测领域，更具体地说，它涉及一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液及其制备方法。 背景技术[0004] 为了减少RNAase在制备和保存核酸样本过程中对DNA或RNA的影响，提高检测灵敏度，本申请提供一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液及其制备方法。 [0005] 一方面，本申请提供了一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液，具体采用如下技术方案：一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液，包括缓冲溶液，所述缓冲溶液中添加有如下浓度范围组分： 胍盐裂解剂：3～7M； 金属离子络合剂：0.1～1mM； 外源非特异RNA：10～200ng/L； 二硫键还原剂：1～100mM； 缓冲溶液的浓度为1～20mM，该保存液的pH值为5.5～8.5。 [0006] 在上述技术方案中，配置得到的保存液配方中，胍盐裂解剂具有溶解蛋白质、促进细胞破碎的作用，同时也可以使RNAase变性，进而起到保护RNA分子的作用。金属离子络合剂的目的同样是抑制RNAase的反应活性，延长RNA的保存时间的同时，提高检测的灵敏度。二硫键还原剂的作用则在于还原RNAase中的二硫键，进一步破坏 RNAase的结构。 [0007] 加外源非特异性RNA可以作为封闭剂，起到保护RNA的作用，同时在进行 RT‑PCR实验时可以提高反应效率，形成更好的峰形。另外，外源非特异性RNA对检测结果不会产生影响，也不会抑制RT‑PCR过程中的扩增反应。 [0008] 综上所述，采用上述技术方案配置得到的样本保存液，具有较好的抑制RNAase 对病毒RNA的影响的效果，减少“假阴性”的现象发生，提高检测的灵敏度。 [0009] 可选的，所述外源非特异RNA为酵母RNA。 [0011] 可选的，在缓冲溶液中，添加有占缓冲溶液总体积0.01～1vt％的非离子表面活性剂。 [0012] 非离子表面活性剂可以溶解脂蛋白，使病毒更容易裂解，释放核酸，进而提高病毒中的病毒核酸与其他成分的分离效率，进一步提高核酸检测的灵敏度。 [0014] 聚山梨酯类表面活性剂、聚氧乙烯醚类表面活性剂和聚乙二醇醚类表面活性剂具有较好的生物相容性，同时对脂蛋白的裂解效率较好，对RNA的影响较小，具有更好的适用性。 [0015] 可选的，在缓冲溶液中，还添加有占缓冲溶液体积0.5～8vt％的多元脂肪醇，所述多元脂肪醇为乙二醇、1，3‑丙二醇、丙三醇、丁二醇、季戊四醇中的一种。 [0016] 通过添加多元醇，在核酸冻存至低温状态时，有助于保护核酸结构，不易因反复冻融而损坏，进一步提高保存液对于核酸的保存性能。 [0017] 可选的，所述缓冲溶液中，添加有浓度为0.1～20mM的透明质酸。 [0018] 透明质酸具有较好的交联能力，加入后对于核酸的高级结构具有较好的定型效果，使得该保存液的保存能力更强。 [0019] 可选的，所述金属离子络合剂为EDTA、8‑羟基喹啉中的一种。 [0021] 可选的，所述二硫键还原剂为DTT、TCEP或β巯基乙醇中的一种，所述胍盐裂解剂为异硫氰酸胍。 [0022] DTT、TCEO和β巯基乙醇可以促进异硫氰酸胍的变性效果起到促进作用，进一步提高对RNAase的破坏效果，并提高病毒核酸检测的灵敏度。 [0023] 可选的，该样本保存液的保存温度为‑80～30℃。 [0024] 在‑80～30℃下进行保存，可以实现较长的储存时间，即使在室温下也可以进行长期储存，不影响其使用效果，储存方式较为方便，且保质期较长。 [0025] 另一方面，本申请提供了上述提高核酸检测灵敏度的样本保存液的制备方法，采用如下步骤：称取胍盐裂解剂和金属离子络合剂，溶解于水中，再依次加入二硫键还原剂、非离子表面活性剂，再加入缓冲对离子配置成缓冲溶液，并调节pH值为7.0～ 8.0，随后加入酵母RNA并定容，混合均匀后得到样本保存液。 [0026] 在上述技术方案中，配置得到的样本保存液，对于RNAase有较好的耐受性，有助于保护病毒RNA样本，降低RNAase的影响，提高检测的灵敏度。 [0027] 综上所述，本申请至少包括如下一种有益效果：1.在本申请中，通过胍盐裂解剂、金属络合离子、二硫键还原剂的配合，并加入酵母 RNA，通过酵母RNA保护病毒RNA，减少RNAase对于病毒RNA的分解作用，提高核酸检测的灵敏度。 [0029] 图1是本申请中实验1中实施例3所用的样本保存液保存COVID‑2019假病毒进行耐RNAase实验时的Ct值变化趋势图。 [0030] 图2是实施例23所用的样本保存液保存空白样本并进行RT‑PCR实验时的扩增曲线图。 [0031] 图3是实施例23所用的样本保存液保存COVID‑19假病毒24h后进行RT‑PCR 实验时的扩增曲线图。 [0032] 图4是实施例23所用的样本保存液保存COVID‑19假病毒48h后进行RT‑PCR 实验时的扩增曲线图。 [0033] 图5是实施例23所用的样本保存液保存COVID‑19假病毒5d后进行RT‑PCR实验时的扩增曲线图。 [0034] 图6是对比例3所用的样本保存液保存COVID‑19假病毒24h后进行RT‑PCR实验时的扩增曲线图。 [0035] 图7是对比例3所用的样本保存液保存COVID‑19假病毒48h后进行RT‑PCR实验时的扩增曲线图。 [0036] 图8是对比例3所用的样本保存液保存COVID‑19假病毒5d后进行RT‑PCR实验时的扩增曲线图。 具体实施方式[0037] 以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明。 [0038] 实施例1，一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液，通过如下方法配置：按照计量，将异硫氰酸胍和EDTA溶于适量水中，水的用量以充分溶解为度，随后向水中依次加入DTT、吐温‑20和Tris‑HCl，充分搅拌溶解后，用氢氧化钠调节pH值至7.4，随后加入酵母RNA，并定容至各组分浓度如表1所示。 [0039] 在上述配置过程中，所用的器具均通过DEPC水漂洗，再彻底烘干后，方可进行使用。 [0040] 实施例2～21，一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液，与实施例1的区别在于，加入的组分及组分的浓度有区别，具体如表1所示。表1、实施例1～21中样本保存液的组分及配比 [0041] 另外，针对上述实施例，设置对比例1～5，与实施例1的区别在于，具体组分有所不同，详见表2。表2、对比例1～5中样本保存液的组分及配比 [0042] 在以上实施例中，酵母RNA购买自北京索莱宝科技有限公司，型号为CAS号 63231‑63‑0。 [0043] 针对上述实施例和对比例，其具体使用方法，参照《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第四版)》进行。采用上述保存液，对购买自novoprotein的 COVID‑2019假病毒，稀释至终浓度为105copies/mL，按照下述的实验方法保存特定的时间后，进行RT‑PCR实验，选用引物ORF1ab和引物N，测定其Ct值。 [0044] 在RT‑PCR实验中，样本通过如表3所示的反应体系和反应程序进行扩增反应。表3、样本在RT‑PCR实验中的扩增反应体系和反应程序 [0045] 上述反应中，选择FAM通道和VIC通道进行检测，并保留检测数据，得到样本对于ORF1ab和N基因的Ct值。若各通道CT值≤34，且扩增曲线为典型的“S”型，则相应的靶标基因检测结果为阳性。若FAM和VIC通道无明显扩增曲线，或Ct值>40，则相应的靶标基因检测结果为阴性；若出现其他情况，则需重新检测。 [0046] 若原本为阳性的样本，在检测时得到结果为阴性，则该样本记录为“假阴性“样本。 [0047] 对于上述样本保存液，通过以下实验对比，判定其保存效果。 [0048] 实验1、RNAase耐受性实验：向上述保存有COVID‑19假病毒的样本保存液中，加入人源上皮细胞(购买自明舟生物，货号MZ‑M0498)，每组样本保存液保存二十个样本，保存于‑20℃环境中，进行平行实验，记录样本放置24h和48h后测定得到的阴性的数量。 [0049] 全部实施例在实验2中的具体实验结果如表4所示。表4、实施例2～21和对比例1～5在实验1中的实验结果 [0050] 在上述实验数据中，可知，采用本申请中所用的样本保存液对病毒RNA进行保存，在人源皮肤细胞(含有一定量的RNAase)的干扰下，在24h内依然能够实现较为准确的测定，基本无假阴性现象。而在48h后，以实施例4为基础的添加了非离子表面活性剂的样本，大部分均能检出阳性结果，对整体的影响较小。通过图1可知，随时间延长，在实施例3中，随时间延长，添加人源皮肤细胞后测得的Ct值会逐渐升高，但是最终大部分样本都具有较好的保存效果，在48h后依旧可以测得阳性结果，证明了本申请所用的样本保存液在一定时间范围内，具有较好的抗RNAase的效果。 [0051] 对比例3中添加了过量的酵母RNA，尽管出现假阴性的现象较少，但是在实际检测中，对空白样本的检测，出现部分样本有“假阳性”的表现行为，在实际检测中运用前景不佳。 [0052] 值得注意的是，在以上实施例中，外源非特异性RNA均选用了酵母RNA，其中所利用的属性，主要是酵母RNA的非特异性，即其在RT‑PCR实验中，不会对扩增曲线和信号产生影响。(在此通过阴性样本进行测定，结果如图2所示。)而其本身具有作为RNAase牺牲体的效果，且在各种层面上均可以对样本RNA进行保护，具有延长保存时间、降低假阴性出现概率的效果。 [0053] 另外，在上述实施例中，对各物质的用量及最终的pH值进行了调整，通过实验结果可以得到如下结论：1.实施例1～5对各组分的含量进行了调整，实施例3中的配方具有较为优化的实际配方，在测试过程中，对RNA具有较好的保护效果。 [0054] 2.在金属离子络合剂的选取中，8‑羟基喹啉由于络合能力略弱于EDTA，因此需要更高的浓度才能达到较好的效果。 [0055] 3.二硫键还原剂和缓冲溶液种类的选择中，选择人DTT、TCEP或β巯基乙醇均有较好的效果，其在PBS体系中和在Tris‑HCl体系中均具有较好的效果，可以依照实际需求选取。 [0057] 在以上实施例的基础上，选取最佳实施例——实施例3，进一步设置实施例如下。 [0058] 实施例22～36，一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液，与实施例3的区别在于，在实施例3的基础上，额外添加如表5所示的成分。表5、实施例22～36中额外添加成分表 成分 实施例22 实施例23 实施例24 实施例25 实施例26 吐温‑20(vt％) 0.01 0.1 0.5 1 2 NP‑40(vt％) 0 0 0 0 0 Triton X‑100(vt％) 0 0 0 0 0 成分 实施例27 实施例28 实施例29 实施例30 实施例31 吐温‑21(vt％) 0 0 0 0 0 NP‑41(vt％) 0.01 0.1 0.5 1 2 Triton X‑101(vt％) 0 0 0 0 0 成分 实施例32 实施例33 实施例34 实施例35 实施例36 吐温‑21(vt％) 0 0 0 0 0 NP‑41(vt％) 0 0 0 0 0 Triton X‑101(vt％) 0.01 0.1 0.5 1 2 [0059] 对于实施例22～37，对其进行实验1，测定其在48h和120h内的保存效果，实验结果如表6所示。表6、实施例22～37在实验1中的实验结果 [0060] 在上述实施例中，额外添加了表面活性剂，通过非离子表面活性剂对脂蛋白的溶解作用，脂蛋白的减少一方面减少了干扰，同时也是RNA具有更好的长效保存效果，在长期保存下(超过120h)依旧有大部分具有真实的检测结果，且对于外源的RNAase 在长效上具有更好的抗性，有助于进一步提高核酸的保存时间。三种非离子表面活性剂具有类似的效果，但是其最适浓度则有所不同，此处，选用实施例35中的方案，在其基础上，进一步设置以下实施例。 [0061] 实施例37～64，一种提高病毒核酸检测灵敏度的样本保存液，与实施例35的区别在于，进一步添加如表7所示的成分。表7、实施例37～64中额外添加成分一览表 [0062] 对于实施例37～64，采用保存液+假病毒+人源皮肤细胞的样本体系，进行实验 1，且，对于上述实施例中的每个样本，均设置三组，分别保存于‑80℃、‑20℃和30℃环境中，对于‑80℃和‑20℃的样本，在保存过程中经37℃环境反复冻融10次，保存时间分别为48h和120h，结果如表8所示。 表8、实施例和对比例在实验1中的实验结果 [0063] 在上述实施例和对比例中，添加了多元脂肪醇或透明质酸钠，多元脂肪醇具有较好的抗冻溶能力，在‑80～30℃范围内，均具有较好的长效保存效果，其中对于每种脂肪醇，均设置了多组浓度对比，不同的多元脂肪醇所需的浓度不同，其最终效果也不同。其中季戊四醇相较于其他脂肪醇，具有抗冻溶能力较强的同时，在较高浓度下，常温下也可以具有较好的长效保存效果，使得该保存液在保存核酸的过程中，适用范围较广。 [0064] 实验2，采用实施例23及对比例3中的样本保存液，对COVID‑19假病毒进行保存24h、48h和120h，并进行RT‑PCR实验，其扩增曲线如图3～8所示。 [0065] 从图中可知，相较于对比例3中，实施例23中所用的添加了酵母RNA和表面活性剂，可以在长时间维度上形成较好的扩增曲线，相较于对比例3具有显著的优越性。证明本申请所用的技术方案，具有优化计量曲线、延长保存时间的有益效果。 |
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