一种从赤潮异弯藻细胞中提取高质量DNA的方法
| 热词 | dna 细胞 赤潮 ctab sds 裂解 提取 离心 12000rpm 分钟 | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202010597957.4 | 申请日 | 2020-06-28 |
| 公开(公告)号 | CN111607636A | 公开(公告)日 | 2020-09-01 |
| 申请人 | 江苏海洋大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 胡广伟; 张珍珍; 姬南京; 申欣; 蔡月凤; 覃昊; 石一彪; 邓圣贤; | 第一发明人 | 胡广伟 |
| 权利人 | 江苏海洋大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 江苏海洋大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：江苏省连云港市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：江苏省连云港市新浦区苍梧路59号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：222000 |
| 主IPC国际分类 | C12Q1/6806 | 所有IPC国际分类 | C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 6 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京和联顺知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 闫超良; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种从赤潮异弯藻细胞中提取高 质量 DNA的方法，包括如下步骤：藻细胞的培养；藻细胞裂解缓冲液的筛选；藻细胞收集方法摸索；萃取、沉淀和洗涤以及DNA浓度、纯度和完整性的分析，本方法主要通过使用过滤膜收集赤潮异弯藻细胞的方法和选择合适的CTAB细胞裂解液，结果表明，使用新方法提取得到的赤潮异湾藻基因组DNA无论在质量上还是完整度上均优于其他方法，适用于PCR分析和DNA高通量测序。 | ||
| 权利要求 | 1.一种从赤潮异弯藻细胞中提取高质量DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种从赤潮异弯藻细胞中提取高质量DNA的方法技术领域[0001] 本发明涉及赤潮异弯藻DNA提取领域，具体为一种从赤潮异弯藻细胞中提取高质量DNA的方法。 背景技术[0002] 有害藻华是由于某些藻类爆发性增殖而形成的，可对海洋生态系统和当地经济造成重大破坏。近年来，有害藻华的发生频率、强度和地理分布在世界各地都有所增加。赤潮异弯藻是典型的赤潮物种，是一种广温、广盐性生物，分布在世界多个海域。这种藻之所以被广泛研究，因为它在赤潮形成时会产生鱼毒素，严重破坏海洋生态系统，导致大量人工养殖鱼类死亡。然而，关于藻华形成和毒素产生机制仍不清楚，为了更好地了解赤潮异弯藻如何形成藻华、形成藻华时如何杀死鱼类，有关分子机制或调节该物种生长和新陈代谢的生化过程的信息是非常重要的。 [0003] 基于DNA的分子生物学方法是研究生物特征的有效方法之一。对于分子分析、基因工程，如克隆和DNA测序，所有这些步骤的初始步骤都是DNA提取。目前有很多种DNA提取方法，如十二烷基硫酸钠(SDS)法，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和商业化的DNA提取试剂盒。然而，上述的一些DNA提取方法可能适用于某些特定的生物，但不适用于特定的藻类物种。