一种多功能缓冲液及其应用
| 热词 | 缓冲 多功能 ul 扩增 seq rpa 功能 核酸 hda no | ||
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202011235763.6 | 申请日 | 2020-11-09 |
| 公开(公告)号 | CN112094888B | 公开(公告)日 | 2021-02-02 |
| 申请人 | 湖南大地同年生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 徐根明; 鞠巍; 秦闯华; 潘艺; 赵谦; | 第一发明人 | 徐根明 |
| 权利人 | 湖南大地同年生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 湖南大地同年生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：湖南省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：湖南省长沙市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：湖南省长沙市长沙高新区文轩路麓谷企业广场E4栋1单元 | 邮编 | 当前专利权人邮编：410205 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/6806 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 7 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 长沙市融智专利事务所 | 专利代理人 | 袁靖; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种多功能缓冲液及其应用。本发明的多功能缓冲液不仅能有效抑制 微 生物 生长，失活待检测病毒、细菌或细胞，而且还能够保护其裂解后释放的核酸，防止被核酸酶降解。更重要的是该含有待检测核酸的缓冲液可以直接用来进行常规QPCR检测或者直接进行RPA、HDA、LAMP等等温扩增检测。不需要核酸抽提，也就减少了可能的核酸损失，提高了检测的灵敏度，简化了检测步骤。多功能缓冲液使整个检测过程可以不再需要开盖加入 试剂 或转移试剂，这样尽最大可能避免了样本间交叉污染，也避免了对检测人的感染。由于本发明的多功能缓冲液可以常温运输，不需要冷链运输从而降低了运输成本。 | ||
| 权利要求 | 1.一种多功能缓冲液，其特征在于，包含如下成分：18mM-22mM pH8.0的Tris-HCl，2%- |
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| 说明书全文 | 一种多功能缓冲液及其应用技术领域[0001] 本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种多功能缓冲液及其应用。 背景技术[0002] 在现有的体外诊断或生物技术中，科学家们已经发现或者发明了多种参与各种分子生物学反应或者酶反应的缓冲液。这些缓冲液经过不断优化为各自的分子生物学反应或酶反应提供了最优的反应环境，以帮助这些反应实现最优的反应效能。如NEW ENGLAND BioLabs在不断开发各种分子生物学用酶的同时，为这些酶也提供了各种最适合的反应缓冲液。如NEBuffer 1、NEBuffer 2、NEBuffer 3、NEBuffer 4、NEBuffer 2.1、NEBuffer 3.1、NEB CutSmart Buffer、Exonuclease I Reaction Buffer、Isothermal Amplification Buffer、ThermoPol Reaction Buffer等等。在细胞培养领域中还有PBS缓冲液、HEPES缓冲液等等。这些缓冲液有的专门为某一个反应提供高效的缓冲环境，有的经过测试可以同时为2-3个反应提供比较高效的反应缓冲环境。本发明着重针对病原微生物快速检测领域和过程提供了一种高效的多功能缓冲液。 发明内容[0003] 本发明的目的是提供一种多功能缓冲液及其应用。 [0004] 一种多功能缓冲液，含有如下成分：1uM-500mM pH8.0的Tris-HCl，0.1%-15% 曲拉通X-100，0.1%-20% Tween20，1mM-1M 甜菜碱，1ng/mL-10mg/mL BSA，0.01%-10% SDS,0.01%-10% 乙醇，1uM-5M 氯化钠，1uM-5M 氯化钾，1uM-1M 氢氧化钠，7pM-350mM 莎梵婷， 5pg/uL-500ng/uL聚乙烯醇，0.01%-5%多聚赖氨酸，10uM-10mM DTT,0.1U/uL-50U/uL Rnase inhibitor。 [0005] 所述的多功能缓冲液，优选包含如下成分：100uM-100mM pH8.0的Tris-HCl，1%-10% 曲拉通X-100，1%-10% Tween20，10mM-500mM 甜菜碱，10ng/mL-1mg/mL BSA，0.05%-5% SDS,0.05%-5% 乙醇，10uM-1M 氯化钠，10uM-1M 氯化钾，10uM-100mM 氢氧化钠，20pM- 100mM 莎梵婷，50pg/uL-100ng/uL聚乙烯醇，0.05%-1%多聚赖氨酸，80uM-5mM DTT,0.5U/uL-10U/uL Rnase inhibitor。 [0006] 所述的多功能缓冲液，进一步优选包含如下成分：500uM-50mM pH8.0的Tris-HCl，2%-8% 曲拉通X-100，2%-8% Tween20，80mM-300mM 甜菜碱，30ng/mL-600ug/mL BSA，0.1%- 1% SDS,0.1%-1 % 乙醇，80uM-800mM 氯化钠，500uM-100mM 氯化钾，300uM-50mM 氢氧化钠，600pM-1mM 莎梵婷，100pg/uL-50ng/uL聚乙烯醇，0.1%-0.8%多聚赖氨酸，500uM-2mM DTT,1U/uL-4U/uL Rnase inhibitor。 [0007] 所述的多功能缓冲液，最优选：包含如下成分：18mM-22mM pH8.0的Tris-HCl，2%-4% 曲拉通X-100，2%-4% Tween20，100mM-140mM 甜菜碱，80ug/mL-120ug/mL BSA，0.3%- 0.7% SDS,0.1%-0.5 % 乙醇，130mM-170mM 氯化钠，30mM-70mM 氯化钾，22mM-28mM 氢氧化钠，280nM-320nM 莎梵婷，22ng/uL-28ng/uL聚乙烯醇（优选1788型），0.3%-0.7%多聚赖氨酸，1.3mM-1.7mM DTT,1U/uL-3U/uL Rnase inhibitor。 [0008] 所述的多功能缓冲液的应用：用于裂解病毒、细菌或者活体细胞，使其失去生物学活性，灭活后释放遗传物质DNA或RNA。 [0009] 所述的多功能缓冲液的应用：稳定保存病毒、细菌或者活体细胞释放出的遗传物质DNA或RNA，防止核酸酶对其降解。 [0010] 所述的多功能缓冲液的应用：当所要检测的遗传物质是RNA时进行反转录反应。 [0011] 所述的多功能缓冲液的应用：在该缓冲液条件下进行常规PCR、RPA、HDA或LAMP等温扩增。 [0012] 所述的多功能缓冲液的应用：在该缓冲液条件下进行CRISPR-Cas12或CRISPR-Cas13检测。 [0013] 所述的多功能缓冲液的应用：实现以下5种应用中的两种以上：1）裂解病毒、细菌或者活体细胞，使其失去生物学活性；灭活后释放遗传物质DNA或RNA；2）稳定保存病毒、细菌或者活体细胞释放出的遗传物质DNA或RNA，防止核酸酶对其降解；3）当所要检测的遗传物质是RNA时进行反转录反应；4）在该缓冲液条件下进行常规PCR、RPA、HDA、或LAMP等温扩增；5）在该缓冲液条件下进行CRISPR-Cas12或CRISPR-Cas13检测。 [0014] 本发明排除诊断目的的检测。 [0015] 本发明的多功能缓冲液在核酸检测或分子诊断领域创新性的解决了样本保存难、核酸抽提繁琐、冷链运输成本高、检测步骤繁琐、样本易交叉污染等问题。在核酸检测中如果采集的样本中待检测细菌、病毒或细胞含量极少，比如几个拷贝到几十个拷贝时，按照传统的或者常规的检测方法进行核酸抽提时就极有可能丢掉这些极少拷贝数的核酸，就容易造成检测的假阴性。本发明方案的多功能缓冲液不仅能有效抑制微生物生长，失活待检测病毒、细菌或细胞，而且还能够保护其裂解后释放的核酸，防止被核酸酶降解。更重要的是该含有待检测核酸的缓冲液可以直接用来进行常规QPCR检测或者直接进行RPA、HDA、LAMP等等温扩增检测。不需要核酸抽提，也就减少了可能的核酸损失，提高了检测的灵敏度，简化了检测步骤。多功能缓冲液使整个检测过程可以不再需要开盖加入试剂或转移试剂，这样尽最大可能避免了样本间交叉污染，也避免了对检测人的感染。由于本发明的多功能缓冲液可以常温运输，不需要冷链运输从而降低了运输成本。