[0001] 本发明属于材料技术领域，具体涉及一种具有微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水 凝胶的制备方法。

[0002] 水凝胶具有内部三维微孔结构不仅有利于细胞在凝胶内部迁移、铺展和增殖，而且便于 营养物质与代谢产物的运输传递，因而在生物医药领域包括干细胞培养、组织工程等具有广 泛的应用前景。

[0003] 生物体内血液中血小板富含多种细胞因子和生长因子，能够促进伤口愈合、骨修复和软 组织修复。如血小板通过脱颗粒作用释放血小板源性生长因子(PDGF)能促进成骨细胞前体 的有丝分裂；释放血管内皮生长因子(VEGF)能够促进新生血管的形成，释放转化生长因子-β (TGF-β)可诱导间充质干细胞增殖及分化为成骨细胞，并促进胶原合成[I.Andia,N.Maffulli. Nat.Rev.Rheumatol.,2013,9,721]。由于血小板来源丰富、无毒并具有生物活性，利用血小板 组分制备水凝胶在细胞培养、组织再生等方面已得到广泛研究。目前，血小板衍生凝胶主要 包括富血小板纤维蛋白凝胶和水凝胶复合血小板裂解液。前者通过钙剂或凝血酶激活血小板 形成纤维蛋白凝胶，但其内部孔径通常小于10微米，无法制备内部大孔结构的凝胶[R.J.Miron, J.Choukroun.et.al.Tissue Eng Part B Rev.,
2017,23,83]。后者以胶原等水凝胶为主要基质物理 包裹血小板裂解液，血小板裂解液在凝胶中的质量百分比不超过50％[S.T.Robinson,L.P. Brewster.et.al.Acta Biomater.,
2016,36,86]。因此，制备以血小板组分为基质并具有三维大孔 结构的多孔水凝胶具有重要的应用价值，并且迄今为止尚未见报道。

[0004] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆 基水凝胶。

[0005] 本发明的第二个目的是提供一种具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的制备 方法。

[0006] 本发明的技术方案概述如下：

[0007] 具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0008] 1)向富血小板裂解液血浆冻干粉中加入pH＝7.2±0.3的磷酸缓冲液，配成质量浓度为20％～60％的富血小板裂解液血浆溶液；

[0009] 2)向交联剂中加入pH＝7.2±0.3的磷酸缓冲液，配成质量浓度为1％～3％的交联剂溶液， 加入EDC,震荡反应20～40分钟，再加入NHS，混匀；所述EDC、NHS与交联剂的摩尔比为(3～ 4):(1～1.2):1；所述EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；NHS为N-羟基琥 珀酰亚胺的缩写；

[0010] 3)在离心管中依次加入：a.步骤1)获得的富血小板裂解液血浆溶液；b.质量浓度为0.5毫 克/毫升的罗丹明-牛血清蛋白水溶液；c.pH＝7.2±0.3的磷酸缓冲溶液；d.步骤2)获得的液体； 所述a:b:c:d的体积比为1：0.05：(0-3)：(0.67-6)；混匀后倒入模具中，在-
10℃～-20℃，反应 16～30小时。

[0011] 交联剂优选为粘均分子量≥2000cps的海藻酸钠、数均分子量100000～200000透明质酸或 数均分子量100000的聚丙烯酸。

[0012] 上述方法制备的具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶。

[0013] 本发明的优点：

[0014] (1)本发明的具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶所用主要原料血小板富含 多种细胞因子和生长因子(如bFGF、VEGF和SDF-1等)。

[0015] (2)本发明制备的具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶具有内部微孔结构和 高孔隙率，便于干细胞在多孔凝胶内部铺展和相互交联。同时多孔凝胶能缓慢释放多种生长 因子和细胞因子促进干细胞增殖，在干细胞培养和组织再生领域具有潜在的应用价值。

[0016] (3)本发明的方法简便，低温环境有利于生物活性分子的保存。附图说明

[0017] 图1为实施例1制备的圆柱形具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的光学照 片。

[0018] 图2为具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的共聚焦显微镜照片。(A)实施例 1制备；(B)实施例2制备；(C)实施例4制备。

