人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液及其制备方法和应用
| 热词 | 粪便 核酸 裂解 细胞 脱落 提取 硫氰酸 去污剂 氰酸 triton | ||
| 专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 申请权转移; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN201711222569.2 | 申请日 | 2017-11-29 |
| 公开(公告)号 | CN107937391B | 公开(公告)日 | 2021-07-09 |
| 申请人 | 上海透景生命科技股份有限公司; 上海透景诊断科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 左红伟; 李志甲; 朱凤; | 第一发明人 | 左红伟 |
| 权利人 | 上海透景生命科技股份有限公司,上海透景诊断科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 上海透景生命科技股份有限公司,上海透景诊断科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：上海市浦东新区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：上海市浦东新区中国(上海)自由贸易试验区碧波路572弄115号1幢 | 邮编 | 当前专利权人邮编：201203 |
| 主IPC国际分类 | C12N15/10 | 所有IPC国际分类 | C12N15/10 ; C12Q1/6806 |
| 专利引用数量 | 1 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 8 | 专利文献类型 | B |
| 专利代理机构 | 上海大视知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 顾小伟; |
| 摘要 | 本 发明 提供一种人 粪便 中脱落细胞核酸提取裂解液，包括：1mol/L～8mol/L胍盐、1mM～20mM 金属离子 螯合剂和pH7.5～8.0的100mM Tris‑HCl缓冲溶液，其中，胍盐选自 盐酸 胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍中的至少一种，金属离子螯合剂选自 乙二胺四乙酸 和乙二胺四乙酸的 水 溶性盐中的至少一种。优选地，还包括1％体积～20％体积的 表面活性剂 ，表面活性剂为非离子型 去污 剂，非离子型去污剂选自Tween‑20、Tween‑80、Brij‑35、NP40和Triton‑100中的至少一种。还提供了相关制备方法和应用。本发明的裂解液能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，满足后续核酸检测用量，适于大规模推广应用。 | ||
| 权利要求 | 1.一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，其特征在于，包括以下组分和用量： |
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| 说明书全文 | 人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液及其制备方法和应用技术领域[0001] 本发明涉及核酸提取技术领域，特别涉及核酸提取裂解液技术领域，具体是指一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液、及其制备方法和应用。 背景技术[0003] 大量研究表明，粪便既含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DNA；又由于肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，使从粪便中提取的DNA质量较好。因此，粪便DNA是进行消化道肿瘤分子检测、分子诊断的最佳标本。 [0004] 但是粪便成分十分复杂，样本中杂质较多，如食物残渣、胆盐、胆红素、腐殖质、色素等，使得粪便样本中核酸的纯化与富集具有较大的难度。 [0005] 常规的核酸裂解液用于粪便样本很难获得高纯度和高得率的核酸，且难以满足后续相关肿瘤检测所需的用量。 [0006] 因此，需要提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，其能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保。 发明内容[0007] 为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，其能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，适于大规模推广应用。 [0008] 本发明的另一目的在于提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，其设计巧妙，配制简便，成本低，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保，适于大规模推广应用。 [0009] 本发明的另一目的在于提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的配制方法，采用该方法配制的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，适于大规模推广应用。 [0010] 本发明的另一目的在于提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的配制方法，其设计巧妙，配制简便，成本低，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保，适于大规模推广应用。 [0011] 本发明的一个目的在于提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液在人粪便中脱落细胞核酸提取中的应用，其能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，适于大规模推广应用。 [0012] 本发明的一个目的在于提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液在人粪便中脱落细胞核酸提取中的应用，其设计巧妙，操作简便，成本低，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保，适于大规模推广应用。 [0013] 为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，其特点是，包括以下组分和用量： [0014] 胍盐 1mol/L～8mol/L， [0015] 金属离子螯合剂 1mM～20mM，和 [0016] pH7.5～8.0的Tris‑HCl缓冲溶液 100mM，其中， [0018] 较佳地，所述胍盐是异硫氰酸胍。 [0019] 更佳地，所述胍盐是5M异硫氰酸胍。 [0020] 较佳地，所述金属离子螯合剂是乙二胺四乙酸二钠。 [0021] 较佳地，所述Tris‑HCl缓冲溶液的pH值为8.0。 [0022] 较佳地，所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液还包括1％体积～20％体积的表面活性剂，所述表面活性剂为非离子型去污剂，所述非离子型去污剂选自Tween‑20、Tween‑80、Brij‑35、NP40和Triton‑100中的至少一种。 [0023] 更佳地，所述非离子型去污剂为Brij‑35和Triton‑100；或者，所述非离子型去污剂为NP40和Triton‑100。 [0024] 更进一步地，所述胍盐是异硫氰酸胍。 [0025] 尤其更佳地，，所述胍盐是5M异硫氰酸胍，所述非离子型去污剂为2％Triton‑100和3％Brij‑35。 [0026] 尤其更佳地，所述胍盐是5M异硫氰酸胍，所述非离子型去污剂为5％Triton‑100和3％NP40。 [0027] 在本发明的第二方面，还提供了上述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的制备方法，其特点是，包括以下步骤： [0028] (1)在去离子水中加入所述金属离子螯合剂、所述缓冲溶液的缓冲物质和所述胍盐，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物； [0029] (2)调节所述混合物的pH至7.5～8.0。 [0030] 较佳地，在所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液还包括1％体积～20％体积的表面活性剂的情况下，所述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的制备方法还包括： [0031] (3)将所述表面活性剂加入到所述混合物中，混匀。 [0032] 在本发明的第三方面，还提供了上述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液在人粪便中脱落细胞核酸提取中的应用。 [0033] 在本发明的第四方面，还提供了一种使用上述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液从人粪便中提取脱落细胞核酸的方法，其特点是，包括以下步骤： [0034] (A)将人粪便和粪便前处理液混合振荡，离心取上清液；和 [0035] (B)在所述上清液中加入所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液和蛋白酶K，混匀后加热裂解，从而得到细胞裂解液。 [0036] 较佳地，在所述步骤(A)中，所述人粪便和所述粪便前处理液的体积比为1：5。 [0037] 较佳地，在所述步骤(A)中，所述粪便前处理液为含有20mM～100mM的NaCl、5％体积～10％体积的PVP和2％体积～5％体积的SDS以及pH5.5的150mM醋酸钠缓冲溶液。 [0038] 较佳地，在所述步骤(B)中，所述上清液和所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液等体积。 [0039] 较佳地，所述方法还包括以下步骤： [0041] (D)去除所述细胞裂解液，采用洗涤液洗涤所述磁珠，然后采用洗脱液将所述核酸从所述磁珠上洗脱下来。 [0042] 更佳地，在所述步骤(C)中，所述结合液为乙醇或异丙醇。 [0043] 本发明的有益效果主要在于： [0044] 1、本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液包括以下组分和用量：1mol/L～8mol/L胍盐、1mM～20mM金属离子螯合剂和pH7.5～8.0的100mM Tris‑HCl缓冲溶液，胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍中的至少一种，金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种，采用该人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，适于大规模推广应用。 [0045] 2、本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液包括以下组分和用量：1mol/L～8mol/L胍盐、1mM～20mM金属离子螯合剂和pH7.5～8.0的100mM Tris‑HCl缓冲溶液，胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍中的至少一种，金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种，设计巧妙，配制简便，成本低，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保，适于大规模推广应用。 [0046] 3、本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的配制方法包括以下步骤：(1)在去离子水中加入所述金属离子螯合剂、所述缓冲溶液的缓冲物质和所述胍盐，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物；(2)调节所述混合物的pH至7.5～8.0；和(3)在所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液还包括1％体积～20％体积的表面活性剂的情况下，将所述表面活性剂加入到所述混合物中，混匀，从而得到所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，采用该方法配制的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，适于大规模推广应用。 [0047] 4、本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的配制方法包括以下步骤：(1)在去离子水中加入所述金属离子螯合剂、所述缓冲溶液的缓冲物质和所述胍盐，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物；(2)调节所述混合物的pH至7.5～8.0；和(3)在所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液还包括1％体积～20％体积的表面活性剂的情况下，将所述表面活性剂加入到所述混合物中，混匀，从而得到所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，设计巧妙，配制简便，成本低，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保，适于大规模推广应用。 [0048] 5、本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液在人粪便中脱落细胞核酸提取中的应用中，人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，适于大规模推广应用。 [0049] 6、本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液在人粪便中脱落细胞核酸提取中的应用中，设计巧妙，操作简便，成本低，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保，适于大规模推广应用。 具体实施方式[0051] 为了更好地提取人粪便中脱落细胞的核酸以用于肿瘤相关领域的诊断检测，本发明提供了一种人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，并配合相关的粪便核酸提取流程，满足肿瘤诊断检测中粪便核酸的需求。 [0052] 本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，包括以下组分和用量： [0053] 胍盐 1mol/L～8mol/L， [0054] 金属离子螯合剂 1mM～20mM，和 [0055] pH7.5～8.0的Tris‑HCl缓冲溶液 100mM，其中， [0056] 所述胍盐选自盐酸胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍中的至少一种，所述金属离子螯合剂选自乙二胺四乙酸和乙二胺四乙酸的水溶性盐中的至少一种。 [0057] 所述胍盐可以是盐酸胍、异硫氰酸胍或硫氰酸胍，也可以是其中任意两种以上的组合，较佳地，所述胍盐是异硫氰酸胍。 [0058] 所述胍盐可以是任何合适浓度的异硫氰酸胍，更佳地，所述胍盐是5M异硫氰酸胍。 [0059] 所述金属离子螯合剂可以是乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸的水溶性盐，也可以是其中任意两种以上的组合。较佳地，所述金属离子螯合剂是乙二胺四乙酸二钠。 [0060] 所述Tris‑HCl缓冲溶液的pH值可以根据需要确定，较佳地，所述Tris‑HCl缓冲溶液的pH值为8.0。 [0061] 为了获得更佳地裂解效果，较佳地，所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液还包括1％体积～20％体积的表面活性剂，所述表面活性剂为非离子型去污剂，所述非离子型去污剂选自Tween‑20、Tween‑80、Brij‑35、NP40和Triton‑100中的至少一种。 [0062] 所述非离子型去污剂可以是Tween‑20、Tween‑80、Brij‑35、NP40或Triton‑100，也可以是其中任意两种以上的组合。更佳地，所述非离子型去污剂为Brij‑35和Triton‑100；或者，所述非离子型去污剂为NP40和Triton‑100。 [0063] 更进一步地，所述胍盐和所述表面活性剂的优选组合为：所述胍盐是异硫氰酸胍，且所述非离子型去污剂为Brij‑35和Triton‑100。 [0064] 更进一步地，所述胍盐和所述表面活性剂的优选组合为：所述胍盐是异硫氰酸胍，且所述非离子型去污剂为NP40和Triton‑100。 [0065] 尤其更佳地，所述胍盐和所述表面活性剂的更优选组合为：所述胍盐是5M异硫氰酸胍，所述非离子型去污剂为2％Triton‑100和3％Brij‑35。 [0066] 尤其更佳地，所述胍盐和所述表面活性剂的更优选组合为：所述胍盐是5M异硫氰酸胍，所述非离子型去污剂为5％Triton‑100和3％NP40。 [0067] 本发明还提供了上述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的制备方法，包括以下步骤： [0068] (1)在去离子水中加入所述金属离子螯合剂、所述缓冲溶液的缓冲物质和所述胍盐，并使各组分溶解混匀，从而得到混合物； [0069] (2)调节所述混合物的pH至7.5～8.0。 [0070] 较佳地，在所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液还包括1％体积～20％体积的表面活性剂的情况下，所述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的制备方法还包括： [0071] (3)将所述表面活性剂加入到所述混合物中，混匀。 [0072] 由此，能够高效地制备本发明所述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，且成本低，能有效用于粪便样本中核酸的纯化。 [0073] 本发明还提供了上述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液在人粪便中脱落细胞核酸提取中的应用。根据本发明的优选实施例，利用本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，能够有效地对人粪便样本脱落细胞核酸进行提取，且得率高，重复性好，结合磁珠法的特点，为其高通量提取提供了可能性。 [0074] 本发明还提供了一种使用上述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液从人粪便中提取脱落细胞核酸的方法，包括以下步骤： [0075] (A)将人粪便和粪便前处理液混合振荡，离心取上清液；和 [0076] (B)在所述上清液中加入所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液和蛋白酶K，混匀后加热裂解，从而得到细胞裂解液。 [0077] 在所述步骤(A)中，所述人粪便和所述粪便前处理液的体积比可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤(A)中，所述人粪便和所述粪便前处理液的体积比为1：5。 [0078] 在所述步骤(A)中，所述粪便前处理液可以是任何合适的粪便前处理液，较佳地，在所述步骤(A)中，所述粪便前处理液为含有20mM～100mM的NaCl、5％体积～10％体积的PVP和2％体积～5％体积的SDS以及pH5.5的150mM醋酸钠缓冲溶液。 [0079] 在所述步骤(A)中，所述离心可以采用任何合适的条件，较佳地，在所述步骤(A)中，所述离心采用5000g离心3min～5min，还可以将上清液再次离心取上清液，离心条件可以是8000g离心3min～5min。 [0080] 在所述步骤(B)中，所述上清液和所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液的体积比可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤(B)中，所述上清液和所述人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液等体积。 [0082] 所述的提取脱落细胞核酸的方法还可以包括其它任何合适的步骤，较佳地，所述的提取脱落细胞核酸的方法还包括以下步骤： [0083] (C)在所述细胞裂解液中加入结合液和磁珠，混匀后室温静置使所述磁珠吸附所述细胞裂解液中的核酸，然后置于磁力架上室温静置；和 [0084] (D)去除所述细胞裂解液，采用洗涤液洗涤所述磁珠，然后采用洗脱液将所述核酸从所述磁珠上洗脱下来。 [0085] 在所述步骤(C)中，所述结合液可以是任何合适的结合液，更佳地，在所述步骤(C)中，所述结合液为乙醇或异丙醇，例如终浓度为30％体积～60％体积的异丙醇。 [0086] 在所述步骤(C)中，所述混匀后室温静置的时间和所述置于磁力架上室温静置的时间可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤(C)中，所述混匀后室温静置的时间为5min～10min，所述置于磁力架上室温静置的时间为3min～5min。 [0087] 在所述步骤(D)中，所述洗涤液可以是任何合适的洗涤液，较佳地，在所述步骤(D)中，所述洗涤液包括洗涤液A、洗涤液B和洗涤液C，其中洗涤液A是含有2M～6M的盐酸胍和40％体积～60％体积的乙醇以及pH5.5的150mM醋酸钠缓冲溶液，洗涤液B是含有60％体积～80％体积的乙醇的pH7.0的20mMTris‑HCl缓冲溶液，洗涤液C是80％体积～100％体积的乙醇。 [0088] 在所述步骤(D)中，所述洗脱液可以是任何合适的洗脱液，较佳地，在所述步骤(D)中，所述洗脱液是含有2mM～50mM EDTA的pH8.5的10mM～100mM Tris溶液。 [0089] 更具体地，本发明的使用上述的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液从人粪便中提取脱落细胞核酸的方法包括以下步骤： [0090] 1.粪便前处理制备澄清上清液 [0091] (1)将人粪便与粪便前处理液(20mM～100mM NaCl、5％～10％(v/v)PVP、2％～5％(v/v)SDS、pH5.5的150mM醋酸钠缓冲溶液)按照1:5加样比例混合振荡，5000g离心3min～5min； [0092] (2)收集离心所得上清液，8000g再次离心3min～5min，收集上清； [0093] 2.人脱落细胞裂解及核酸结合 [0094] (1)取1.5mL上清液加入等体积的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，加入100ul蛋白酶K，混匀后，70℃加热裂解10min～20min； [0095] (2)加入1.5mL的结合液，再加入50ul磁珠，混匀后，室温结合5min～10min，期间上下颠倒离心管数次，让磁珠分散开，充分吸附核酸； [0096] (3)把含有裂解物的离心管放于磁力架上，静置3min～5min左右； [0097] 3.核酸的洗涤及洗脱 [0098] (1)去除上清液，加入1mL洗涤液A(2M～6M盐酸胍、40％(v/v)～60％(v/v)乙醇、pH5.5的150mM醋酸钠缓冲溶液)，充分振荡混匀后，把所有液体转移到1.5ml离心管中，再次混匀，短暂离心后，放于磁力架上，吸磁约40sec，移除废液； [0099] (2)加入1mL洗涤液B(60％(v/v)～80％(v/v)乙醇、pH7.0的20mMTris‑HCl的缓冲溶液)，充分振荡混匀，短暂离心后，放于磁力架上，吸磁约40sec，移除废液； [0100] (3)加入1mL洗涤液C(80％(v/v)～100％(v/v)乙醇)，充分振荡混匀，短暂离心后，放于磁力架上，吸磁约40sec，移除废液； [0101] (4)待磁珠表面液体挥发干净后，加入洗脱液(pH8.5 10mM～100mM Tris、2mM～50mM EDTA)，56℃洗脱5min～10min。 [0102] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。其中： [0103] 磁珠、蛋白酶K来自常规市售，其它常规试剂均购自Sigma公司，例如盐酸胍(购自Sigma公司)、Brij‑35(购自Sigma公司) [0104] 荧光定量PCR仪(ABI7500) [0105] 分光光度计(Q3000) [0106] 粪便核酸提取过程： [0107] 1.粪便前处理制备澄清上清液 [0108] (1)将1g粪便与70万左右肠癌colo205细胞(模拟结直肠癌临床粪便样本)加入到5mL粪便前处理液(100mMNaCl、5％PVP、2％SDS、pH5.5的150mM醋酸钠缓冲溶液)中，混合振荡，5000g离心3min； [0109] (2)收集离心所得上清液，8000g再次离心3min，收集上清； [0110] 2.人脱落细胞裂解及核酸结合 [0111] (1)取1.5mL上清液加入等体积的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液，加入100ul蛋白酶K，混匀后，70℃加热裂解10min； [0112] (2)加入1.5mL的结合液异丙醇，再加入50ul磁珠，混匀后，室温结合5min，期间上下颠倒离心管数次，让磁珠分散开，充分吸附核酸； [0113] (3)把含有裂解物的离心管放于磁力架上，静置3min左右； [0114] 3.