赤潮异弯藻的基因组较大，很难获得完整的基因组DNA，因此，得到高浓度、高纯度和高完整度的赤潮异弯藻基因组是开展该物种DNA高通量测序技术的先决条件。 [0004] 从植物和藻类中提取DNA的困难之处在于它们具有独特的细胞结构。赤潮异弯藻的细胞很脆弱，没有细胞壁。所以在用离心法收集藻细胞时，细胞会聚集形成细胞团，使藻细胞的完全裂解变得更加困难。虽然匀浆器可以破坏细胞的结构，但是物理操作会降低基因组DNA的完整性，使得这种方法获得的DNA不适合于基因组测序等下游实验。 发明内容[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从赤潮异弯藻细胞中提取高质量DNA的方法，包括如下步骤： [0008] S2:藻细胞裂解缓冲液的筛选：采用SDS处理法和CTAB提取法获得高质量的DNA；首先从培养基中获取藻细胞，然后将细胞颗粒分别悬浮在SDS和CTAB细胞裂解液中； [0009] S3:收集藻细胞：使用0.3μm的PVDF过滤膜，然后将过滤膜转移到0.8mL于60℃预热的CTAB细胞裂解液(2％CTAB,100mMTris-HClpH8.0,1.4MNaCL,0.2％β巯基乙醇，0.1mg/ml蛋白酶K)中，用剪刀将过滤膜剪碎，用封口膜密封离心管管口，60℃孵育2小时，不时轻轻地颠倒混匀，样品在12000rpm离心15s后，将细胞裂解液转移到新的离心管中； [0010] S4:添加800μL的氯仿至细胞液中，轻轻地颠倒离心管2分钟使其混匀，在室温下静置2分钟后，4℃，12000rpm离心10分钟； [0011] S5:转移上层水相至新的离心管中，添加RNA酶，37℃温育30分钟； [0012] S6:加入等体积的氯仿至温浴后的混合液中，12000rpm离心10分钟； [0013] S7:将上层水相转移到另一个新的离心管中，添加1/10体积的醋酸钠和2/3体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀； [0014] S8:室温下，静置10分钟，4℃，12000rpm，离心5分钟。去掉上清，用70％的无水乙醇洗涤2次，吸掉无水乙醇，室温晾干；最后，将干燥后的DNA样品重新悬浮于100μL无菌水中，用0.6％的琼脂糖凝胶进行电泳； [0015] S9:DNA浓度、纯度和完整性的分析：采用超微量分光光度计定量测定DNA浓度。 [0016] 作为本发明的一种优选技术方案，所述S1中的培养藻细胞的培养基是不添加硅元素的f/2培养基，在20℃培养条件下培养，藻细胞浓度是使用Sedgwick-Rafter计数板在显微镜下进行细胞计数，后计算细胞浓度。 [0017] 作为本发明的一种优选技术方案，所述藻细胞浓度的计算公式为：CA＝DR*G*50，其中CA表示藻细胞浓度；DR表示数藻时藻培养液的稀释倍数；G表示藻细胞数的平均值。 [0018] 作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中使用SDS裂解藻细胞的具体步骤： [0019] S2-1-1：离心收集藻细胞，细胞颗粒悬浮于SDS细胞裂解液(0.1MEDTA,1％SDS)中，细胞悬液于56℃孵育过夜； [0020] S2-1-2：将等体积的氯仿加入到细胞悬液中，反复颠倒混匀，于4℃，12000rpm，离心10分钟，小心地将上层水相转移到新的离心管中，加入1/10体积的NaAc和2/3体积的异丙醇； [0021] S2-1-3：将混匀的细胞悬液在室温下静置10分钟后于4℃，12000rpm，离心5分钟，收集DNA，用70％的无水乙醇洗涤DNA两次后晾干，后在无菌水中溶解DNA。 [0022] 作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中使用CTAB裂解藻细胞的具体步骤： [0023] S2-2-1：在0.5mlDNA裂解缓冲液(10mMTris，pH8.0；100mMEDTA，pH8.0；0.5％SDS和200μg/ml的蛋白酶K)中于55℃孵育5小时；添加82.5μL5MNaCl，终浓度为0.7M； [0024] S2-2-2：然后添加82.5μL提前预热的10％(w/v)CTAB溶液至细胞裂解液中，涡旋1分钟后在56℃条件下温育10分钟； [0025] S2-2-3：添加600μL的氯仿，12000rpm，离心10分钟，将上清液转移到新的离心管中，然后在每个DNA样品中加入2倍体积的DNA结合缓冲液，其余步骤与Zymo的DNA纯化和浓缩试剂盒方法相同。 [0026] 作为本发明的一种优选技术方案，所述S9中测定DNA浓度的方法：根据在230、260和280nm处的吸光度值，用Nanodrop定量测定核酸的纯度，并计算260/280和260/230的比值，用优化后的方法提取基因组DNA，经0.6％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用凝胶核酸染色法观察DNA条带。 [0027] 本发明的有益效果：本发明所提出的一种从赤潮异弯藻细胞中提取高质量DNA的方法，主要通过使用过滤膜收集赤潮异弯藻细胞的方法和选择合适的CTAB细胞裂解液。结果表明：新方法在提取得到的赤潮异弯藻的基因组DNA的浓度和质量上均优于其他方法，适用于PCR分析和DNA高通量测序。附图说明 [0028] 图1是本发明的流程图； [0029] 图2标准电泳法分析使用不同的方法提取得到的基因组DNA的完整性和产量； [0030] 图3标准电泳法鉴定DNA完整性； [0031] 图4用标准电泳法评价DNA质量。 具体实施方式[0032] 下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。 [0033] 实施例1：请参阅图1，本发明提供一种技术方案：一种从赤潮异弯藻细胞中提取高质量DNA的方法：本发明的实现步骤如下： [0034] 包括如下步骤： [0035] S1:藻细胞的培养：用于配制藻培养液的海水经0.22μm的滤膜过滤，并经高压灭菌，盐度为30PSU； [0036] 培养藻细胞的培养基是不添加硅元素的f/2培养基，在20℃培养条件下培养，藻细胞浓度是使用Sedgwick-Rafter计数板在显微镜下进行细胞计数，后计算细胞浓度。 [0037] 所述藻细胞浓度的计算公式为：CA＝DR*G*50，其中CA表示藻细胞浓度；DR表示数藻时藻培养液的稀释倍数；G表示藻细胞数的平均值。 [0038] S2:藻细胞裂解缓冲液的筛选：采用SDS处理法和CTAB提取法获得高质量的DNA；首先从培养基中获取藻细胞，然后将细胞颗粒分别悬浮在SDS和CTAB细胞裂解液中； [0039] 使用SDS裂解藻细胞的具体步骤： [0040] S2-1-1：离心收集藻细胞，细胞颗粒悬浮于SDS缓冲液(0.1MEDTA,1％SDS)中，细胞悬液于56℃孵育过夜； [0041] S2-1-2：将等体积的氯仿加入到细胞裂解液中，轻轻地颠倒混匀，于4℃，12000rpm，离心10分钟。小心地将上层水相转移到新的离心管中，加入1/10体积的NaAc和2/ 3体积的异丙醇； [0042] S2-1-3：将混匀的细胞裂解液在室温下静置10分钟后于4℃，12000rpm，离心5分钟，收集DNA。用70％的无水乙醇洗涤DNA两次后晾干，后在无菌水中溶解DNA。 [0043] 使用CTAB裂解藻细胞的具体步骤： [0044] S2-2-1：在0.5mlDNA裂解缓冲液(10mMTris，pH8.0；100mMEDTA，pH8.0；0.5％SDS和200μg/ml的蛋白酶K)中于55℃孵育5小时；添加82.5μL5MNaCl，终浓度为0.7M； [0045] S2-2-2：然后添加82.5μL提前预热的10％(w/v)CTAB溶液至裂解液中，涡旋1分钟后在56℃条件下温浴10分钟； [0046] S2-2-3：添加600μL的氯仿，12000rpm，离心10分钟，将上层水相转移到新的离心管中，然后在每个DNA样品中加入2倍体积的DNA结合缓冲液，其余步骤与Zymo的DNA纯化和浓缩试剂盒方法相同。 [0047] S3:收集藻细胞：使用0.3μm的PVDF过滤膜，然后将过滤膜转移到0.8mL于60℃预热的CTAB缓冲液(2％CTAB,100mMTris-HClpH8.0,1.4MNaCL,0.2％β巯基乙醇，0.1mg/ml蛋白酶K)中，用剪刀将过滤膜剪碎，用封口膜密封瓶盖，60℃孵育2小时，不时地轻轻颠倒混匀，样品在12000rpm离心15s后，将细胞裂解液转移到新的离心管中； [0048] S4:添加800μL的氯仿至细胞裂解液中，轻轻地颠倒离心管2分钟使其混匀，在室温下静置2分钟后，4℃，12000rpm离心10分钟； [0049] S5:转移上层水相转移至新的离心管中，添加RNA酶，37℃温浴30分钟； [0050] S6:加入等体积的氯仿至温浴后的细胞裂解液中，12000rpm离心10分钟； [0051] S7:将上层水相转移到另一个新的离心管中，添加1/10体积的醋酸钠和2/3体积的异丙醇，轻轻地颠倒混匀； [0052] S8:室温下，静置10分钟，4℃，12000rpm，离心5分钟，去掉上清。用70％的无水乙醇洗涤沉淀2次，吸掉无水乙醇，室温晾干；最后，将干燥后的DNA样品重新悬浮于100μL无菌水中，用0.6％的琼脂糖凝胶进行电泳； [0053] S9:DNA浓度、纯度和完整性的分析：使用超微量分光光度计定量测定DNA浓度。根据在230、260和280nm处的吸光度值，用Nanodrop定量测定核酸的纯度，并计算260/280和260/230的值，用优化后的方法提取赤潮异弯藻的基因组DNA，经0.6％琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，用凝胶核酸染色法观察DNA条带。 [0054] 结果1：DNA的完整度 [0055] 如图2所示，用SDS法、SDS法提取DNA后用洗脱柱进行DNA纯化和实验室常用的常规提取DNA的方法分别获得赤潮异弯藻的基因组DNA，对其凝胶电泳结果进行分析。利用SDS法从赤潮异弯藻中提取得到的DNA显示出一个强条带(图2，条带1)。当使用SDS法提取DNA后用Zymo纯化试剂盒进行纯化后，发现条带很弱(图2，条带2)。琼脂糖凝胶电泳结果显示使用标准的DNA提取方法得到的DNA在电泳后条带弥散(图2，条带3)。通过分析这三种方法提取得到的赤潮异弯藻DNA的260/280、260/230的值以及得到的DNA的完整度，发现得到的DNA纯度不高或完整度较低。此外，藻细胞的收取方法也影响DNA的浓度，用滤膜法收集藻细胞呈现出很强的条带(图4，条带1)，说明提取得到的DNA浓度很高，而使用磁珠对离心收集的细胞进行破碎，提取得到的DNA的电泳结果显示DNA条带弥散(图4，条带2)，说明提取得到的DNA完整度低。比较了CTAB法和SDS法提取的DNA的质量，表明用CTAB法进行DNA提取可以减少蛋白质的污染，说明CTAB法更适合于提取赤潮异弯藻的基因组DNA。 [0056] 结果2：DNA的纯度 [0057] 通过计算260/280和260/230的值来估算核酸纯度，260/280的值可以作为是否存在蛋白污染的指标，同样260/230的比值可以用来监测其他污染物，如碳水化合物、硫氰酸胍和酚类。SDS法提取DNA的260/280值为1.66，260/230的值为0.94(表1，Lane1)；当用DNA纯化柱进一步纯化分离出的DNA时，260/280和260/230的比值分别提高到1.75和1.59(表1，Lane2)。相比而言，使用标准法提取得到的DNA的260/280和260/230的值分别为1.83和2.03(表1，Lane3)。相比于SDS法提取得到的DNA的260/280和260/230的(表2，Line3、4)值用CTAB法提取得到的DNA的260/280和260/230值较好(表2，Line1、2)。