[0019] 图3凝胶的溶胀率(A)与孔隙率(B)。I为对照组多孔凝胶；II为实施例1制备的水凝 胶。

[0020] 图4对照组多孔凝胶的模量表征(A)；实施例1制备的水凝胶的模量表征(B)；对照组 多孔凝胶和实施例1制备的凝胶的储存模量(C)。I为对照组多孔凝胶；II实施例1制备的 凝胶。图5实施例1制备的凝胶生物活性分子释放曲线，(A)SDF-1、(B)VEGF和(C)bFGF。

[0021] 图6骨髓间充质干细胞在实施例1制备的凝胶中的(A)存活率：第一个柱状是空白组； 第二个柱状为对照组多孔凝胶；第三个柱状为实施例1制备的凝胶组。(B)增殖率：第一个 柱状为对照组多孔凝胶；第二个柱状为实施例1制备的凝胶组。

[0022] 图7骨髓间充质干细胞在凝胶中生长7天后的骨架结构共聚焦显微镜照片。(A)对照组 多孔凝胶内部的骨髓间充质干细胞骨架，(B)对照组多孔凝胶内部的骨髓间充质干细胞骨架 与凝胶孔径结构组合；(C)为实施例1制备的凝胶内部的骨髓间充质干细胞骨架，(D)实施 例1制备的凝胶内部的骨髓间充质干细胞骨架与凝胶结构组合。

[0023] N-羟基琥珀酰亚胺罗丹明(NHS-Rhodamine,分子量：528)

[0024] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0025] 富血小板裂解液血浆冻干粉的制备：包括如下步骤：

[0026] 取人血液1毫升，在100g转速下离心10分钟，再在800g转速下离心15分钟，收集上层淡黄 色溶液移走下层红细胞溶液，通过液氮快速冷冻淡黄色溶液，再在37℃水浴中融解，反复操 作冷冻-融解4次(也可以3次或5次)，1400g转速下离心10分钟，收集上清为富血小板裂解液 血浆，冷冻干燥获得的富血小板裂解液血浆冻干粉，在-80℃中保存。

[0027] 质量浓度为0.5毫克/毫升的罗丹明-牛血清蛋白水溶液用下述方法制成：

[0028] 将0.5毫升、浓度为10毫克/毫升的N-羟基琥珀酰亚胺罗丹明-二甲基亚砜溶液，加入到5 毫升、浓度为10毫克/毫升的牛血清蛋白-pH＝7.2±0.5的磷酸缓冲溶液中，室温，在转速为1000 转/分钟下反应12小时，用截留分子量为10000透析袋，在去离子水中透析3天，冷冻干燥得到 罗丹明-牛血清蛋白粉；用水为溶剂，配制质量浓度为0.5毫克/毫升的罗丹明-牛血清蛋白水 溶液。

[0029] 各实施例中EDC为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺的缩写；NHS为N-羟基琥珀 酰亚胺的缩写。

[0030] 实施例1

[0031] 具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0032] 1)向富血小板裂解液血浆冻干粉中加入pH＝7.2的磷酸缓冲液，配成质量浓度为40％的 富血小板裂解液血浆溶液；

[0033] 2)向海藻酸钠(粘均分子量≥2000cps)中加入pH＝7.2的磷酸缓冲液，配成质量浓度为 2％的海藻酸钠溶液，加入EDC,震荡反应30分钟，再加入NHS，混匀；所述EDC、NHS与交联剂海 藻酸钠的摩尔比为3.5:1.1:1；

[0034] 3)在离心管中依次加入：a.步骤1)获得的富血小板裂解液血浆溶液；b.质量浓度为0.5 毫克/毫升的罗丹明-牛血清蛋白水溶液；c.pH＝7.2的磷酸缓冲溶液；d.步骤2)获得的液体； 所述a:b:c:d的体积比为1：0.05：1.5：2.5；混匀后倒入直径5毫米、厚度3毫米的聚四氟乙 烯模具中，在-15℃，反应24小时。

[0035] 本实施例得到的产物为圆柱形，如图1所示。共聚焦显微镜显示多孔凝胶内部为无规微 孔，孔径大小为100-150微米(如图2A所示)。

[0036] 实施例2

[0037] 具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0038] 1)向富血小板裂解液血浆冻干粉中加入pH＝7.5的磷酸缓冲液，配成质量浓度为20％的 富血小板裂解液血浆溶液；

