| 热词 | 病毒 核酸 灭活 保存 试剂盒 提取 rna 样本 试剂 生物 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 撤回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 撤回 |
| 申请号 | CN202110212281.7 | 申请日 | 2021-02-25 |
| 公开(公告)号 | CN112899347A | 公开(公告)日 | 2021-06-04 |
| 申请人 | 苏州易迈吉生物医药科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 贾萌萌; 潘韵芝; 朱国强; | 第一发明人 | 贾萌萌 |
| 权利人 | 苏州易迈吉生物医药科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 苏州易迈吉生物医药科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省苏州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省苏州市相城区黄埭镇安民路6号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：215143 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/6806 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/6806 ; C12Q1/70 ; C12Q1/686 ; C12R1/93 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 9 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 专利代理人 | ||
| 摘要 | 本 发明 涉及分子 生物 学技术领域，具体涉及一种不含PH缓冲液高度兼容 磁珠 法病毒核酸提取 试剂 盒 的病毒保存液，其包含以下成分： 盐酸 胍，十二烷基 硫酸 锂，硫酸铵，曲拉通X‑100等蛋白变性剂和核酸保护成分，可以迅速灭活病毒以及DNA和RNA酶类，既具有裂解病毒样本的作用，同时也可以保护DNA和RNA的 稳定性 。本发明病毒保存液的不需要加入三(羟甲基) 氨 基甲烷盐酸盐、 乙二胺四乙酸 等PH缓冲液以及、异丙醇或 乙醇 等可能造成成分，不会对后续的提取造成干扰，能够与市场上常见的各类磁珠法病毒核酸提取试剂盒兼容，提取核酸时，样本与裂解液可以按试剂盒建议的比例至100％之间的任意比例混合，即可以少加甚至不加裂解液，进而提高样本的用量，获得更多的病毒核酸和更准确的检测结果。 | ||
| 权利要求 | 1.一种高度兼容磁珠法病毒核酸提取试剂盒的病毒保存液，其特征在于所述病毒保存液包含以下成分：盐酸胍，十二烷基硫酸锂，硫酸铵，曲拉通X‑100。 |
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| 说明书全文 | 一种不含PH缓冲液的兼容各种磁珠法病毒核酸提取试剂盒的灭活型病毒保存液 技术领域背景技术[0002] 呼吸道感染(Respiratory tract infection, RTI)是人类最常见的一类疾病，是全球范围内引起人群发病和死亡的最主要原因之一。目前已证明，大部分呼吸道疾病是病毒引起。病毒性感染的潜在危害极大，例如新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)，该病毒是一种先前未在人类中发现的新型冠状病毒，可导致急性感染性肺炎(COVID‑19)，感染者初始症状多为发热、乏力和干咳。后续逐渐出现呼吸困难，严重者可出现急性呼吸窘迫综合征或脓毒症休克，甚至死亡。 [0003] 病毒性感染的金标准是实时荧光定量PCR，是一种用于指数扩增特定的核酸片段并用荧光信号来判断待检测的靶标是否存在的分子诊断方法，其最大特点，是能将微量的核酸进行大量的富集和增加，从而达到便于检测微量核酸的目的。 [0004] 实时荧光定量PCR需要提取疑似样本中的核酸(DNA、RNA)来检测是否存在致病病毒。而受到时间或距离的限制，一般需要将待测样本保存一段时间，或送至特定的地点才能进行检测。 [0005] 目前市场上已有病毒保存液可以满足以上需求，比如Hank’s液、PBS溶液，但是也存在一些缺陷：1)需要低温保存，大大增加了样本的运输成本，如果操作不当，运输过程中无法达到所需低温条件，样本的核酸可能会降解。而为了灭活病毒，需要55°C处理一段时间，这样病毒RNA可能会大量降解，可能导致荧光定量PCR呈假阴性，影响病情的判断。2)无法快速灭活病毒，这样会对操作人员造成安全隐患。快速经约3mL保存液稀释后。 [0006] 目前主流磁珠法病毒核酸提取试剂盒都是蛋白酶K加裂解液，如易迈吉生物、诺维赞生物、海狸生物、之江生物、硕世生物等。