| 热词 | cfdna dna 氨基酸 提取 氨基 血浆 peg600 试剂 试剂盒 ph | ||
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN201910334438.6 | 申请日 | 2019-04-24 |
| 公开(公告)号 | CN110129314A | 公开(公告)日 | 2019-08-16 |
| 申请人 | 合肥欧创基因生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 杨芳梅; 张惠贤; 卢德景; 徐红梅; | 第一发明人 | 杨芳梅 |
| 权利人 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：安徽省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：安徽省合肥市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：安徽省合肥市蜀山区高新区创新大道106号明珠产业园3#5层D区 | 邮编 | 当前专利权人邮编：230000 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 |
| 专利引用数量 | 6 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 杭州裕阳联合专利代理有限公司 | 专利代理人 | 金方玮; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种 氨 基酸缓冲液及 血浆 游离DNA提取 试剂 盒 ，试剂盒包括如下试剂：裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸 吸附 缓冲液，洗涤液，TE洗脱液；氨基酸吸附缓冲液包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M 氯化钠 ，40-100mM Tris-HCl，20-50mM EDTA，pH 2.1-2.4；本发明通过将氨基酸与低浓度的离液盐结合，控制缓冲液的pH值，提高提取效率；使用PEG降低DNA剪切 力 损伤，保证DNA的完整性；从而使得血浆游离DNA的提取无 抑制剂 残留、提取 质量 高、操作简便、成本低廉。 | ||
| 权利要求 | 1.一种氨基酸缓冲液，其特征在于，包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M氯化钠，40-100mM Tris-HCl，20-50mM EDTA。 |
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| 说明书全文 | 一种氨基酸缓冲液及血浆游离DNA提取试剂盒技术领域背景技术[0002] cfDNA是一种片段化的胞外DNA，主要存在于血浆、血清、脑脊液等体液中，长度在 几十到几百个碱基。目前cfDNA主要应用领域是无创产前诊断和肿瘤液态活检。随着cfDNA 应用越来越广泛，cfDNA的提取显得十分重要，cfDNA的提取包括核酸与蛋白质的分离、核 酸的吸附、去除蛋白等杂质、核酸洗脱。 [0003] 目前提取cfDNA多使用酚-氯仿法、磁珠法和硅胶膜吸附柱法。酚-氯仿等试剂对人体有 伤害，且提取效率低、重复性差。磁珠法通常是在磁珠表面修饰不同的配体，如抗体、抗原、 寡核苷酸或适配体，这些配体与样品中的目标特异性结合。然后，在容器或管的一侧施加磁 铁，对磁珠进行吸附，经过洗涤、洗脱，得到纯化的核酸。磁珠提取技术可用于多种样本的 批量处理，是自动化、高通量的最佳选择之一，但是核酸纯度较低，常影响下游应用(酶切、 PCR等)。硅胶膜吸附柱法是结合特定的缓冲溶液、精确的pH和盐浓度实现对核酸的吸附。 研究发现，在酸性条件下，硅基质对DNA具有较高的结合亲和力，且随着盐浓度增加而增 加，这项技术涉及的机制是带负电荷的核酸和带正电荷的二氧化硅材料之间的亲和力，导致 核酸选择性地结合到二氧化硅基质上，而细胞的其余成分和其他化学物质则被冲走。