[0039] 2)向透明质酸(数均分子量100000～200000)中加入pH＝7.5的磷酸缓冲液，配成质量浓 度为1％的透明质酸溶液，加入EDC,震荡反应20分钟，再加入NHS，混匀；所述EDC、NHS与交 联剂透明质酸的摩尔比为3:1:1；

[0040] 3)在离心管中依次加入：a.步骤1)获得的富血小板裂解液血浆溶液；b.质量浓度为0.5 毫克/毫升的罗丹明-牛血清蛋白水溶液；c.pH＝7.5的磷酸缓冲溶液；d.步骤2)获得的液体； 所述a:b:c:d的体积比为1：0.05：0：1.5；混匀后倒入模具中，在-10℃，反应16小时。

[0041] 本实施例得到的产物。共聚焦显微镜显示多孔凝胶内部为无规微孔，孔径大小为40-50 微米(如图2B所示)。

[0042] 实施例3

[0043] 具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0044] 1)向富血小板裂解液血浆冻干粉中加入pH＝6.9的磷酸缓冲液，配成质量浓度为60％的 富血小板裂解液血浆溶液；

[0045] 2)向聚丙烯酸(数均分子量100000)中加入pH＝6.9的磷酸缓冲液，配成质量浓度为3％ 的聚丙烯酸溶液，加入EDC,震荡反应40分钟，再加入NHS，混匀；所述EDC、NHS与交联剂聚 丙烯酸的摩尔比为4:1.2:1；

[0046] 3)在离心管中依次加入：a.步骤1)获得的富血小板裂解液血浆溶液；b.质量浓度为0.5 毫克/毫升的罗丹明-牛血清蛋白水溶液；c.pH＝6.9的磷酸缓冲溶液；d.步骤2)获得的液体； 所述a:b:c:d的体积比为1：0.05：0.42：0.67；混匀后倒入模具中，在-20℃，反应30小时。

[0047] 共聚焦显微镜显示，多孔凝胶内部为无规微孔，孔径大小与实施例2相似。

[0048] 实施例4

[0049] 具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

[0050] 1)向富血小板裂解液血浆冻干粉中加入pH＝7.2的磷酸缓冲液，配成质量浓度为40％的 富血小板裂解液血浆溶液；

[0051] 2)向透明质酸(数均分子量100000～200000)中加入pH＝7.2的磷酸缓冲液，配成质量浓 度为3％的透明质酸溶液，加入EDC,震荡反应30分钟，再加入NHS，混匀；所述EDC、NHS与交 联剂透明质酸的摩尔比为3:1.2:1；

[0052] 3)在离心管中依次加入：a.步骤1)获得的富血小板裂解液血浆溶液；b.质量浓度为0.5 毫克/毫升的罗丹明-牛血清蛋白水溶液；c.pH＝7.2的磷酸缓冲溶液；d.步骤2)获得的液体； 所述a:b:c:d的体积比为1：0.05：3：6；混匀后倒入模具中，在-15℃，反应20小时。

[0053] 本实施例得到的产物。共聚焦显微镜显示多孔凝胶内部为无规微孔，孔径大小为150～ 200微米(如图2C所示)。

[0054] 实施例5

[0055] 具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶性能测试

[0056] 将实施例1制备的具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶(简称实施例1制备的 水凝胶)冷冻干燥后称重为W1，再用去离子水浸泡16小时称重为W2，然后用滤纸将浸泡凝胶中 的水吸干再称重为W3。

[0057] 孔径为100微米的甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠多孔凝胶为对照组多孔凝胶，制备方法为 [S.K.Seidlits,Z Z.Khaing,C E.Schmidt.et.al.Biomaterial,2010,31,p3931]：在离心管中依次加 入20微升甲基丙烯酸酯改性的海藻酸钠水溶液[浓度为25％(w/v)]，28微升磷酸缓冲溶液 (pH＝7.2)，1微升N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)和1微升浓度100mg/mL过硫酸钠(APS) 水溶液。混匀后倒入直径5毫米、厚度3毫米的聚四氟乙烯模具中，在-16℃冰箱中反应24小时。 通过共聚焦显微镜观察多孔凝胶的内部孔径约为100微米。

