一种新型秀丽隐杆线虫同步化的方法
| 热词 | 线虫 秀丽隐杆线虫 秀丽 培养 离心 培养基 过滤网 圆环 l1 筛网 | ||
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; 未缴年费; |
| 专利有效性 | 失效专利 | 当前状态 | 权利终止 |
| 申请号 | CN201810028573.3 | 申请日 | 2018-01-12 |
| 公开(公告)号 | CN110150230B | 公开(公告)日 | 2021-08-27 |
| 申请人 | 阜阳师范学院; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 屈长青; 张秋妍; 姬云涛; 孙慧慧; 王永美; | 第一发明人 | 屈长青 |
| 权利人 | 阜阳师范学院 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 阜阳师范学院 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：安徽省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：安徽省阜阳市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：安徽省阜阳市清河西路100号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：236037 |
| 主IPC国际分类 | A01K67/033 | 所有IPC国际分类 | A01K67/033 ; B07B1/04 |
| 专利引用数量 | 6 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 3 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 北京东方盛凡知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 宋平; |
| 摘要 | 本 发明 一种新型秀丽隐杆 线虫 同步化的方法。将900‑1100目尼龙筛网制作成圆环型过滤网；配制固体培养基；将培养的处于不用时期的秀丽隐杆线虫用缓冲液冲洗到离心管中，离心弃去上清液，将其转移过滤网中；将食盐 水 滴加至过滤网中使线虫趋避扩散，L1期的秀丽隐杆线虫穿透尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上；然后用缓冲液冲洗圆环型过滤网外侧的培养基上的L1期的秀丽隐杆线虫至离心管中，离心弃去上清液，得L1期秀丽隐杆线虫；将L1期秀丽隐杆线虫接至含大肠杆菌的培养基中培养得L4期线虫。本发明物理分离筛选方法，操作简单，无需裂解，对线虫不会造成伤害，可解决由于线虫裂解不充分导致不能完全同步化的问题。 | ||
| 权利要求 | 1.一种秀丽隐杆线虫同步化的方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种新型秀丽隐杆线虫同步化的方法技术领域背景技术[0002] 秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans，C.elegans)是国际公认的在延缓衰老研究领域中具有优势的模型生物，具有实验操作简单、发育周期短、遗传信息明确、易于大规模培养等优点，被广泛应用于抗衰老、神经行为学、环境科学和食品科学等相关方面的科学研究。其次，秀丽隐杆线虫是首次被研究发现全部基因组的真核生物，并且40％以上的基因与人类基因同源，全基因组序列的被发现为基因学提供了丰富的研究资源，为人类通过线虫研究人类衰老的基因机理奠定了基础。 [0003] 传统的秀丽隐杆线虫线虫的同步化方法有两种：产卵法和裂解法，产卵法是在无菌环境下挑取处于产卵期的雌雄同体线虫成虫放在涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上产卵，再将成虫挑走，20℃培养24h，得同期化秀丽隐杆线虫，此方法缺点是操作复杂费时，较难掌握，当需要制备大量同期化线虫时工作量大；裂解法是将处于产卵期的秀丽隐杆线虫用裂解液裂解，使虫卵保留下来而成虫被裂解死亡，将裂解后的虫卵20℃培养24h，得同期化秀丽隐杆线虫，此方法缺点是裂解不够充分时，秀丽线虫不能够完全同步化。 发明内容[0004] 本发明主要采用筛网对秀丽隐杆线虫进行分离，利用秀丽隐杆线虫在不同时期体型不同的特点，使用不同目数的筛网对其进行分离，此方法属于物理分离筛选方法，操作简单，无需裂解，对线虫不会造成伤害，可解决由于线虫裂解不充分导致不能完全同步化的问题。 [0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： [0006] 一种新型秀丽隐杆线虫同步化的方法，其包括以下步骤： [0007] 1)选取900‑1100目尼龙筛网，将其制作成直径1cm、高度1cm的圆环型过滤网； [0008] 2)配制固体培养基，110‑130℃高压灭菌15‑25min后制备平板，平板厚度0.4‑0.6cm，在培养基凝固之前，将圆环型过滤网置于平板中央，过滤网高度超过培养基表面 0.4‑0.6cm，然后冷却凝固； [0009] 3)将已培养3‑4天的处于不用时期的秀丽隐杆线虫用0.15‑0.25mL缓冲液冲洗到离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，静置4‑6min后，将其转移至培养基的圆环形过滤网中； [0010] 4)NaCl溶液作为秀丽隐杆线虫的驱避剂，将其滴加至圆环型过滤网中使线虫趋避扩散，在盐水的驱避作用下，秀丽隐杆线虫逃散，L1期的秀丽隐杆线虫穿透900‑1100目尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上； [0011] 5)8‑12min后，用0.15‑0.25mL缓冲液冲洗圆环型过滤网外侧的培养基上的L1期的线虫至离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，重复冲洗3次，得L1期秀丽隐杆线虫； [0012] 6)将L1期秀丽隐杆线虫接至含大肠杆菌的培养基中，18‑22℃培养45‑50h，得L4期线虫。 [0013] 所述固体培养基为NGM固体培养基。 [0014] 所述步骤3和5中的缓冲液均为M9缓冲液，离心管均为1.5mL规格的离心管，离心过程的离心转速均为1500‑2500rpm，离心时间均为0.5‑1.5min。 [0015] NaCl溶液的浓度为180‑220mmol/L。 [0016] 本发明巧妙的采用筛网对秀丽隐杆线虫进行分离，利用秀丽隐杆线虫在不同时期体型不同的特点，使用不同目数的筛网对其进行分离，此方法属于物理分离筛选方法，操作简单，无需裂解，对线虫不会造成伤害，可解决由于线虫裂解不充分导致不能完全同步化的问题。 [0017] 采用盐水来驱赶秀丽隐杆线虫，然后通过筛网的阻挡，让L1期的秀丽隐杆线虫穿透尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上，实现L1期的秀丽隐杆线虫的分离。 具体实施方式[0018] 现在结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。 [0019] 一种新型秀丽隐杆线虫同步化的方法，其包括以下步骤： [0020] 1)选取900‑1100目尼龙筛网，将其制作成直径1cm、高度1cm的圆环型过滤网； [0021] 2)配制固体培养基，110‑130℃高压灭菌15‑25min后制备平板，平板厚度0.4‑0.6cm，在培养基凝固之前，将圆环型过滤网置于平板中央，过滤网高度超过培养基表面 0.4‑0.6cm，然后冷却凝固； [0022] 3)将已培养3‑4天的处于不用时期的秀丽隐杆线虫用0.15‑0.25mL缓冲液冲洗到离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，静置4‑6min后，将其转移至培养基的圆环形过滤网中； [0023] 4)NaCl溶液作为秀丽隐杆线虫的驱避剂，将其滴加至圆环型过滤网中使线虫趋避扩散，在盐水的驱避作用下，秀丽隐杆线虫逃散，L1期的秀丽隐杆线虫穿透900‑1100目尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上； [0024] 5)8‑12min后，用0.15‑0.25mL缓冲液冲洗圆环型过滤网外侧的培养基上的L1期的线虫至离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，重复冲洗3次，得L1期秀丽隐杆线虫； [0025] 6)将L1期秀丽隐杆线虫接至含大肠杆菌的培养基中，18‑22℃培养45‑50h，得L4期线虫。 [0026] 所述固体培养基为NGM固体培养基。 [0027] 所述步骤3和5中的缓冲液均为M9缓冲液，离心管均为1.5mL规格的离心管，离心过程的离心转速均为1500‑2500rpm，离心时间均为0.5‑1.5min。 [0028] NaCl溶液的浓度为180‑220mmol/L。 [0029] 实施例1 [0030] 1)选取1000目尼龙筛网，将其制作成直径1cm、高度1cm的圆环型过滤网； [0031] 2)配制NGM固体培养基，121℃高压灭菌20min后制备平板，平板厚度0.5cm左右，在培养基凝固之前，将圆环型过滤网置于平板中央，过滤网高度超过培养基表面0.5cm左右，冷却凝固； [0032] 3)将已培养3‑4天的处于不用时期的秀丽隐杆线虫用0.2mLM9缓冲液冲洗至1.5mL离心管中离心，2000rpm，1min，去上清，静置5min后，将其转移至NGM培养基的圆环形过滤网中； [0033] 4)配制浓度为200mM的NaCl溶液作为线虫的驱避剂，将其滴加至圆环型过滤网中使线虫趋避扩散，在浓盐水的驱避作用下，线虫逃散，L1期的线虫可以穿透1000目尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上； [0034] 6)10min后,用0.2mLM9缓冲液冲洗圆环型过滤网外侧的培养基上的L1期的线虫至1.5mL离心管中离心，2000rpm，1min，弃上清，重复冲洗3次，得L1期线虫； [0035] 7)将L1期线虫接至含大肠杆菌的NGM培养基中，20℃培养48h，得L4期线虫。 [0036] 实施例2 [0037] 一种新型秀丽隐杆线虫同步化的方法，其包括以下步骤： [0038] 1)选取1050目尼龙筛网，将其制作成直径1cm、高度1cm的圆环型过滤网； [0039] 2)配制固体培养基，125℃高压灭菌21min后制备平板，平板厚度0.45cm，在培养基凝固之前，将圆环型过滤网置于平板中央，过滤网高度超过培养基表面0.45cm，然后冷却凝固； [0040] 3)将已培养3天的处于不用时期的秀丽隐杆线虫用0.17mL缓冲液冲洗到离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，静置4.5min后，将其转移至培养基的圆环形过滤网中； [0041] 4)NaCl溶液作为秀丽隐杆线虫的驱避剂，将其滴加至圆环型过滤网中使线虫趋避扩散，在盐水的驱避作用下，秀丽隐杆线虫逃散，L1期的秀丽隐杆线虫穿透1050目尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上； [0042] 5)12min后，用0.21mL缓冲液冲洗圆环型过滤网外侧的培养基上的L1期的线虫至离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，重复冲洗3次，得L1期秀丽隐杆线虫； [0043] 6)将L1期秀丽隐杆线虫接至含大肠杆菌的培养基中，21℃培养48h，得L4期线虫。 [0044] 所述固体培养基为NGM固体培养基。 [0045] 所述步骤3和5中的缓冲液均为M9缓冲液，离心管均为1.5mL规格的离心管，离心过程的离心转速均为2200rpm，离心时间均为1.2min。 [0046] NaCl溶液的浓度为210mmol/L。 [0047] 实施例3 [0048] 一种新型秀丽隐杆线虫同步化的方法，其包括以下步骤： [0049] 1)选取980目尼龙筛网，将其制作成直径1cm、高度1cm的圆环型过滤网； [0050] 2)配制固体培养基，118℃高压灭菌21min后制备平板，平板厚度0.45cm，在培养基凝固之前，将圆环型过滤网置于平板中央，过滤网高度超过培养基表面0.45cm，然后冷却凝固； [0051] 3)将已培养3‑4天的处于不用时期的秀丽隐杆线虫用0.19mL缓冲液冲洗到离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，静置5.1min后，将其转移至培养基的圆环形过滤网中； [0052] 4)NaCl溶液作为秀丽隐杆线虫的驱避剂，将其滴加至圆环型过滤网中使线虫趋避扩散，在盐水的驱避作用下，秀丽隐杆线虫逃散，L1期的秀丽隐杆线虫穿透980目尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上； [0053] 5)11min后，用0.22mL缓冲液冲洗圆环型过滤网外侧的培养基上的L1期的线虫至离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，重复冲洗3次，得L1期秀丽隐杆线虫； [0054] 6)将L1期秀丽隐杆线虫接至含大肠杆菌的培养基中，21℃培养48h，得L4期线虫。 [0055] 所述固体培养基为NGM固体培养基。 [0056] 所述步骤3和5中的缓冲液均为M9缓冲液，离心管均为1.5mL规格的离心管，离心过程的离心转速均为2100rpm，离心时间均为1.2min。 [0057] NaCl溶液的浓度为210mmol/L。 [0058] 实施例4 [0059] 一种新型秀丽隐杆线虫同步化的方法，其包括以下步骤： [0060] 1)选取1020目尼龙筛网，将其制作成直径1cm、高度1cm的圆环型过滤网； [0061] 2)配制固体培养基，123℃高压灭菌21min后制备平板，平板厚度0.51cm，在培养基凝固之前，将圆环型过滤网置于平板中央，过滤网高度超过培养基表面0.51cm，然后冷却凝固； [0062] 3)将已培养4天的处于不用时期的秀丽隐杆线虫用0.21mL缓冲液冲洗到离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，静置5min后，将其转移至培养基的圆环形过滤网中； [0063] 4)NaCl溶液作为秀丽隐杆线虫的驱避剂，将其滴加至圆环型过滤网中使线虫趋避扩散，在盐水的驱避作用下，秀丽隐杆线虫逃散，L1期的秀丽隐杆线虫穿透1020目尼龙筛网，活动于圆环型过滤网外侧的培养基上； [0064] 5)11min后，用0.21mL缓冲液冲洗圆环型过滤网外侧的培养基上的L1期的线虫至离心管中，然后将离心管放置到离心机中离心，弃去上清液，重复冲洗3次，得L1期秀丽隐杆线虫； [0065] 6)将L1期秀丽隐杆线虫接至含大肠杆菌的培养基中，21℃培养49h，得L4期线虫。 [0066] 所述固体培养基为NGM固体培养基。 [0067] 所述步骤3和5中的缓冲液均为M9缓冲液，离心管均为1.5mL规格的离心管，离心过程的离心转速均为2100rpm，离心时间均为1.25min。 [0068] NaCl溶液的浓度为195mmol/L。 |
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