该方法 快速、核酸纯度高、重现性好，其主要缺点是对小片段核酸的提取效率较磁珠法低，且常用 离液盐条件，对后续的盐分洗涤比较繁琐、冗长。柱提法还存在的一个严重的问题是高速离 心造成的剪切力，容易降解DNA，影响DNA的完整性。目前市场上主要的硅胶膜吸附柱法 提取游离核酸的产品是Qiagen公司的试剂盒，不但价格较昂贵，而且回收率仅约40％。因此 中国市场急切地需要一种无毒无害、无抑制剂残留、不影响DNA结构、价格廉价、高提取 率、高品质的cfDNA提取试剂盒。 [0004] 二氧化硅表面的类型在吸附的DNA总量中起着重要作用，对于给定的二氧化硅表面， 带正电荷的氨基酸促进DNA吸附，而带负电的氨基酸几乎没有促进作用。核酸的有效洗脱 与吸附同样重要，在较高的pH条件可通过增加二氧化硅表面上的负电荷密度，增加DNA和 二氧化硅表面之间的静电排斥，从而促进DNA洗脱。有研究显示，氨基酸缓冲液与高浓度 离液盐的作用相当，但是没有明确的文献阐述氨基酸结合低浓度离液盐在促进核酸吸附中的 作用。 [0005] PEG的性质稳定，无毒无害，耐热、酸碱，具有润滑性和粘结性。根据分子不同具有不 同的物理性质，分子量在700及以下的PEG呈无色无味、粘稠状，可使用不同相对分子质量 的PEG改变溶剂的粘度(Mr<2000)，作为粘度调节剂。聚乙二醇水溶液的粘度对剪切速率 较敏感，细菌不易在聚乙二醇上生长。PEG可诱导水溶液中大分子的聚集，增加溶液的粘度， 维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解，同时具有沉淀核酸的作用，常用于沉淀 病毒颗粒，还不曾用于cfDNA的提取。 [0006] 针对上述存在技术难题，本发明创新性地探究氨基酸与低浓度的离液盐结合，同时严格 控制缓冲液的pH值对提高提取效率的影响；探究低分子量聚乙二醇在降低DNA剪切力损伤 中的作用。为市场寻找到一种提取方法可以替代高浓度离液盐条件并可以高效地促进硅胶膜 对小片段DNA的捕获能力，增大cfDNA提取效率，同时保证DNA的完整性，无抑制剂残 留、提取的cfDNA质量高、操作简便、成本低廉。 发明内容[0007] 为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种氨基酸缓冲液及血浆游离DNA提 取试剂盒，通过将氨基酸与低浓度的离液盐结合，控制缓冲液的pH值，提高提取效率；使 用PEG降低DNA剪切力损伤，保证DNA的完整性；从而使得血浆游离DNA的提取无抑制 剂残留、提取质量高、操作简便、成本低廉。 [0008] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案： [0010] 前述的一种氨基酸缓冲液，氨基酸缓冲液的pH范围为：2.1-2.4。 [0011] 前述的一种氨基酸缓冲液，氨基酸包括：精氨酸，甘氨酸，组氨酸，谷氨酰胺。 [0012] 前述的一种氨基酸缓冲液，离液盐包括：碘化钠，盐酸胍，硫氰酸胍。 [0013] 前述的一种氨基酸缓冲液，PEG包括：PEG200，PEG400，PEG600。 [0014] 一种血浆游离DNA提取试剂盒，包括如下试剂： [0015] 裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸吸附缓冲液，洗涤液，TE洗脱液； [0016] 氨基酸吸附缓冲液包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M 氯化钠，40-100mM Tris-HCl，20-50mM EDTA，pH 2.1-2.4。 [0017] 前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒， [0018] 裂解液包括：20-100mM Tris-HCl，50-150mM NaCl，5-10％甘油，1-10％SDS，1-2mM EDTA，pH 7.0-8.0。 [0019] 前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒， [0020] 蛋白酶K工作液包括：取20mg蛋白酶K溶于1ml蛋白酶K缓冲液中，得到工作液，浓 度20mg/ml；蛋白酶K缓冲液：0.2-2％SDS，pH7.5-8.0。 [0021] 前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒， [0022] 洗涤液包括：Tris-HCl 50-100mM，乙醇65-80％，pH 2.1-2.4。 [0023] 前述的一种血浆游离DNA提取试剂盒， [0024] TE洗脱液包括：1-2mM EDTA，10-25mM Tris-HCl，调节至pH 8.5-10.0。 [0025] 本发明的有益之处在于： [0026] 本发明的缓冲液结合低浓度离液盐和氨基酸，使得cfDNA的回收率提高到45％，高于市 场现有cfDNA提取试剂盒； [0027] 本发明通过控制提取试剂的pH值低于二氧化硅的零电荷点，使硅胶膜表面带大量正电 荷，同时扩大了DNA吸附面积，极大程度上促进了小片段DNA的捕获效率，同时使用极低 的10μl洗脱体积，提高了cfDNA的产量和浓度； [0028] 探究发现PEG有明显防止DNA受剪切力损伤的作用，在离心柱法中添加PEG可以极大 程度上保证DNA的完整性，提高cfDNA质量； [0029] 本发明的提取方法可以替代高浓度离液盐条件并可以高效地促进硅胶膜对小片段DNA 的捕获能力，增大cfDNA提取效率，同时保证DNA的完整性，无抑制剂残留、提取的cfDNA 质量高、操作简便、成本低廉。附图说明 [0030] 图1是本发明实验三使用PEG600对降低cfDNA受剪切力损伤影响的对比结果(虚线代 表不加PEG600组，实线代表添加10％的PEG600组)； [0031] 图2是本发明实验四试剂盒与Qiagen公司试剂盒提取的cfDNA实时荧光定量PCR检测 图(实线为本发明试剂所提取的结果，虚线为Qiagen试剂盒所提取的结果)。 具体实施方式[0032] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。 [0033] 一种氨基酸缓冲液，包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M 氯化钠，40-100mM Tris-HCl，20-50mM EDTA，pH：2.1-2.4。 [0034] 一种血浆游离DNA提取试剂盒，包括如下试剂： [0035] 裂解液，蛋白酶K工作液，氨基酸吸附缓冲液，洗涤液，TE洗脱液； [0036] 裂解液包括：20-100mM Tris-HCl，50-150mM NaCl，5-10％甘油，1-10％SDS，1-2mM EDTA，pH 7.0-8.0； [0037] 蛋白酶K工作液包括：取20mg蛋白酶K溶于1ml蛋白酶K缓冲液中，得到工作液，浓 度20mg/ml；蛋白酶K缓冲液：0.2-2％SDS，pH7.5-8.0； [0038] 氨基酸吸附缓冲液包括：80-200mM氨基酸，0.1-0.3M离液盐，5％-15％PEG，0.5-1.2M 氯化钠，40-100mM Tris-HCl，20-50mM EDTA，pH 2.1-2.4。 [0039] 氨基酸包括：精氨酸，甘氨酸，组氨酸，谷氨酰胺。 [0040] 离液盐包括：碘化钠，盐酸胍，硫氰酸胍。 [0041] PEG包括：PEG200，PEG400，PEG600。 [0042] 洗涤液包括：Tris-HCl 50-100mM，乙醇65-80％，pH 2.1-2.4。 [0043] TE洗脱液包括：1-2mM EDTA，10-25mM Tris-HCl，调节至pH 8.5-10.0。 [0044] 裂解液能够促进核酸分离，氨基酸缓冲液促进核酸吸附，洗涤液能够稳定核酸结合并去 除杂质，洗脱液为低盐、高pH洗脱液能使核酸与硅胶膜有效分离。本发明的提取试剂盒无 抑制剂残留、洗脱体积低、cfDNA回收率高、提取时间短、cfDNA完整性好，对小片段DNA 富集能力强；以下通过实验验证这些有益效果。 [0045] 实验准备： [0046] 配制如下试剂： [0047] 1，裂解液：20-100mM Tris-HCl，50-150mM NaCl，5-10％甘油，1-10％SDS，1-2mM EDTA， pH 7.0-8.0。 [0048] 2，蛋白酶K缓冲液：0.2-2％SDS，pH7.5-8.0。蛋白酶K工作液：取20mg蛋白酶K溶 于1ml蛋白酶K缓冲液中，得到工作液，浓度20mg/ml。 [0049] 3，氨基酸吸附液A1：80-200mM氨基酸、0.5-1.2M氯化钠、40-100mM Tris-HCl、20-50 mM EDTA，pH 2.1-2.4。 [0050] 4，氨基酸吸附液A2：80-200mM氨基酸、0.5-1.2M氯化钠、40-100mM Tris-HCl、20-50 mM EDTA，pH 4.0-6.0。 [0051] 5，氨基酸吸附液B：80-200mM氨基酸、0.1-0.3M盐酸胍、0.5-1.2M氯化钠、40-100mM Tris-HCl、20-50mM EDTA，pH 2.1-2.4。 [0052] 6，氨基酸吸附液C：3-5M盐酸胍、0.5-1.2M氯化钠、40-100mM Tris-HCl、20-50 mM EDTA，pH 2.1-2.4。 [0053] 7，氨基酸吸附液D：80-200mM氨基酸、0.1-0.3M盐酸胍、PEG(200-600)5-15％，0.5-1.2M 氯化钠、40-100mM Tris-HCl、20-50mM EDTA，pH 2.1-2.4。 [0054] 8，洗涤液A：Tris-HCl 50-100mM，乙醇65-80％，pH 2.1-2.4。 [0055] 洗涤液B：Tris-HCl 50-100mM，乙醇65-80％，pH 4.0-6.0。 [0056] 9，TE洗脱液：1-2mM EDTA，10-25mM Tris-HCl，调节至pH 8.5-10.0。 [0057] 实验过程： [0058] 实验一，氨基酸缓冲液的pH值对cfDNA提取效率的影响； [0059] 设置两组实验，第一组：使用pH 2.3的吸附液和洗涤液，该组pH低于二氧化硅的零电 荷点，提取1份血浆样品，做3个重复，得到cfDNA产量，取平均，计算回收率；第二组： 使用pH 4.5的吸附液和洗涤液，该组pH高于二氧化硅的零电荷点，提取同样的1份血浆样 品，做3个重复，得到cfDNA产量，取平均，计算回收率。 [0060] 实验过程： [0061] a.将商品DNA溶于超纯水至100ng/μl和10ng/μl，A260/280＝1.8-2.0。准备1份血浆样 本，分成36管，每管取200μl。 [0062] b.DNA添加：分别向上述两组血浆样本中加入0ng、10ng、50ng、100ng、200ng、250ng 的DNA，每一组测试做3个重复。 [0063] c.加入200μl裂解液和20μl蛋白酶K，65℃孵育20分钟，98℃孵育20分钟； [0064] d.按1：1的体积比加入无水乙醇，颠倒混匀，静置3分钟，12000rpm离心5分钟，弃 上清。 [0065] e.向沉淀中加入200μl氨基酸吸附液A1或A2和50μl无水乙醇，静置2分钟，转入离 心柱，12000rpm离心30s。 [0066] f.加入500μl洗涤液A或洗涤液B，12000rpm离心30秒。重复1次。 [0067] g.空管离心2分钟，开盖晾干5分钟。 [0068] h.TE洗脱：加入30μl TE，静置2分钟，12000rpm离心2分钟。 [0069] 表1回收率统计 [0070] [0071] 结果分析：如表1，pH2.3组回收率明显高于pH4.5组，最大回收率分别为45％和35％， 说明降低pH到二氧化硅的零电荷点以下可以增大硅胶膜表面的核酸吸附面积，增强正电荷 分布密度，从而提高了其对小片段DNA的捕获能力，显著提高了回收率。 [0072] 控制pH小于二氧化硅的零电荷点，使二氧化硅严格带正电，比常用的酸性条件(pH4.0-6.0) 下带电量更多，能明显增大其表面正电荷量，充分利用硅胶膜的表面积，显著地提高了DNA 的吸附性，增强了小片段DNA的捕获率。 [0073] 实验二，低浓度离液盐与氨基酸结合的缓冲液对DNA产量的影响； [0074] 设置两组实验， [0075] 第一组：使用pH 2.3的吸附液和洗涤液，添加0.2M的盐酸胍，提取5份血浆样品，每 份做2个重复，计算cfDNA产量，取平均； [0076] 第二组：使用pH 2.3的吸附液和洗涤液，添加4M的盐酸胍，提取相同的5份血浆样品， 每份做2个重复，计算cfDNA产量，取平均； [0077] 具体实验步骤如下： [0078] 实验步骤： [0079] a.准备5份血浆样本，分别取200μl至各离心管中。 [0080] b.加入200μl裂解液和20μl蛋白酶K，65℃孵育20分钟，98℃孵育20分钟。 [0081] c.按1：1的体积比加入无水乙醇，颠倒混匀，静置3分钟，12000rpm离心5分钟，弃 上清。 [0082] d.向沉淀中加入200μl氨基酸吸附液B或C和50μl无水乙醇，静置2分钟，转入离心 柱，12000rpm离心30s。 [0083] e.加入500μl洗涤液A，12000rpm离心30秒。重复1次。 [0084] f.空管离心2分钟，开盖晾干5分钟。 [0085] g.TE洗脱：加入30μl TE，静置2分钟，12000rpm离心2分钟。 [0086] 血浆cfDNA提取产量的结果如下表2所示： [0087] 表2离液盐浓度对血浆cfDNA提取产量的影响 [0088] [0089] 结果分析：如表2，低浓度离液盐结合氨基酸组的cfDNA产量平均为41.1ng，高于高离 液盐浓度组(31.2ng)，增长率为32％。说明将组氨酸与低离液盐结合更有利于提高cfDNA 的产量，由于带正电荷的组氨酸已经发挥促进DNA吸附的大部分效果，借助低浓度的离液 盐，进一步破坏DNA与水的结合，二者的有机结合为DNA转移到硅胶膜提供了最佳的条件。 而高浓度的离液盐，效果比前者弱，且由于胍盐大量残留，阻碍了DNA的洗脱，影响DNA 的产量，而且造成了浪费。 [0090] 本发明将低浓度离液盐与氨基酸缓冲液结合，既避免了高盐残留引起的洗脱步骤繁琐和 对下游实验的抑制，同时又降低了DNA与水的相互作用，通过增强疏水作用、静电作用和 氢键作用，最大地发挥了硅胶膜对DNA的吸附能力。 [0091] 实验三，考察PEG对防止DNA因剪切力而降解的作用； [0092] 设置两组实验： [0093] 组1添加10％的PEG600，提取3份血浆样品，每份做2个重复，求CT平均值； [0094] 组2不添加PEG600，提取相同的3份血浆样品，每份做2个重复，求CT平均值。 [0095] 预先设计实验用引物探针： [0096] 为了验证本发明对cfDNA的提取效率，设计GAPDH基因的引物和荧光检测探针，使扩增 产物长度为156bp，进行实时荧光定量PCR，比较不同方法提取的cfDNA的含量。 [0097] 引物序列，GAPDH-F:5’-TTGACCTCAACTACATGGTTTAC-3’(SEQ ID.NO 01)； [0098] GAPDH-R:5’-GGATCTCGCTCCTGGAAG-3’(SEQ ID.NO 02)； [0099] 探针序列：GAPDH-P：5’-FAM-CACCGTCAAGGCTGAGAACG-BHQ1-3’(SEQ ID.NO 03)。 [0100] 具体实验步骤： [0101] a.准备3份血浆样本，分别取200μl至各离心管中。 [0102] b.加入200μl裂解液和20μl蛋白酶K，65℃孵育20分钟，98℃孵育20分钟； [0103] c.按1：1的体积比加入无水乙醇，颠倒混匀，静置3分钟，12000rpm离心5分钟，弃 上清。 [0104] d.向沉淀中加入200μl氨基酸吸附液B或D和50μl无水乙醇，静置2分钟，转入离心 柱，12000rpm离心30s。 [0105] e.加入500μl洗涤液A，12000rpm离心30秒。重复1次。 [0106] f.空管离心2分钟，开盖晾干5分钟。 [0107] j.加入30μl TE，静置2分钟，12000rpm离心2分钟。 [0108] 实验结果如表3所示。 [0109] 表3 PEG600对防止DNA降解的影响 [0110] [0111] 结果分析：如表3，添加10％PEG600组的CT值普遍比不加PEG600组的靠前，CT值 相差1.0-1.3，相应的浓度值相差了2-2.46倍。实时荧光PCR结果如图1，其中虚线代表不加 PEG600组，实线代表添加10％的PEG600组。可以看出添加10％的PEG600能显著提高检测 灵敏度，进一步说明PEG600降低了离心剪切力对DNA造成的破坏，保留了更加完整的cfDNA 片段。 [0112] 本发明试剂盒将PEG引入cfDNA提取，通过添加PEG从而增大了溶剂的粘稠度，大大 减小了cfDNA受剪切力的破坏作用，把微量的血浆cfDNA的损失降到最低，最大限度地保 证了血浆cfDNA的回收。 [0113] 实验四：采用本发明的试剂盒与市场上的试剂盒提取血浆样本cfDNA，对比检测提取效 果； [0114] 运用实验三的引物探针和PCR反应体系，使用本发明试剂盒提取5份抗凝血样本的 cfDNA，以Qiagen公司的QIAamp Circμlating Nucleic Acid Kit为对照方法。 [0115] 具体操作步骤分别如下， [0116] 本发明试剂盒提取血浆cfDNA方法： [0117] a.准备5份血浆样本，分别取200μl至5个离心管中。 [0118] b.加入200μl裂解液和20μl蛋白酶K，65℃孵育20分钟，98℃孵育20分钟； [0119] c.按1：1的体积比加入无水乙醇，颠倒混匀，静置3分钟，12000rpm离心5分钟，弃 上清。 [0120] d.向沉淀中加入200μl氨基酸吸附液D和50μl无水乙醇，静置2分钟，转入离心柱， 12000rpm离心30s。 [0121] e.加入500μl洗涤液A，12000rpm离心30秒。重复1次。 [0122] f.空管离心2分钟，开盖晾干5分钟。 [0123] g.加入30μl TE，静置2分钟，12000rpm离心2分钟。 [0124] h.PCR验证：将以上两种方法提取的cfDNA用GAPDH引物扩增，荧光探针检测，PCR 扩增体系如表4。 [0125] 表4：PCR体系组成 [0126] [0127] [0128] 补充超纯水至25μl。 [0129] 扩增程序为：95℃5min；95℃15s，60℃20s(采集荧光)，45个循环。使用SLAN96P 循环仪。 [0130] 结果如图2，其中实线为本发明试剂所提取的结果，虚线为Qiagen试剂盒所提取的结果， Ct值如表5所示。 [0131] 表5本发明试剂盒与Qiagen公司试剂盒提取结果 [0132] [0133] 结果分析：本发明方法比Qiagen试剂盒方法得到Ct值靠前1.0-2.4，核酸浓度是Qiagen 试剂盒的2-5倍。本发明方法提取的核酸浓度是Qiagen产品的2倍以上，且不使用酚氯仿等 有害试剂、无抑制剂残留，适用于多种下游应用。 [0134] 综合以上四个实验可知：本发明的缓冲液结合低浓度离液盐和氨基酸，使得cfDNA的回 收率提高到45％，高于市场现有cfDNA提取试剂盒；本发明通过控制提取试剂的pH值低于 二氧化硅的零电荷点，使硅胶膜表面带大量正电荷，同时扩大了DNA吸附面积，极大程度 上促进了小片段DNA的捕获效率，同时使用极地的10μl洗脱体积，提高了cfDNA的产量和 浓度；探究发现PEG有明显防止DNA受剪切力损伤的作用，在离心柱法中添加PEG可以极 大程度上保证DNA的完整性，提高cfDNA质量；本发明的提取方法可以替代高浓度离液盐 条件并可以高效地促进硅胶膜对小片段DNA的捕获能力，增大cfDNA提取效率，同时保证 DNA的完整性，无抑制剂残留、提取的cfDNA质量高、操作简便、成本低廉。 [0135] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解， 上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案， 均落在本发明的保护范围内。 |
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