核酸的洗涤及洗脱 [0115] (1)去除上清液，加入1mL洗涤液A(6M盐酸胍、40％乙醇、pH5.5的150mM醋酸钠缓冲溶液)，充分振荡混匀后，把所有液体转移到1.5ml离心管中，再次混匀，短暂离心后，放于磁力架上，吸磁约40sec，移除废液； [0116] (2)加入1mL洗涤液B(80％乙醇、pH7.0的20mMTris‑HCl的缓冲溶液)，充分振荡混匀，短暂离心后，放于磁力架上，吸磁约40sec，移除废液； [0117] (3)加入1mL洗涤液C(80％乙醇)，充分振荡混匀，短暂离心后，放于磁力架上，吸磁约40sec，移除废液； [0118] (4)待磁珠表面液体挥发干净后，加入洗脱液(pH8.5 10mM Tris、2mMEDTA)，56℃洗脱5min。 [0119] 实施例1比较裂解液中不同胍盐对人粪便中脱落细胞核酸提取效果 [0120] 将不同的离液剂胍盐(盐酸胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍)按常规用量添加到含有一定浓度的金属离子螯合剂20mM乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl缓冲溶液中，并设置空白对照(没有胍盐的含有20mM乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl缓冲溶液)，形成不同组成的核酸提取裂解液，按照粪便核酸提取过程进行操作提取DNA，每组实验平行处理3个样本，然后在含有针对人珠蛋白(β‑globin)相关基因设计的引物探针的扩增体系中进行荧光定量PCR检测。所述的引物序列为：上游引物F‑GTGCTCGGTGCCTTTAGTGA；下游引物R‑CCATAGACTCACCCTGAAGTTCTC。所述的探针序列为：P‑CCTGGCTCACCTGGACAACCTCA。扩增程序为：95℃10min1个循环；95℃15sec，60℃31sec(采集荧光)，45个循环。另外，将提取的DNA在分光光度计Q3000上，进行DNA浓度和纯度的检测，实验数据为三个平行处理的均值。具体的实验组合和结果如下： [0121] 表1比较裂解液中不同胍盐对人粪便中脱落细胞的裂解效果 [0122] [0123] 表2比较裂解液中不同胍盐提取核酸的纯度及浓度 [0124] [0125] 从表1可以看出，裂解液中不同胍盐对人粪便中脱落细胞均有显著的裂解效果，但是不同胍盐对人粪便中脱落细胞的裂解效果不一样，其中组2的Ct值最小，表明其提取的核酸得率最高，从表2中也可以看出组2提取的DNA纯度也是表现最好的，优选组2。 [0126] 实施例2比较不同浓度的异硫氰酸胍在裂解液中对粪便中人脱落细胞核酸提取效果 [0127] 为进一步筛选出更为合适的异硫氰酸胍浓度，按表3进行了不同浓度异硫氰酸胍的配制，所有组分都添加在20mM的金属离子螯合剂乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl缓冲溶液中。其余步骤参照实施例1。 [0128] 表3比较不同浓度的异硫氰酸胍在裂解液中对人粪便中脱落细胞核酸提取效果[0129] [0130] 上述结果表明，增加异硫氰酸胍对核酸提取的得率都有提高作用，异硫氰酸胍在1M～6M浓度范围内均能有效的提高粪便中人脱落细胞核酸提取效果，其中5M异硫氰酸胍在 20mM乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl缓冲溶液中分组表现最好。 [0131] 实施例3比较不同非离子型去污剂对粪便中人脱落细胞核酸提取效果[0132] 为了进一步探索不同非离子去污剂对粪便中核酸提取的作用，本实施例在实施例2的基础配方(5M异硫氰酸胍、20mM乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl)之上添加不同的非离子型去污剂，形成不同分组如下表4，参照实施例1的步骤进行相关实验。 [0133] 表4比较不同非离子型去污剂在裂解液中对粪便中人脱落细胞核酸提取效果[0134] [0135] 从表4可以看出，根据组1～组6的实验数据，裂解液中单个非离子型去污剂在核酸得率和纯度方面都有一定的提高，组7～组10是不同非离子型去污剂组合，其对人粪便中脱落细胞的裂解效果不一样，组10的核酸得率和浓度都没有单个4％Brij‑3去污剂的效果好；组8相对单个去污剂效果差异不大；组7、组9的组合则不论是从Ct值还是核酸的纯度和浓度上看，都有协同叠加作用，表现显著优于其它组，尤其是组7。 [0136] 实施例4裂解液中不同浓度的Triton‑100效果对比 [0137] 根据实施例3，为了更好地筛选出裂解液中表面活性剂Triton‑100的最优浓度比例，本实施例在基础配方(5M异硫氰酸胍、20mM乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl)之上，对比了不同浓度Triton‑100在裂解液中的作用，具体步骤参照实施例1，具体结果如下： [0138] 表5比较裂解液中不同浓度的Triton‑100效果 [0139] [0140] 不同浓度梯度的Triton‑100对比后，发现1％～20％的Triton‑100均能对粪便中核酸进行较好的提取，其中高浓度的Triton‑100可能会加大液体的粘稠性，影响磁珠吸附核酸，但是较高浓度的Triton‑100(20％)会对核酸提取的纯度有一定的作用如组6。稍高浓度(5％～10％)的Triton‑100，提取的总核酸量相对于其它组要高一些，但是结合扩增结果Ct值分析，其提取的较多为微生物的核酸，并不是所需要的靶核酸。从靶核酸的得率和纯度来考虑优选组3，含2％Triton‑100的裂解液组合。 [0141] 实施例5优选裂解液中不同浓度的Brij‑35优化效果对比 [0142] 为对比不同浓度的非离子型去污剂Brij‑35的协同叠加效果，在裂解中的作用，本实施例结合实施例4和实施例3，在基础配方(5M异硫氰酸胍、20mM乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl)+2％Triton‑100的基础上，添加配制不同浓度Brij‑35的分组组合，探究其不同组合效果，具体如下： [0143] 表6比较裂解液中不同浓度的Brij‑35效果 [0144] [0145] 添加不同浓度的Brij‑35对比后，发现1％～10％的Brij‑35均能增加对粪便中核酸提取的协同作用，其中组合3含3％的Brij‑35裂解液组合核酸的得率最好，优选组3。 [0146] 实施例6不同浓度金属离子螯合剂和不同pH的缓冲液效果对比 [0147] 为筛选更佳浓度的金属离子螯合剂乙二酸四乙酸二钠以及更好的pH缓冲体系，本实施例在上述筛选的基础配方二(5M异硫氰酸胍+2％Triton‑100+3％Brij‑35)上进行了不同浓度的乙二酸四乙酸二钠及不同pH的100mMTris‑HCl进行组合，具体过程参照实施例1。结果如下： [0148] 表7比较不同浓度金属离子螯合剂和不同pH的缓冲液效果 [0149] [0150] 本实施例结果显示，三个分组的效果差异不大，从而表明1mM～20mM的乙二酸四乙酸二钠在pH7.5～8.0的100mMTris‑HCl缓冲液中均能较好地提取粪便中人脱落细胞的核酸。结合之前实施例结果，优选组3。 [0151] 实施例7优选裂解液组合和市场商业化试剂盒对照 [0152] 鉴于市场上处理粪便样本的常用试剂盒为处理200mg粪便样本的QIAampDNA Stool Mini Kit(离心柱法)，本实施例使用上述优选实施例裂解液组合5M异硫氰酸胍+2％Triton‑100+3％Brij‑35+20mM乙二酸四乙酸二钠和pH8.0的100mMTris‑HCl，选用结直肠癌病人的粪便200mg作为样本，配合上述粪便核酸提取过程进行粪便中人脱落细胞核酸的提取，然后对提取的对人粪便脱落细胞的核酸的人珠蛋白基因(β‑globin)进行扩增，与Qiagen的粪便核酸处理试剂盒进行对比，QIAamp DNA Stool Mini Kit具体步骤参照针对其试剂盒说明书。结果如下： [0153] 表8优选裂解液组合和市场商业化试剂盒对照 [0154] [0155] [0156] 从表8可以看出，对于处理200mg的人粪便样本，对比两组数据发现，优选的粪便核酸提取裂解液提取200mg粪便样本可以有较高的核酸得率，对于提取纯度由于QIAamp DNA Stool Mini Kit使用的是离心柱法提取，相对有更高的提取纯度，而优选的粪便核酸提取裂解液组合其后续提取方法为磁珠法，纯度Abs260/Abs280比值多分布在1.7～1.8之间，相对较低，但根据实验数据，上述纯度可以满足后续实验要求。本发明有助于利用磁珠法开展粪便样本的核酸提取，并解决因前期处理样本的纯度、得率不高从而增加样本量，增加整个处理过程各类化学试剂，包括酚氯仿等有毒试剂的用量。 [0157] 此外，从处理10个样本的操作过程上，Qiagen的试剂盒需要多次离心，操作繁琐，总耗时约90min，而本发明后续采用磁珠法，只需要两次前处理离心，整个操作可控制在50min左右，提取时间也明显缩短。相对于市场上的提取试剂盒，本发明优选的粪便核酸提取裂解液性能表现更加优越，且使用成本低，不使用酚氯仿等有毒试剂，处理步骤简便，耗时短，便于推广使用。 [0158] 因此，根据本发明的优选实施例，采用上述粪便样本核酸提取步骤，能有效地纯化，富集人粪便中脱落细胞中的核酸，以便用于肿瘤诊断检测相关领域。此外，根据本发明的优选实施例的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液及所述的粪便样本核酸提取步骤具有下列优点的至少之一： [0159] (1)使用本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液提取粪便样本核酸，不需要使用酚、氯仿等有毒的有机试剂抽提，也省去了已有技术中的离心，沉淀等耗时步骤，而且成本低，适于高通量核酸提取。 [0160] (2)本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液中的金属离子螯合剂能有效抑制粪便样本中大量消化酶对DNA的降解作用，相关的胍盐和非离子型去污剂可以有效去除杂质，更高效地纯化核酸。并且实现用较少粪便样本量提取，满足后续核酸扩增用量的需求。 [0161] 从而，本发明通过裂解液配方的优化，可实现利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸，减少样本处理所需的各类有毒试剂，满足后续核酸检测用量。同时，本发明操作简单，成本低，便于实施高通量自动化操作。 [0162] 综上，本发明的人粪便中脱落细胞核酸提取裂解液能够快速高效裂解细胞，充分释放核酸，使得利用少量粪便样本获得较高纯度和得率的核酸成为可能，满足后续核酸检测用量，设计巧妙，配制简便，成本低，还能够减少样本处理所需的各类有毒试剂，安全环保，适于大规模推广应用。 [0163] 由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。 [0164] |
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