[0058] 按照公式：溶胀率＝W2/W1，孔隙率＝W2/W3×100％，分别计算凝胶的溶胀率及孔隙率，结果 如图3(图3中I为对照组多孔凝胶，II为实施例1制备的水凝胶)。实施例1制备的水凝胶孔隙 率为79％，与对照组多孔凝胶相似。但是溶胀率约为13，小于对照组水凝胶。

[0059] 通过流变仪检测实施例1制备的水凝胶和对照组凝胶的储存模量和损耗模量，结果如图4 所示。实施例1制备的水凝胶(B)的储存模量约为25000帕斯卡，而对照组多孔凝胶(A)的 储存模量只有1200帕斯卡左右，说明实施例1制备的水凝胶具有更好的力学性能。

[0060] 实施例1制备的的凝胶生物活性分子释放行为检测方法如下：将实施例1制备的凝胶置 于(pH＝7.2)磷酸缓冲液中，37℃下在不同时间点收集释放液同时补充新鲜磷酸缓冲液，利 用酶联免疫吸附法测定释放液中基质细胞衍生因子-1(SDF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)和碱 性成纤维生长因子(bFGF)的含量。如图5所示，在前两天实施例1制备的凝胶快速释放SDF-1、 VEGF及bFGF，然后缓慢释放直到第7天。

[0061] 实施例6

[0062] 骨髓间充质干细胞在具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶内部的存活、铺展 与增殖测试

[0063] 在无菌操作台中先将实施例1制备的凝胶平放于96孔板中为实验组；

[0064] 将对照组多孔凝胶平放于96孔板中；

[0065] 不含凝胶材料的96孔板为空白组；

[0066] 再将1×103～5×103个骨髓间充质干细胞接种于各组，静置10分钟，加入150微升培养基 (含10％牛血清、1％双抗的低糖DMEM；血清双抗低糖DMED均购自GIBCO)，置于37℃、5％CO2培 养箱中培养

[0067] 各组21个平行，分别于第1、3、7天各取出3个含有细胞的样品进行细胞死活染色(红色 为死细胞、绿色为活细胞)并统计死细胞和活细胞个数，再按公式：存活率＝活细胞数/(死 细胞数+活细胞数)×100％，计算细胞存活率。如图6A所示，实施例1制备的凝胶的细胞存活 率达90％以上，具有良好的生物相容性。再分别在第1天、第3天、第7天取出各组的3个含有细 胞的样品通过细胞增殖-毒性检测试剂盒检测骨髓间充质干细胞在富血小板裂解液血浆基多 孔凝胶内部的增殖率。各组另3个平行于第7天进行细胞骨架染色(红色为凝胶内部孔径、绿 色为细胞骨架及蓝色为细胞核)，并通过共聚焦显微镜观察细胞形态；与对照组凝胶内部干细 胞相比，实施例1制备的凝胶内部的干细胞铺展更充分并相互交联(如图7所示)，展现出良好 的生长状态和增殖效率(如图6B)。

[0068] 实验证明，实施例1制备的凝胶生物相容性良好，机械性能好，含有许多生长因子，有利 于骨髓间充质干细胞的铺展和增殖。

[0069] 实验证明实施例2、实施例3及实施例4具有良好的生物相容性，只是孔径大小不同机械性 能及骨髓间充质干细胞在具微米多孔结构的富血小板裂解液血浆基水凝胶中的铺展情况不同 (孔径小细胞铺展不充分，孔径大细胞铺展充分)，但同样都含有许多生长因子能促进骨髓间 充质干细胞的增殖。

[0070] 通过实施例1得到富血小板裂解液血浆基多孔凝胶(海藻酸钠为交联剂)内部孔径约为 100微米，无规分布。多孔凝胶具有良好的生物相容性，并富含有多种生长因子和细胞因子， 能够促进干细胞在多孔凝胶内部铺展和增殖。因此富血小板裂解液血浆基多孔凝胶在干细胞 培养、组织再生等领域具有潜在的应用价值。

[0071] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。