在高浓度离子化剂和乙醇/异丙醇核酸沉淀剂的条件下，硅基磁性粒子可通过氢键和静电吸附核酸，吸附了核酸的纳米粒子经洗涤去除蛋白质和盐，最后可以用低盐缓冲液(如Buffer TE)或水洗脱出磁珠上的核酸。其中，硅基磁性粒子吸附核酸是影响最终核酸提取效率最为关键的一步，这一步中，加热温度，涡旋震荡幅度，PH值，乙醇/异丙醇的比例是关键参数，每家试剂盒的最优参数都是不一样的。任何干扰这些参数的因素都会影响试剂盒提取的效率甚至导致提取失败。市场上已有的灭活型病毒核酸保存液一般含有含有PH缓冲液或者乙醇/异丙醇成分，这样造成病毒保存液与病毒核酸提取试剂盒兼容性差，一种病毒保存液只能与特定的几家病毒核酸提取试剂盒兼容，无法兼容市面上已有的大部分病毒核酸提取试剂盒。因此，开发一种能快速释放核酸、不易造成交叉污染并且对后续核酸检测实验无影响的核酸快速释放方法成为目前亟待解决的问题。 发明内容[0007] 基于此，本发明的目的是提供一种具有保存和裂解能力、可以室温保存及运输、能与各类病毒核酸提取试剂盒兼容、安全性高的病毒保存液。 [0008] 本发明的灭活型病毒保存液的方法按照以下步骤进行：1. 将不同类型的样本与灭活型病毒保存液按照一定比列，涡旋振荡： 2. 拭子类样本(咽拭子/鼻拭子/肛拭子):将采样后的拭子头折断浸没于含有灭活型病毒保存液的采样管中，旋紧管盖； 3. 人工合成的假病毒，体外转录RNA样本: 取适量样品，稀释到一定体积的Buffer PBS/灭活型病毒保存液,振荡混匀； 4. 针对唾液，肺泡灌洗液样本前处理流程为: 取一定量的样本与灭活型病毒保存液按照体积比1：1混合。 [0009] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1. 本发明的灭活型病毒保存液强烈的蛋白变性剂，能够快速破解细胞、病毒的等蛋白结构；能够快速灭活样本中的病毒和其他病原微生物，安全性高； 2. 本发明的灭活型病毒保存液中的蛋白变性剂，可以完全抑制Dnase和Rnase活性，可以在常温条件下甚至高温下保护核酸，避免核酸尤其是RNA的降解，无需低温条件运输； 3. 本发明的灭活型病毒保存液，能够用于保存血清、血浆、尿液、唾液、口腔拭子、干血斑斑、法医学样品及多个样本来源的核酸； 4. 本发明的灭活型病毒保存液，不含PH缓冲液或者乙醇/异丙醇成分，能够与市场上常见的各类磁珠法病毒核酸提取试剂盒兼容。 附图说明 [0010] 图1是用本发明中灭活型病毒保存液口腔拭子假病毒样本，用市面上各个病毒核酸提取试剂盒提取病毒RNA，然后用荧光PCR检测：均正常扩增；图2是用本发明中灭活型病毒保存液37°C保存假病毒样本并提取：表明假病毒RNA在灭活型病毒保存液中可以稳定保存。 具体实施方式[0011] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0012] 以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。 [0013] 实施例1 呼吸道病毒的检测(1) 咽拭子轻轻刮取人表皮粘膜细胞，将拭子棉球部位浸润到5mL本发明的灭活型病毒保存液中；待棉球全部浸润之后，盖紧管盖，上下颠倒混匀90秒后瞬时离心； 5 (2) 加入100uL10取拷贝数的COVID‑19假病毒到含样本的病毒保存液中； (3) 取200uL(2)中的保存液，按照易迈吉生物、诺维赞生物、海狸生物、之江生物、硕世生物的磁珠法核酸提取说明书的操作步骤加入样本裂解液并上机操作，最后均50uL洗脱； (4) 将提取得到的假病毒RNA用荧光PCR方法检测，本实施例中，所述用于扩增病毒序列ORF1区的特异性扩增引物对为以下序列： ORF1a‑F：CCTCCGTTGCCACATAGAT(SEQ NO.1)、 ORF1a‑R：CCGTCATTAGCACAAGTTGTAGG(SEQ NO.2)； 所述用于扩增病毒序列ORF1区的特异性荧光探针为以下序列： ORF1a‑P：ATCAGGAGATGCCACAACTGC(SEQ NO.3)、 上述引物对和探针的工作浓度为20μM(20μmol/L)； (5) RT‑PCR反应试剂：包含有6个N碱基的随机引物、dNTP、Tris‑HCl、NaCl、KCl、DTT、反转录酶、ATP、MgCl2，热启动Taq酶等； (6) 结果见附图1，所有提取试剂盒提取得到的RNA模板，用荧光PCR方法检测，ORF1a基因均正常扩增，表明本发明的灭活型病毒保存液与相关的病毒RNA提取试剂盒兼容性较好。 [0014] 实施例25 (1) 加入2x10 个COVID‑19假病毒到10mL灭活型病毒保存液中，上下颠倒混匀90秒后瞬时离心，各取500uL在37°C放置24，48，72，96，120，144，168，192h； (2) 从各个保存时间的保存液批次中吸取200uL 保存液，加入到易迈吉生物的病毒核酸预分装试剂盒的96孔板中相应孔位； (3) 上机操作，仪器参数设置如下表1： (4) 将提取得到的假病毒RNA用荧光PCR方法，具体方法见实施案例1； (5) 检测结果见附图2，具体ct值见表2，表明假病毒RNA在灭活型病毒保存液中可以稳定保存。如下表2 |
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