附图说明 [0017] 图1中S1：5µL菌液在200µL 1×NEBuffer1中，室温放置24小时； [0018] S2：5µL菌液在200µL 多功能缓冲液中，室温放置24小时； [0019] S3：5µL菌液直接QPCR定量。 [0020] 图2为测试本发明实施例2的多功能缓冲液裂解细胞并保存保护核酸的能力结果图。 [0021] 图2中S0：去离子水做模板； [0022] S1：50个人源细胞，10µL 1× ThermoPol Reaction Buffer； [0023] S2：50个人源细胞，10µL多功能缓冲液； [0024] S3：50个人源细胞，10µL多功能缓冲液，室温放置36小时； [0025] S4：330pg人基因组DNA（相当于50个人源细胞）。 [0026] 图 3为测试本发明实施例3的多功能缓冲液作为RPA等温扩增法检测缓冲液的电泳结果图。 [0027] 图3中M：100bp Marker; [0028] S0：RPA solution缓冲液进行RPA反应； [0029] S1：本发明多功能缓冲液进行RPA反应。 [0030] 图4为测试本发明实施例4的多功能缓冲液作为LAMP等温扩增法检测缓冲液的结果图。 [0031] 图4中S0：使用NEB LAMP kit检测； [0032] S1：使用本发明多功能缓冲液。 [0033] 图5为测试本发明实施例5的多功能缓冲液作为HDA等温扩增法检测缓冲液的结果图。 [0034] 图5中M：100bp Marker； [0035] S1：本发明多功能缓冲液作为缓冲液进行HDA反应； [0036] S2: HDA试剂盒进行HDA反应； [0037] S3: 阴性对照。 [0038] 图6为测试本发明实施例6的多功能缓冲液能够作为CRISPR-Cas12反应的缓冲液的结果图。 [0039] 图6中S7：阴性对照； [0040] S8：本发明多功能缓冲液作为缓冲液进行CRISPR-Cas反应； [0041] S9：NEBuffer2.1作为缓冲液进行CRISPR-Cas反应。 具体实施方式[0042] 以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而不会形成对本发明的限制。 [0043] 实施例1 [0044] 测试本发明多功能缓冲液抑制微生物生长的能力。 [0045] 实验过程： [0046] 多功能缓冲液配制如下表1。 [0047] 表1 [0048] [0049] 取样：取人新鲜粪便1g放在2mL PBS缓冲液中，涡旋震荡混匀。放置在离心机中1600g离心10min。取5ul上清放置在200uL 1X NEBuffer 1中，作为样本S1。另取5ul上清放置在200uL本发明的多功能缓冲液（表1）中作为样本S2。S1和S2室温放置24小时后定量。另取5ul上清加入200uL灭菌去离子水中作为S3，直接进行定量。使用QPCR方法检测肠道菌群含量。 [0050] F1: [0051] GTGCCAGCMGCCGCGGTAA，M=A或C，见SEQ ID NO.1; [0052] R1: [0053] GGACTACHVGGGTWTCTAAT，H=A或T或C，V=G或A或C，W=A或T，见SEQ ID NO.2。 [0054] 反应体系如下： [0055] LightCycler 480 SYBR Green I Master（2×）10uL，引物F1（5uM）0.5 uL，引物R1（5uM）0.5 uL，取上述处理的S1、S2、S3各4uL，补去离子水至20 uL。Stepone plus QPCR仪上进行定量。 [0056] PCR过程： [0057] a.98℃预变性5分钟， [0058] b.98℃预变性30秒， [0059] c.68℃退火延伸45秒， [0060] d. 4℃保存。 [0061] 步骤b、c进行45个循环。 [0062] 实验结果见图1。 [0063] 样本S1是将粪便上清液置于1X NEBuffer 1中放置24小时，定量结果明显偏大，说明1X NEBuffer 1中放置24小时使肠道菌群进行了生长。样本S2是使用本发明的多功能缓冲液放置24小时，与样本S3定量结果ct值相差不大。说明本发明的多功能缓冲液能够有效抑制微生物生长。 [0064] 实施例2 [0065] 测试本发明多功能缓冲液裂解细胞并保存保护核酸的能力。 [0066] 实验过程： [0067] 多功能缓冲液配制如下表2。 [0068] 表2 [0069] [0070] 取样：每个管中先加入10uL本发明的多功能缓冲液，再分别加入50个人源细胞，分别作为样本S1、S2、S3。