为了进一步验证不同的细胞裂解液明显会对提取的DNA的质量产生影响，SDS和CTAB裂解液设置两个重复，结果如图3所示，不同的细胞裂解液明显影响DNA对的提取质量(图3)。最后，研究了细胞收集方法对DNA纯度的影响，结果表明，用滤膜法收集的藻细胞进行DNA的提取，获得的基因组DNA的质量更高(图4，条带5和6)。 [0058] 结果分析： [0059] 核酸的提取是海洋微藻遗传和分子生物学实验的基础。对于赤潮异弯藻等特定的有害藻类，传统的核酸提取方法无法获得高质量的核酸，不利于从分子水平更好地全面了解赤潮异弯藻的生物学特性。因此，快速、简单、可靠的核酸提取方法非常必要。 [0060] 寻找合适的赤潮异弯藻细胞的裂解方法和理想的裂解缓冲液。选择SDS裂解液、CTAB裂解液分别在65℃孵育条件下裂解藻细胞。使用SDS法可以得到高浓度的DNA(图2，条带1)，但260/280和260/230的值比分别为1.66和0.94(表2，Lane1)，表明受到了蛋白质和苯酚污染，这将影响下游实验的效率。值得注意的是，虽然使用SDS法进行DNA提取后使用DNA纯化柱纯化DNA可以提高得到的DNA的纯度(表1，Lane2)，但是这一过程非常耗时，会大大降低DNA的产量，且完整度低。说明SDS裂解液并不是提取赤潮异弯藻高质量DNA的合适裂解液。 [0061] 比较了使用CTAB法和SDS法提取得到的DNA的质量，发现不同的裂解液对赤潮异弯藻DNA的质量有明显影响。根据图3和表2可以得出：当使用CTAB法提取DNA时，可以大大减少蛋白质污染(图3，CTAB法：条带1、2；SDS法：条带3、4)。表2中SDS法和CTAB法提取得到的DNA的260/280和160/230相比，表明CTAB法比SDS法提取的DNA质量更好。 [0062] 进一步验证了细胞收集方法对DNA提取结果的影响。结果如图4所示，使用过滤膜收集藻细胞会获得高浓度的DNA。而藻细胞通过离心方法收集后使用瓷珠打破细胞，会将DNA打破成小片段，影响DNA的完整性和DNA的质量(图4，条带2)。这是因为赤潮异弯藻是一种无细胞壁的微藻，被周质膜包围，离心将使细胞聚集在一起，形成一个细胞团，将阻碍裂解液充分接触细胞。因此，离心收集细胞会降低DNA的提取质量。离心收集后使用瓷珠打散细胞的办法可以使细胞团被打散，同时也会破坏DNA的完整性。相比之下，使用滤膜收集藻类细胞可以有效地避免上述问题。但是提取结果中仍能检测到少量RNA(图4，条带4、5；表2，Lane4、5)，可以添加RNA酶去除RNA污染且对DNA的产量和完整性无影响(图4，条带5、6；Lane5、6)。 [0063] 综上所述，我们优化后的方法可以获得更高质量的DNA，CTAB法是获得高质量DNA的合适细胞裂解液。然而，为了进一步提高DNA质量，可以使用滤膜法收集藻细胞，该方法不仅产率高，而且完整性好，纯度高，质量和数量都得到保证。此外，分离出的基因组DNA适用于PCR和高通量测序等下游过程。 [0064] [0065] 表1使用不同方法提取得到的DNA的吸光值 [0066] (图2.条带1：SDS法提取DNA；条带2：用SDS法提取得到DNA后，用Zymo纯化柱纯化DNA；条带3：常规方法提取DNA；M：DNAmarker)。 [0067] [0068] 表2不同方法提取获得的DNA的吸光值 [0069] (图3.条带1、2：表示用CTAB法提取得到的DNA；条带3、4：表示用SDS法提取得到的DNA；M:DNAmarker分子量同图2) [0070] [0071] 表3不同方法提取获得的DNA的吸光值 [0072] (图4.条带1：用滤膜法收集藻细胞；条带2：离心法收集藻细胞，用瓷珠打碎细胞；条带3、4：用过滤器收集藻细胞后用CTAB缓冲液裂解藻细胞；条带5、6：与条带3、4相同，添加了RNA酶；M：DNAMarker分子量同图2)。 |
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