以人源基因ERBB2一段序列作为目标扩增基因，S0只含水不含人源细胞，且不使用本发明的多功能缓冲液（表2）进行目标基因扩增，S1为阴性对照，使用1X ThermoPol Reaction Buffer进行目标基因扩增，见表3。 [0071] 表3 [0072] [0073] 使用QPCR方法进行人源DNA ERBB2基因的一段序列进行定量； [0074] 检测目标区域序列： [0075] AGGGCCAGGGTATGTGGCTACATGTTCCTGATCTCCTTAGACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAG,见SEQ ID NO.3; [0076] F2: AGGGCCAGGGTATGTGGC,见SEQ ID NO.4; [0077] R2:CTGTGTTCCATCCTCTGCT,见SEQ ID NO.5。 [0078] 反应体系如下： [0079] LightCycler 480 SYBR Green I Master（2×）10uL，引物F2（5uM）0.5 uL，引物R2（5uM）0.5 uL，上述处理的样本S0-S4 10 uL，补去离子水至25 uL。Stepone plus QPCR仪上进行定量。 [0080] PCR过程： [0081] a.98℃预变性5分钟， [0082] b.98℃预变性30秒， [0083] c.68℃退火延伸45秒， [0084] d. 4℃保存。 [0085] 步骤b、c进行45个循环。 [0086] 实验结果见图2。 [0087] S1有少量扩增产物是因为扩增时高温变性步骤使少量细胞裂解并释放出来少部分DNA； [0088] S2与S4有差不多的扩增产物峰，说明本发明的多功能裂解液成功对细胞进行了裂解，释放了DNA； [0089] S3与S2有差不多的产物峰，说明经过36小时后本发明的多功能裂解液保护了裂解释放的DNA不被降解。 [0090] 实施例3 [0091] 测试本发明多功能缓冲液可以作为RPA等温扩增法检测缓冲液。 [0092] 实验过程： [0093] 多功能缓冲液配制体系如下表4。 [0094] 表4 [0095] [0096] 取样：人源基因组DNA 1ng/反应 [0097] 使用TwistDx公司的RPA试剂盒TwistAmp Basic（TABAS03KIT）。用试剂盒自带RPA solution溶解冻干粉进行检测（对照）作为S0,和本发明的多功能缓冲液（表4）溶解冻干粉（S1）进行检测。RPA的方法扩增人源EGFR基因150bp的一段序列。扩增使用的引物序列如下： [0098] F3: TGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCC,见SEQ ID NO.6; [0099] R3: TGTTCCCGGACATAGTCCAGGAGGCAGCCG,见SEQ ID NO.7。 [0100] 反应体系如下表5。 [0101] 表5 [0102] 。 [0103] 涡旋震荡充分混匀后瞬时离心，在PCR仪上40℃孵育30分钟； [0104] 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，见图3。 [0105] 本实施例说明本发明的多功能缓冲液能够作为RPA等温扩增法的缓冲液成功扩增目标产物。 [0106] 实施例4 [0107] 测试本发明多功能缓冲液可以作为LAMP等温扩增法检测缓冲液。 [0108] 实验过程： [0109] 多功能缓冲液配制如下表6。 [0110] 表6 [0111] [0112] 取样：使用COV19N蛋白假病毒（生工，2019-Ncov-N假病毒）10000拷贝/反应[0113] 选取COVID-19病毒N蛋白基因一段序列作为目标核酸区域，如下： [0114] AAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAG,见SEQ ID NO.8; [0115] 寡核苷酸序列： [0116] 19N-F3： [0117] TGGCTACTACCGAAGAGCT,见SEQ ID NO.9; [0118] 19N-FIP： [0119] TCTGGCCCAGTTCCTAGGTAGTCCAGACGAATTCGTGGTGG,见SEQ ID NO.10; [0120] 19N-LF： [0121] GGACTGAGATCTTTCATTTTACCGT,见SEQ ID NO.11; [0122] 19N-B3： [0123] TGCAGCATTGTTAGCAGGAT,见SEQ ID NO.12; [0124] 19N-BIP： [0125] AGACGGCATCATATGGGTTGCACGGGTGCCAATGTGATCT,见SEQ ID NO.13; [0126] 19N-LB： [0127] ACTGAGGGAGCCTTGAATACA,见SEQ ID NO.14; [0128] S0使用WarmStart® LAMP Kit (DNA & RNA)（NEB,E1700L）进行检测，作为阳性对照。 [0129] S1使用本发明的多功能缓冲液（表6）进行检测，体系如下表7。 [0130] 表7 [0131] [0132] S0和S1在65℃条件下反应90分钟。取出观察颜色变化。S0和S1都由蓝色变成了颜色更深的蓝紫色，说明都进行了LAMP扩增反应，见图4。 [0133] 本实施例说明本发明的多功能缓冲液能够作为等温扩增LAMP法检测的缓冲液。 [0134] 实施例5 [0135] 测试本发明多功能缓冲液可以作为HDA等温扩增法检测缓冲液。 [0136] 实验过程： [0137] 多功能缓冲液配制如下表8。 [0138] 表8 [0139] [0140] 取样：使用COV19N蛋白假病毒（生工，2019-Ncov-N假病毒）10000拷贝/反应[0141] 选取COVID-19病毒N蛋白基因一段序列作为目标核酸区域，如下： [0142] AAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAG,见SEQ ID NO.15; [0143] 寡核苷酸序列： [0144] 19N-HAD-F: [0145] AGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAG,见SEQ ID NO.16; [0146] 19N-HAD-R: [0147] ATTCCGAAGAACGCTGAAGCGCTG,见SEQ ID NO.17; [0148] S2使用IsoAmp II Universal tHDA Kit（biohelix，#H0110S）进行检测，作为阳性对照。 [0149] S1、S3使用本发明多功能缓冲液（表8）作为缓冲液，S3作为阴性对照，反应体系如下表9。 [0150] 表9 [0151] [0152] S1、S2、S3在65℃中反应90分钟。取5uL跑2%琼脂糖胶电泳检测。 [0153] 实验结果见图5； [0154] 本实施例中S1使用本发明提及的多功能缓冲液作为HDA反应的缓冲液，同商业化HDA试剂盒S2比较都能够对125bp的目标产物进行有效扩增。 [0155] 实施例6 [0156] 测试本发明多功能缓冲液能够作为CRISPR-Cas12反应的缓冲液。 [0157] 选取COVID-19病毒N蛋白基因一段PCR产物序列作为目标核酸区域，如下： TGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATTTCTACTACCTAGGAACTGGGCCAGAAGCTGGACTTCCCTATGGTGCTAACAAAGACGGCATCATATGGGTTGCAACTGAGGGAGCCTTGAATACACCAAAAGATCACATTGGCACC,见SEQ ID NO.18; [0158] 19N-Cas12b sgRNA序列： [0159] 5’-GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGU [0160] GGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACAAGUCCAGCUUCUGGCCCAG-3’，见SEQ ID NO.19; [0161] 单链报告DNA： [0162] /56-FAM/TTATT/3BHQ1/,见SEQ ID NO.20; [0163] 取COVID-19 N基因PCR产物10ng进行检测。 [0164] 配制如下表10反应体系。 [0165] 表10 [0166] [0167] S7、S8、S9充分混匀后在65℃水浴或金属浴中反应15分钟。反应完成后使用LED蓝光或者UV紫外检测管内荧光。 [0168] 实验结果见图6，其中S7作为阴性对照没有出现荧光显色。S8、S9均出现了荧光显色。说明本发明多功能缓冲液能够作为CRISPR-Cas反应缓冲液进行检测。 |
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